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枯草芽孢杆菌表达调控系统的构建与应用

枯草芽孢杆菌表达调控系统的构建与应用

引用

作者：徐雅晴江南大学

学位级别：硕士

枯草芽孢杆菌是一种常见的革兰氏阳性菌模式生物,被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）确认为安全的菌（Generally recognized as safe,GRAS）。枯草芽孢杆菌因其生长速度快、蛋白分泌能力强等特点,被广泛应... 详细信息

枯草芽孢杆菌是一种常见的革兰氏阳性菌模式生物,被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）确认为安全的菌（Generally recognized as safe,GRAS）。枯草芽孢杆菌因其生长速度快、蛋白分泌能力强等特点,被广泛应用于工业酶制剂的制造、代谢产品的合成和基础研究中。但是目前枯草芽孢杆菌转录后调控工具缺乏,而且目的基因的表达大多依赖基于抗生素的表达系统,这严重制约了其在食品及医药领域的应用。本研究通过改造枯草芽孢杆菌I型毒素-抗毒素系统,成功构建了同时适用于枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的新型转录后调控系统;基于I型毒素-抗毒素系统bsrG/SR4成功构建了枯草芽孢杆菌无抗生素表达系统。主要研究结果如下:（1）基于bsrE/SR5的转录后调控系统的构建。通过SR5与SR4的序列进行比对分析,发现二者同时在核酸序列和二级结构上都有着很高的相似度,基于此成功构建了一套以I型毒素-抗毒素系统bsrE/SR5为基础的s RNA介导的转录后调控系统(Modulation via the small RNA（s RNA）‐dependent operation system,MS-DOS),基因的抑制效率可达到88.8%。通过对SR5进行了截短表达,结果表明SR5在仅保留终止子序列的情况下也能保持较高的抑制效率（83.8%）。（2）MS-DOS系统的优化与跨宿主应用。通过对OPR区域进行截短,实现了靶基因表达水平的梯度抑制（抑制效率0%—90%左右）。利用截短的OPR即可实现同时对不同基因实现不同强度的表达抑制的效果。接着成功将MS-DOS调控系统应用于大肠杆菌中。通过在大肠杆菌中异源表达枯草芽孢杆菌来源的RNase III,可显著提高MS-DOS系统的抑制效率。同时对OPR进行初步截短研究,同样实现了在大肠杆菌中对于靶基因的梯度抑制。（3）枯草芽孢杆菌无抗生素表达系统的构建与应用。在基因组上整合组成型启动子Pxpa C表达毒素Bsr G,并利用表达质粒组成型表达抗毒素SR4,只有当质粒稳定存在时,细胞才能正常生长;当质粒丢失时,毒素Bsr G形成筛选压力,影响细胞生长。将目的基因构建至表达质粒,即可实现目的基因的无抗生素稳定表达。本研究所构建的无抗生素表达系统,质粒遗传稳定性较好,连续传代100次无明显质粒丢失。该系统成功应用于肝素裂解酶I的高效表达,避免了肝素裂解酶在发酵时受到抗生素污染。

关键词：毒素-抗毒素系统枯草芽孢杆菌转录后调控无抗生素表达肝素裂解酶非编码sRNA

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沙雷菌CRISPR-Cas系统及Ⅱ型TA系统基因结构的分析与检测

沙雷菌CRISPR-Cas系统及Ⅱ型TA系统基因结构的分析与检测

引用

作者：王梦园青岛大学

学位级别：硕士

目的沙雷菌(Serratia)是临床常见的机会致病菌之一。近年来,因其临床菌株易对常用抗生素产生耐药性,且偶可导致院内感染的爆发,故而逐渐引起人们的重视。细菌中成簇规律性间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas)和毒素-抗毒素(TA)... 详细信息

