检索结果-内蒙古大学图书馆

作者： KOMI KOUKOURA Komi 浙江大学

学位级别：博士

背景(background)：钩端螺旋体(简称钩体)分为致病性钩体和非致病性钩体两大类，前者引起人或动物疾病，后者属于非致病腐生性原核细胞型微生物。目前发现，致病性钩体可分为7个基因种，其中问号钩体基因种(Leptospirainterrogans)流行... 详细信息

背景(background)：钩端螺旋体(简称钩体)分为致病性钩体和非致病性钩体两大类，前者引起人或动物疾病，后者属于非致病腐生性原核细胞型微生物。目前发现，致病性钩体可分为7个基因种，其中问号钩体基因种(Leptospirainterrogans)流行最为广泛，如黄疸出血群、波摩那群、秋季群等;其次为波帕特森基因种(Leptospiraborgpetersenii)，如流感伤寒群。由致病性钩体感染引起的钩体病是全球流行的人畜共患传染病，中国及东南亚地区是钩体病流行的主要疫区，其次是巴西等南美地区国家。人类感染致病性钩体后，首先出现中毒性败血症症状，如高热、头痛、肌痛等;然后因钩体侵入肺、肝、肾等脏器及中枢神经系统，出现出血、黄疸及呼吸或肾功能衰竭症状，因主要受损脏器不同，临床上可分为六型，其中肺弥漫性出血(pulmonarydiffusehemorrhage，PHD)型钩体病死亡率高达50％～75％。以往生物学实验证明，致病性钩体不产生任何典型的外毒素，业已公布的2株致病性钩体全基因组序列中，也未发现有任何编码经典外毒素基因。致病性钩体脂多糖(LPS)的内毒素毒性仅为大肠杆菌LPS的1/10～1/100。尽管有文献报道，致病性钩体编码溶血素基因明显多于非致病性钩体，但仅凭溶血素难以解释致病性钩体强大的致病能力。因此，致病性钩体毒力因子及其致病机制至今所知甚少。　　近年发现，不少细菌具有毒素-抗毒素系统，该系统通常由一个操纵子中的两个基因编码，其中一个基因编码有毒性的核酸酶，另一个基因编码抗毒蛋白，抗毒蛋白能与核酸酶结合，使核酸酶失去毒性。目前认为，细菌毒素-抗毒素系统主要在营养缺乏等不利环境条件下，发挥利它性自杀功能，从而确保物种生存与延续。但最近有文献报道，大肠杆菌毒素-抗毒素系统可能在细菌致病过程中发挥作用。流行最广的问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组中，存在chpIK和mazEF两个操纵子，其表达产物可分别组成ChpI/ChpK和MazE/MazF两个毒素-抗毒素系统。然而，至今未见致病性钩体ChpI/ChpK和MazE/MazF毒素-抗毒素系统及其致病性的研究报道。　　目的(aim)：了解问号钩体黄疸出血群赖型赖株ChpI/ChpK和MazE/MazF两个毒素-抗毒素系统中的毒性蛋白ChpK和MazF的功能及其对人单核巨噬细胞株(THP-1)细胞和人肾小管上皮细胞(HEK293)的毒性作用。　　方法(methods)：以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板，采用PCR扩增全长chpI、mazE基因及chpIK和mazEF操纵子片段，采用pET42a为表达载体、EcoliBL21DE3为表达宿主菌，分别构建上述基因及操纵子原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rChpI、rChpK和rMazE、rMazF表达情况及表达量，Ni-NTA亲和层析法提纯rChpI、rChpK和rMazE、rMazF。通过水解问号钩体赖株及THP-1细胞的基因组DNA和总RNA实验，了解rChpI、rChpK和rMazE、rMazF有无核酸酶活性。采用实时荧光定量RT-PCR，检测问号钩体赖株感染THP-1细胞前后chpI、chpK和mazE、mazF基因表达水平变化。采用WesternBlot法，检测问号钩体赖株感染THP-1细胞前后ChpI、ChpK和MazE、MazF表达及外分泌情况。采用免疫荧光标记及激光共聚焦显微镜，检测问号钩体赖株ChpI、ChpK和MazE、MazF在THP-1细胞内表达与外分泌情况。分别构建chpI、chpK和mazE、mazF基因真核表达载体并转染HEK-293细胞，采用CCK-8试剂检测ChpI、ChpK和MazE、MazF对细胞活性的影响。　　结果(results)：所克隆的chpI、mazE基因及chpIK和mazEF操纵子核苷酸序列与文献报道完全相同。所构建的原核表达系统能分别表达rChpI、rMazE以及rChpI/rChpK、rMazE/rMazF蛋白。利用设置在chpI、chpK和mazE、mazF基因片段3’端6×His标签，不仅高效地提纯了rChpI、rMazE，同时也从rChpI与rChpK、rMazE与rMazF混合表达产物中提纯了毒性蛋白rChpK和rMazF，解决了因rChpK和rMazF毒性而不能在大肠杆菌中表达的难题。rMazF可水解RNA，但不水解DNA;rChpK既不水解RNA，也不水解DNA。实时荧光定量PCR结果显示，问号钩体赖株感染THP-1细胞后，chpI、chpK、mazE、mazFmRNAs水平显著升高。WesternBlot结果显示，问号钩体赖株感染THP-1细胞后，ChpI、ChpK、Ma

关键词：钩端螺旋体毒素-抗毒素系统毒性蛋白核酸酶细胞毒性

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持留菌产生及耐药分子机制的研究进展

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现代预防医学 2017年第22期44卷 4171-4174+4198页

作者：雍江堰李燕成都中医药大学医学技术学院

持留菌或持留细胞(Persister)是指微生物在受到有效抗菌药物作用时,绝大部分微生物很快死亡,同时残留了一小部分代谢活动低下、具有同基因型多药物耐受(Multidrug Tolerance,MDT)特性的微生物亚群(sub-population)。持留菌与耐药菌(resi... 详细信息

持留菌或持留细胞(Persister)是指微生物在受到有效抗菌药物作用时,绝大部分微生物很快死亡,同时残留了一小部分代谢活动低下、具有同基因型多药物耐受(Multidrug Tolerance,MDT)特性的微生物亚群(sub-population)。持留菌与耐药菌(resistant mutant)是不同的概念,持留菌是表型变异株(Phenotypic Heterogeneity),其基因序列没有发生突变,最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)不会增大,但持留菌的存在却是慢性感染性疾病反复发作、迁延不愈的主要原因。国外已经开展了大量实验来研究持留菌产生及其抗生素耐药的机制,本文将对持留菌的生物学特性、产生机制、耐药机制和有效的抗菌策略等内容进行综述。

关键词：持留菌毒素-抗毒素系统代谢状态生物膜抗菌策略

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益生菌对耐万古霉素粪肠球菌V583杀伤效率及其分子作用机制

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中华医院感染学杂志 2022年第24期32卷 3697-3701页

作者：陈楠滑明溪岳靖林陈晨朱鏐娈北京大学地坛医院教学医院北京100015 首都医科大学附属北京世纪坛医院北京100038

目的明确常见益生菌(屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌)对V583杀伤作用的最适条件及分子机制。方法利用细菌共培养技术,筛选对V583具有明显杀伤作用的益生菌;按照倍比稀释的方法,比较6~24 h内V583杀伤效率;通过基因组学... 详细信息

目的明确常见益生菌(屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌)对V583杀伤作用的最适条件及分子机制。方法利用细菌共培养技术,筛选对V583具有明显杀伤作用的益生菌;按照倍比稀释的方法,比较6~24 h内V583杀伤效率;通过基因组学比较的方式,明确不同杀伤效率的细菌基因组学差异,发现与V583杀伤密切相关的潜在分子机制。结果粪肠球菌对V583具有最佳杀伤作用;粪肠球菌与V583等量时可在6 h内,有效杀伤70%以上;比较基因组学研究表明:粪肠球菌的溶血素基因以及毒素-抗毒素系统(TA系统)与杀伤密切相关,可能发挥着关键作用。结论本研究通过比较不同益生菌对粪肠球菌V583的杀伤开展研究,发现了对V583发挥杀伤作用的最小菌量及可能的分子机制,对V583临床防治过程中益生菌的开发,有重要的指导作用。

关键词：益生菌粪肠球菌V583 溶血素基因毒素-抗毒素系统

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集胞藻PCC6803染色体上relNEs(ssr1114/slr0664)TA系统的反馈调控作用

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江苏农业科学 2014年第9期42卷 40-42页

作者：孙亮华刘帅兵赵卫飞刘朝莹江苏大学环境与安全工程学院江苏镇江212013

细菌染色体上的毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统通过转录水平和转录后水平调控毒素活性,从而控制细胞的生长速度和死亡,使细菌适应各种环境胁迫。为了证明集胞藻PCC 6803染色体上relNEs TA系统的转录调控,构建了以无启动子的β-半... 详细信息

细菌染色体上的毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统通过转录水平和转录后水平调控毒素活性,从而控制细胞的生长速度和死亡,使细菌适应各种环境胁迫。为了证明集胞藻PCC 6803染色体上relNEs TA系统的转录调控,构建了以无启动子的β-半乳糖苷酶(lacZ)基因为报告基因的重组质粒,并测定含转录融合重组质粒的大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果表明,抗毒素RelN能显著抑制relNEs启动子的转录活性,而毒素RelEs能部分减弱这种抑制作用,提示relNEs系统的编码产物对该操纵子具有反馈调控作用。

关键词：集胞藻染色体毒素-抗毒素系统 relNEs 转录调控转录融合重组质粒 β-半乳糖苷酶活性

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苏云金芽胞杆菌II型TA系统mazE/mazF在Bt侵染宿主过程的功能和机制研究

苏云金芽胞杆菌II型TA系统mazE/mazF在Bt侵染宿主过程的功能和机...

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作者：李俐煦华中农业大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性菌，能够产生多种毒素以及致病因子，目前对Bt毒杀宿主的研究主要集中在主效毒素因子即杀虫晶体蛋白(InsecticidalCrystalProteins,Cry)。有研究表明单独... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性菌，能够产生多种毒素以及致病因子，目前对Bt毒杀宿主的研究主要集中在主效毒素因子即杀虫晶体蛋白(InsecticidalCrystalProteins,Cry)。有研究表明单独的Cry蛋白的杀虫活性低于Bt菌体和Cry蛋白的协同作用，因而Bt菌体在Bt毒杀宿主过程中的作用不可忽视。前期利用对昆虫高毒力的Bt菌株YBT-1520侵染家蚕，通过RNAseq测序获得侵染各个侵染阶段中Bt的转录组数据，从中发现一对II型毒素抗毒素系统（TA系统）mazE/mazF迅速被激活，显示mazE/mazF可能参与了Bt与家蚕的互作。而目前对于mazE/mazF的研究主要集中在压力条件下如何被激活以及怎样帮助菌体度过不利环境;在病原菌和宿主互作方面仅发现mazE/mazF能够影响沙门氏杆菌等人类病原菌侵染小鼠的细胞和组织。而mazE/mazF如何调控病原菌适应宿主环境、完成定植并调控毒力方面的调控机理尚不清楚。本课题将研究Bt的mazE/mazF在Bt感染宿主过程中的作用和机制。　　***型TA系统mazE/mazF在Bt侵染秀丽隐杆线虫时被激活　　本研究发现mazE/mazF在Bt侵染秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)初期的转录水平迅速提高至少4倍，随着侵染时期的推进mazE/mazF的转录保持高水平，表明其表达被激活并参与了Bt与线虫的互作。　　***型TA系统mazE/mazF能够增强Bt在线虫体内的定植能力和毒力　　构建了Bt无晶体突变株BMB171的mazE/mazF缺失突变株和回复突变株，通过其与Cry蛋白复配使用对秀丽隐杆线虫以及家蚕生物活性测定，发现缺失突变株相对于野生型对秀丽隐杆线虫和家蚕的毒性分别下降80%和50%，而且突变株在线虫体内定植能力相对于野生型和回复突变株下降了80%，说明II性TA系统mazE/mazF的缺失影响了Bt在秀丽隐杆线虫体内的定植能力，同时影响Bt对宿主毒力。　　***型TA系统mazE/mazF能够促进芽胞皮层水解酶基因转录，提高Bt芽胞萌发率　　mazE/mazF的缺失降低Bt芽胞萌发率。本研究将野生型、突变株和回复突变株的芽胞与杀线虫晶体蛋白Cry5Ba复配作用秀丽隐杆线虫，测定Bt芽胞在线虫完成萌发到形成细菌袋的时间，发现突变株芽胞完成萌发以及杀死线虫到形成细菌带的时间延长9h，而且在体外条件和模拟体内萌发条件下突变株芽胞萌发能力相对于野生型和回复突变株菌下降约20%和10%。　　mazE/mazF的缺失导致芽胞萌发相关的芽胞皮层水解酶基因的转录水平下降，且该基因的缺失会导致芽胞萌发率下降。为了进一步研究mazE/mazF调控芽胞萌发的机制，通过qRT-PCR检测了与芽胞萌发相关的基因，例如芽胞萌发受体基因(BMB171_20920,BMB171_23575,BMB171_23910)，芽胞皮层水解酶基因(BMB171_RS13555)等在野生型和突变株侵染线虫过程中的转录水平，发现芽胞皮层水解酶(BMB171_RS13555)在突变株侵染线虫过程的转录水平下降。接着在BMB171中构建芽胞皮层溶解酶的缺失突变体，发现突变体芽胞在体外萌发和模拟体内萌发条件下萌发率相对于野生型下降约40%。　　II型TA系统mazE/mazF发挥调控靶标功能的是MazF蛋白，MazF的化学本质是核酸内切酶，对下游直接作用靶标起到负调控作用。若mazE/mazF对芽胞萌发相关蛋白是直接调控作用，那么当mazE/mazF缺失后，理应促进芽胞萌发，而不是抑制芽胞萌发。推测MazF通过抑制负调控因子，促进芽胞皮层水解酶的转录，从而提高芽胞的萌发率。　　***作用的靶标分析　　生物信息学分析显示，BMB171的MazF(MazF-bmb171)与枯草芽胞杆菌中MazF(MazF-bs)有同源性。因此以MazF-bs的切割位点-UACAU-为预测依据，预测了MazF-bmb171的靶标并根据功能进行分类，主要涉及芽胞萌发相关基因，免疫逃逸，转录调控因子类，生长必需基因。在转录调控因子靶标中，Mur/RpiR家族转录调控因子能够抑制N-乙酰胞壁酸的降解从而抑制芽胞水解酶的表达。因此MazF可能通过调控Mur/RpiR家族转录调控因子影响芽胞萌发。　　结合以上数据和结果，可大致描绘Bt的II型TA系统mazE/mazF在感染宿主中的作用方式，当Bt进入宿主体内后MazF抑制Mur/RpiR家族转录调控因子，进而激活芽胞皮层水解酶，促进芽胞萌发，使Bt由休眠状态进入营养生长时期，促进Bt在宿主体内的定植，完成对宿主的侵染。通过对mazE/mazF在病原菌侵染宿主时的功能和调控机制的研究能更深入

关键词：苏云金芽胞杆菌毒素-抗毒素系统秀丽隐杆线虫芽胞皮层溶解酶芽胞萌发

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植物内生细菌不动杆菌属噬菌体资源筛查及CRISPR护卫元件CreTA机制解析

植物内生细菌不动杆菌属噬菌体资源筛查及CRISPR护卫元件CreTA机...

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作者：王凌云山东农业大学

学位级别：硕士

植物内生细菌是一类定殖于植物细胞体内与植物建立和谐、稳定关系的微生物。具有直接或间接促进植物生长的促生作用、在非豆科植物中的内生固氮作用以及降解土壤内肥料和重金属污染的生物修复作用等方面发挥功能,是一类重要的生物防治... 详细信息

植物内生细菌是一类定殖于植物细胞体内与植物建立和谐、稳定关系的微生物。具有直接或间接促进植物生长的促生作用、在非豆科植物中的内生固氮作用以及降解土壤内肥料和重金属污染的生物修复作用等方面发挥功能,是一类重要的生物防治资源。不动杆菌属(Acinetobacter)属于γ变形菌纲莫拉菌科,已有许多报道其作为一类植物内生细菌与植物存在互作关系。噬菌体作为由蛋白质衣壳和包裹其中的核酸组成的结构简单的微生物病毒,广泛存在于自然界中,是地球上最多的生物实体,并以溶原性噬菌体和烈性噬菌体两种形式存在,分别对应其溶原和裂解两种生命周期存在。伴随着化学农药以及抗生素的使用,细菌耐药性问题日趋严重,噬菌体作为具备特异性的细菌病毒重回人们视野当中。CRISPR/Cas系统作为广泛存在于原核生物中的适应性免疫系统,为细菌提供记忆性免疫。近年来,有团队报道在CIRPSR/Cas系统中存在一类全新的毒素-抗毒素系统——CreTA,具有护卫CIRPSR/Cas系统的功能。由此,我们利用实验室现有不动杆菌资源,绘制不动杆菌原噬菌体裂解谱;同时,对存在于不动杆菌I-F型CRISPR系统中的CreT177毒素机理及CreTA抑制机制展开分析,希望能为生物防治资源开发提供新思路。主要实验结论如下:(1)对供试23株不动杆菌属菌株通过丝裂霉素C诱导原噬菌体释放,以双层平板法观察原噬菌体对各个宿主菌的侵染能力,绘制原噬菌体裂解谱,供试23株菌株中共有18株菌株诱导出的原噬菌体具备侵染其他宿主菌的能力。(2)基于在线原噬菌体预测网站Prophage Hunter预测结果,设计特异性引物检测噬菌斑所对应的原噬菌体预测序列,检测出由5株不动杆菌菌株诱导出的共11株原噬菌体。(3)对发现于不动杆菌I-F型CRISPR系统中的CreTA序列,通过构建诱导表达质粒诱导CreT177毒素表达,验证了CreT177毒素对不动杆菌和大肠杆菌的毒性;进一步通过诱导点板实验推断其为杀菌毒素;后续对毒素序列引入单碱基突变和同义突变,验证CreT177为蛋白毒素。(4)将CreTA序列中的CreT177毒素替换为gfp报告基因,验证了Cre A序列的存在会抑制CreT的表达。将CreTA电转至不同cas基因突变体菌株中,推测cas6蛋白参与Cre A对CreT的抑制。最后,对CreT Target序列和Cre A Spacer引入突变,验证Cre A Spacer通过部分匹配CreT Target完成对CreT的抑制。综上所述,本研究通过绘制原噬菌体裂解谱,为基于噬菌体的不动杆菌改造奠定基础;同时通过阐述CreT177毒素机理和CreTA抑制机制,为新型毒素-抗毒素系统的应用提供参考。

关键词：植物内生细菌不动杆菌属噬菌体 CIRPSR/Cas 毒素-抗毒素系统

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益生大肠杆菌hipAB基因解析及Elafin蛋白的表达

益生大肠杆菌hipAB基因解析及Elafin蛋白的表达

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作者：徐君浙江工商大学

学位级别：硕士

大肠杆菌Nissle 1917(*** Nissle 1917,EcN)作为一种食品益生菌及安全载体,在治疗胃肠道疾病方面有重要活性或应用前景。细菌的毒素与抗毒系统介导与定殖能力相关的细菌生物膜与持留的形成。Elafin是一种丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂,对于IB... 详细信息

大肠杆菌Nissle 1917(*** Nissle 1917,EcN)作为一种食品益生菌及安全载体,在治疗胃肠道疾病方面有重要活性或应用前景。细菌的毒素与抗毒系统介导与定殖能力相关的细菌生物膜与持留的形成。Elafin是一种丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂,对于IBD炎症具有显著的缓解效果。本文拟以EcN为表达载体,通过对其毒素抗毒素基因hipAB的鉴定及功能研究,构建基于hipAB的表达盒,用于Elafin的表达。生物信息学分析表明EcN基因组毒素-抗毒素系统多为Type II型,我们选择其中一对假定hipAB毒素与抗毒素进行注释。hip A基因大小约为1200 bp,hip B基因大小为240bp;且hip B基因序列位于hip A上游,在一个启动子下共转录,属于典型的双顺反子基因结构。hipAB在*** BL21克隆表达试验(生长曲线,平板点样生长,质粒稳定性)结果表明,基因结构及产物活性完全符合Type II型毒素与抗毒素特点。为进一步探索TASs对于EcN益生特性的调控机制,采用CRISPRi技术进行原位敲低hipAB试验,考察其对于EcN生物膜及持留的影响。RT-PCR检测结果表明hipAB的表达被成功抑制,且EcN的生物膜和持留形成能力都下降;同时在敲低hipAB的EcN中,我们也检测了与生物膜和持留形成相关其他基因的表达轮廓,并发现细胞SOS反应被诱导。在此基础上,我们又考察了hipAB启动子P用于外源基因的表达水平。以弹性蛋白酶抑制剂Elafin为目标蛋白,选择四种启动子P、P、P以及P构建表达质粒。PAGE结果显示除在P表达质粒外,其余三个启动子下都检测到了Elafin的表达。本文使用CRISPRi技术为研究EcN的TASs生理功能提供了一种十分有价值的工作思路,且结果显示hipAB调控EcN的生物膜和持留形成,对研究EcN在肠道中的存活和粘附能力具有重要的指导意义。另外尝试使用EcN作为Elafin表达载体,既希望达到Elafin抗炎效应,又能达到EcN益生效益,从启动子角度出发,其中发现hipAB毒素与抗毒组成型启动子P在指数期蛋白累积量达到最高,为Elafin在工业上的应用制备垫定基础。

关键词：大肠杆菌Nissle1917 毒素-抗毒素系统 hipAB CRISPRi Elafin

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结核分枝杆菌TA系统基因多态性与致病相关性研究

结核分枝杆菌TA系统基因多态性与致病相关性研究

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作者：肖彤洋中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

结核病是由结核分枝杆菌所引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病,其感染人体后,能在细胞内外自由存活,并且对所面临机体环境中的不利条件(如营养缺乏、乏氧、酸度、药物等压力因素),表现出一定的无应答性,从而造成潜伏性感染或持续... 详细信息

结核病是由结核分枝杆菌所引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病,其感染人体后,能在细胞内外自由存活,并且对所面临机体环境中的不利条件(如营养缺乏、乏氧、酸度、药物等压力因素),表现出一定的无应答性,从而造成潜伏性感染或持续性感染,该现象被称为细菌的持留,目前,全球大约有1/3的人口正受到潜伏期结核分枝杆菌的感染,而大部分新发现的活动性肺结核患者是由潜伏期结核分枝杆菌的活化所引起,虽然结核病的药物治疗方案在结核病的控制中起了很大作用,但其主要对活动性结核病有效,对潜伏期的感染作用不大,这也是结核病治疗周期长,难以根治的主要原因。最近的研究表明,结核分枝杆菌的持留与毒素-抗毒素系统有关。该系统广泛存在于原核生物中,由不稳定的抗毒素蛋白和稳定的毒素蛋白共同组成,在正常条件下,毒素蛋白和抗毒素蛋白共表达,使细菌能稳定生长,但压力条件下,抗毒素蛋白被某些蛋白酶降解,毒素蛋白得以释放,发挥抑制细菌生长的效应。结核分枝杆菌中存在多种毒素-抗毒素系统,主要包括VapBC、MazEF、RelBE、 HigAB、ParDE五大家族。本课题旨在研究毒素-抗毒素系统在结核分枝杆菌及其不同亚型菌株中的基因多态性,我们通过选取183株结核分枝杆菌临床菌株,经间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)方法进行基因分型,并且进行比例法药敏试验,同时对63对毒素-抗毒素系统基因进行PCR扩增及序列分析,利用I-Mutant2.0软件预测异义突变对蛋白结构和功能的影响。选取DDG预测值较大的突变位点所在基因,以大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261为载体,构建其野生型和突变型重组表达质粒,转化至无毒、操作安全的快速生长型耻垢分枝杆菌mc2155株,检测重组菌在热压力、盐压力和酸压力胁迫下的生存情况,进一步探索该系统基因在结核分枝杆菌致病性中的相关作用。基因分型结果表明：在183株菌株中,138株(75.41%)属北京家族,45株(24.59%)属非北京家族。基因测序结果表明：183株菌株中共有127个异义突变、4个移码突变,44个同义突变,其中100个突变仅发生在北京家族。还发现了32个基因间隔区突变位点,其中包括碱基缺失,多数突变发生在北京家族。对毒素-抗毒素系统基因与耐药表型之间的关系进行了探索,有6个突变可能与利福平耐药相关,有4个突变可能与链霉素耐药相关,1个突变可能与乙胺丁醇耐药相关,但未发现与异烟肼耐药相关的突变。成功构建了含目的基因vapC2、 vapBC2、vapC38、vapBC38、vapBC18和vapBC47的野生型和突变型重组耻垢分枝杆菌,正常生长条件下,对重组菌的生长曲线测定发现：重组菌间的增殖特性无明显差异,大约在12h进入对数生长期,48 h达平台期。这说明耻垢分枝杆菌在正常生长条件下较少受外源基因的影响：经热压力、酸压力、盐压力试验发现毒素蛋白vapC2和vapC38在环境压力下导致细菌生长减慢,抗毒素蛋白在一定程度上可缓解毒素蛋白的生长抑制作用,异义突变引起的氨基酸变化对蛋白的功能造成一定的影响。综上所述,结核分枝杆菌中的毒素-抗毒素系统具有一定的基因多态性,其中多数突变发生在北京家族,可能与结核分枝杆菌北京家族菌株能适应不同的宿主环境有关,某些毒素-抗毒素系统在应对环境变化时能调节细菌的生长。

关键词：结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统基因多态性基因分型持留克隆表达

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2型猪链球菌89K毒力岛上毒素——抗生素系统SezAT的发现与实验研究

2型猪链球菌89K毒力岛上毒素——抗生素系统SezAT的发现与实验研究

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作者：王敏第三军医大学

学位级别：硕士

2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype2，***2)是一种重要的人畜共患病病原体。***2感染不仅可致猪的急性关节炎、脑膜炎、败血症、心内膜炎及急性死亡，并且可通过呼吸道和伤口等途径传播，导致人类的感染发病和死亡。科学家在丹... 详细信息

2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype2，***2)是一种重要的人畜共患病病原体。***2感染不仅可致猪的急性关节炎、脑膜炎、败血症、心内膜炎及急性死亡，并且可通过呼吸道和伤口等途径传播，导致人类的感染发病和死亡。科学家在丹麦发现并首次报道人感染***2病例，随后在世界各地都有报道，但多为散发病例。然而，1998年和2005年我国江苏省和四川省分别暴发大规模***2感染猪和人类疫情，病人中出现高比例的、国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(streptococcal toxicshock syndrome，STSS)，临床症状表现为急性高热、休克、全身多器官衰竭，病程短而凶险，致死率高，引发严重的公共卫生事件。　　为了对造成这两次暴发感染事件的***2流行菌株的高致病性进行深入研究，我们课题组对1998年江苏分离的强致病株98HAH12和2005年四川分离的强致病株05ZYH33(两株均分离自STSS病人)进行了全基因组测序和功能注释，并与Sanger研究中心公布的标准株P1/7的全基因组序列进行比较，发现了我国分离的这两株测序菌株均含有一个89 kb大小的具有毒力岛(pathogenicity island，PAI)特征的大片断，我们将这个特异性的片段命名为89K PAI。随后对89K PAI行生物信息学分析，发现89K PAI编码多个可能与致病相关的成分和结构，如二元信号转导系统(two-component signaltransduction system，TCS)，Ⅳ型分泌样系统(typeⅣ-like secretion system，T4SS-like)以及一个Zeta毒素等。我们通过实验证实了这个二元信号转导系统SalK/SalR参与了细菌的致病过程，而Ⅳ型样分泌系统则参与了STSS的形成。　　近期研究表明该毒力岛可以从宿主菌染色体上自发切离下来，并在染色体上形成类似质粒的环化分子，该环化分子可作为底物通过Ⅳ型样分泌系统介导转移至不含89K毒力岛的***2受体菌中。我们试图通过各种诱导质粒消除的方法获得一株89K毒力岛缺失的***2突变株，但始终未能成功。我们推测毒力岛上存在一个参与稳定作用的结构。进一步生物信息学分析发现89K毒力岛有一个与Epsilon-zeta(ε-ζ)同源的Ⅱ型毒素-抗毒素(typeⅡ toxin-antitoxin)系统，我们将其命名为SezAT(Streptococcus suis epsilonzeta)系统，其中SezA为抗毒素蛋白，SezT为毒素蛋白。近期研究发现TA系统可在细菌的一些可移动遗传元件中发挥稳定作用。因此，高致病性***2的89K PAI编码的SezAT系统很可能参与到89K PAI的稳定机制当中。但生物信息学分析结果只能是提示，该TA系统是否具有生物学功能尚需实验验证。为此，本文旨在对89K PAI编码的SezAT系统行活性验证，并通过同源重组的方法对SezAT系统进行敲除，为下一步验证其功能和获得89K PAI缺失突变株奠定基础。具体实验内容和结果包括以下几个方面：　　 ***系统的生物信息学分析和RT-PCR验证：我们通过生物信息学分析发现，89K PAI的负链上05SSU0936(sezT)和05SSU0937(sezA)构成一对Ⅱ型TA系统并与Epsilon-zeta(ε-ζ)同源，且两ORF有一个碱基对的重叠，提示两ORF共转录。为证实两ORF共转录，抽提***2的总RNA行RT-PCR，结果证实两ORF共转录。　　 ***系统的活性分析：以05ZYH33基因组DNA为模板，分别扩增SezA和SezT编码基因的全长片段，分别插入双启动子表达质粒pJS298中，构建重组质粒pJS-AT。通过电转化的方法导入到大肠杆菌BL21(DE3)，分别用一定浓度的诱导剂IPTG(终浓度为1 mM)和L-阿拉伯糖(0.2%)诱导表达，同时设定不同时间点测定菌液的OD600值，绘制生长曲线。结果显示，单纯诱导表达毒素蛋白SezT可在短时间内迅速抑制细菌生长，而同时诱导表达抗毒素蛋白SezA可中和SezT的抑制作用，维持细菌正常生长。提示该SezAT系统构成一对有活性的TA系统。　　 ***系统基因敲除突变株的构建：以***05ZYH33的基因组DNA为模板，设计特异性引物，PCR分别扩增sezT单基因和sezAT的左右臂(上下游片段);同时以穿梭质粒pSET2的DNA为模板，PCR扩增壮观霉素抗性基因SpcR片段，分别将它们克隆到pUC18载体的多克隆位点上，构建成用于靶基因敲除的载体pUC：：SezT和pUC：：SezAT。分别将敲除载体电转化至0

关键词：毒素-抗毒素系统 2型猪链球菌高致病性毒力岛基因敲除

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集胞藻PCC6803染色体上relBE1位点TA系统的研究

集胞藻PCC6803染色体上relBE1位点TA系统的研究

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作者：周阳江苏科技大学

学位级别：硕士

毒素-抗毒素系统（Toxin-antitoxin，TAsystem）由编码毒素和抗毒素的基因构成。稳定的毒素蛋白具有不同的生化活性，通过作用于特定的靶标调控细胞重要的生理活动，可抑制细胞生长或导致细胞死亡；抗毒素可被依赖于ATP的蛋白酶降解，... 详细信息

毒素-抗毒素系统（Toxin-antitoxin，TAsystem）由编码毒素和抗毒素的基因构成。稳定的毒素蛋白具有不同的生化活性，通过作用于特定的靶标调控细胞重要的生理活动，可抑制细胞生长或导致细胞死亡；抗毒素可被依赖于ATP的蛋白酶降解，是不稳定的蛋白。抗毒素与毒素相互作用形成蛋白复合体拮抗毒素的细胞毒性作用。抗毒素或毒素-抗毒素复合体抗毒素N-末端的DNA结合结构域结合于TA系统启动子的调控序列，反馈调控TA系统的转录。现有的研究结果表明，一些细菌染色体上的TA系统与细胞适应性胁迫反应有关，可以使细菌适应不同的环境胁迫。集胞藻PCC6803染色体上存在存在至少31个属不同家族的TA系统，但这些系统的生理功能尚不清楚。通过对这些TA系统基因的生理、生化及遗传功能的研究，对揭示蓝细菌适应环境胁迫的分子机制具有重要的理论价值。本文对集胞藻PCC6803染色体上与relBE家族的TA系统relBE1进行了研究，研究内容包括：（1）以lacZ为报告基因构建了relBE1表达调控菌株，通过对重组菌株β-半乳糖苷酶表达活性分析，确定relBE1在转录水平上的反馈调控作用。通过诱导抗毒素和毒素蛋白的共表达，借助亲和捕捉技术纯化重组蛋白来分析relBE1系统在蛋白水平上的相互作用。（2）利用大肠杆菌选择性表达调控系统，研究来源于集胞藻PCC6803的蛋白酶Lons和ClpP2s/ClpXs对抗毒素蛋白RelB1和毒素蛋白RelE1的降解作用。（3）构建relBE1的缺失突变株并分析在胁迫条件下的突变株的表型，并通过互补实验确定该TA系统的生理功能；构建relBE1组分过表达调控突变株，分析过表达调控突变株在正常培养条件下和胁迫条件下的生长表型，确定其表达产物在细胞适应环境胁迫中的作用。（4）分析集胞藻relBE1转录调控突变株在正常生长条件和特异胁迫条件下的LacZ活性，确定在不同生长条件下，TA系统的转录调控及其编码产物的转录调控作用。通过上述研究得到研究结果与结论：（1）在异源宿主细胞大肠杆菌中，relB1表达产物可以正反馈调控其操纵子的转录，在转录水平上可实现自我调控，但与已报道的TA系统转录调控模式不同。蛋白水平上，抗毒素蛋白RelB1可以与毒素蛋白RelE1发生相互作用，形成复合体，抑制毒素蛋白的细胞毒性作用。（2）集胞藻依赖ATP的蛋白酶Lons和ClpP2s/Xs都能降解relBE1系统编码的抗毒素蛋白RelB1；Lons和ClpP2s/Xs的诱导表达可降解毒素-抗毒素复合体中的抗毒素蛋白、释放毒素蛋白，并能激活relBE1TA系统，使细胞生长受到抑制。（3）relBE1系统缺失突变导致集胞藻细胞在镉胁迫条件下细胞生长受到显著抑制，互补实验使缺失突变株在镉胁迫条件下的恢复生长表型；该系统组分过表达产物可提高集胞藻细胞对镉胁迫的耐受能力。表明relBE1系统参与蓝藻适应镉胁迫。（4）relBE1系统在自然宿主细胞中的转录调控作用与在大肠杆菌中的结果一致，即relE1的表达产物可以反馈激活其操纵子的转录，而且在胁迫条件下加强了这种激活作用；镉胁迫条件下relBE1系统转录水平升高。

关键词：毒素-抗毒素系统 relBE1 环境胁迫铜离子

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