目的沙雷菌(Serratia)是临床常见的机会致病菌之一。近年来,因其临床菌株易对常用抗生素产生耐药性,且偶可导致院内感染的爆发,故而逐渐引起人们的重视。细菌中成簇规律性间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas)和毒素-抗毒素(TA)系统分别以特异性切割降解核酸序列及顿挫感染的方式发挥噬菌体防御的功能,前者被认为可影响移动元件在细菌间的水平转移,后者则与细菌对不良环境的耐受有关。本研究旨在对沙雷菌CRISPR-Cas系统及Ⅱ型TA系统的结构和分布特征进行系统分析,研究其与沙雷菌的可移动元件、耐药基因及耐药表型的关系;同时,探究部分TA系统表达后对细菌生长产生的影响。方法1.自Nucleotide数据库下载了88株沙雷菌的全基因组序列,使用CRISPRCasfinder软件预测基因组所含CRISPR阵列及cas基因簇;由Meg Aline软件进行cas基因的序列比对并构建系统发育树;由DNAMAN8分析前导序列的AT碱基含量和序列,并使用BPROM预测启动子;所得重复序列与CRISPRmap数据库进行比较分析,使用RNAfold预测其最小自由能(MEF)及二级结构;由Blast N和CRISPRTarget进行间隔序列靶向基因的预测;使用PHASTER、ICEfinder、Ori Tfinder、CARD等软件分别对前噬菌体、整合接合元件(ICE)、可接合转移质粒及菌株所含耐药基因进行预测,并分析其与CRISPR-Cas系统之间的关联。2.使用TAfinder预测上述菌株基因组中所含Ⅱ型TA系统,并将所得毒素与抗毒素分别构建数据库,根据Blast P的E-value值再分组,将TA系统重新配对组合,分析其操纵子特征;由Origin软件展示新组合的TA系统在沙雷菌中的分布情况;确定沙雷菌TA系统的侧翼基因,同时预测染色体中的基因组岛(GI)、ICE、前噬菌体的位置以分析TA系统与移动元件的关系。3.基于上述分析结果设计Ⅰ-E、Ⅰ-F型cas1基因及10对TA系统的扩增引物,对收集的98株黏质沙雷菌临床分离株进行鉴定,分析这些系统的存在与细菌耐药表型之间的关系。4.将上述10对TA系统中的毒素与部分抗毒素编码基因的扩增产物分别连接至p BAD33与p ET28表达载体中,使其在大肠埃希菌Top10株及BL21株中单独表达、共同表达,以初步验证其生物学功能。5.统计学分析由SPSS 20.0完成,差异分析主要采用卡方检验及非参数秩和检验。结果1.本研究共在17株(19.32%)沙雷菌的全基因组序列中预测到41个确定的CRISPR阵列;9株菌(10.23%)同时含有cas基因簇。CRISPR-Cas系统型别主要为Ⅰ-E或Ⅰ-F型,cas基因簇中的cas1基因序列最为保守,其系统发育与CRISPRCas系统分型一致。前导序列保守性低,富含“AAAA”及“TTTT”序列,且多数都预测到启动子的存在。41个CRISPR阵列含14种重复序列,它们在型别内高度保守、序列差异较小,且都可以形成稳定的“茎环”结构。间隔序列多在30～34bp之间;靶向分析发现大多数与噬菌体同源,少数与质粒同源,这些质粒和噬菌体多来自肠杆菌科。含完整CRISPR-Cas系统沙雷菌的前噬菌体数量显著低于仅含CRISPR阵列组及不含CRISPR阵列组,但ICE在上述组别中的分布无差异;仅含CRISPR阵列沙雷菌可接合转移质粒存在率较高。沙雷菌染色质携带的耐药基因多为自主突变或固有存在,可移动的耐药基因主要分布于质粒,这些耐药质粒的存在与其CRISPRCas系统并无关联。***共在沙雷菌中预测出1820个Ⅱ型TA系统、31个Ⅳ型TA系统和182个外排泵组分相关的蛋白序列,菌株间所含TA数量的差异较大,在6～32个之间。沙雷菌TA系统的毒素序列可被分为16大类50类,其中Rel E类和GNAT类所含数量较多。抗毒素多为转录调节物,以RHH和Xre家族居多,可被分为53类,其蛋白序列和结构域较毒素更加复杂多变。沙雷菌的TA系统被重新分为78种,并进一步归为16类,其在沙雷菌中的分布极不均匀,系统结构也高度复杂多变。沙雷菌中的Ⅱ型TA系统大多位于染色体上,同一系统在同一菌种内具有相似的基因背景;少部分位于质粒、前噬菌体、GI等可移动元件上,可随之进行水平转移。3.仅1株临床黏质沙雷菌(1%)扩增出cas1基因;10对TA系统在临床分离菌中的存在率与数据库大致相符;耐药菌所含TA系统的数量明显低于非耐药菌,该差异由Rel1、Rel2、Ccd AB、Hic AB、GNAT、MNT/HEPN 6对TA系统所致。4.临床菌株中所含的Ⅱ型TA系统序列与数据库中序列有较高相似度。TA系统的初步功能验证发现Rel1、Rel2、Rel3、PIN1、PIN2、Hic AB系

关键词：沙雷菌属 CRISPR-Cas系统毒素-抗毒素系统细菌耐药可移动元件

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CopAso/ParEso的条件协同及变构调节研究

CopAso/ParEso的条件协同及变构调节研究

引用

作者：张晨曦安徽大学

学位级别：硕士

毒素-抗毒素(TA)操纵子是原核生物基因组中普遍存在的一类调控系统，具有多种生物学功能，如细胞周期调控、应激反应、DNA损伤修复和生物被膜形成等。此外,TA操纵子还与细菌的耐药性、病原性以及生物被膜的形成等过程密切相关。因此，研... 详细信息

毒素-抗毒素(TA)操纵子是原核生物基因组中普遍存在的一类调控系统，具有多种生物学功能，如细胞周期调控、应激反应、DNA损伤修复和生物被膜形成等。此外,TA操纵子还与细菌的耐药性、病原性以及生物被膜的形成等过程密切相关。因此，研究TA操纵子对深入了解原核生物的生理代谢、病理过程以及开发新的抗菌药物具有重要意义。　　条件协同作用是原核生物Ⅱ型毒素-抗毒素操纵子中的一种调控机制，不同浓度的毒素与抗毒素以不同方式相互作用，对它们自身的表达产生不同的影响，从而使细菌能够适应不同的环境。这种机制的关键在于抗毒素C端区段的内在无序性质，它能够通过与毒素不同的相互作用影响N端区段与启动子的结合，从而调节基因表达。　　本研究探讨的CopASO/ParESO是噬菌体CP4中一种新颖的Ⅱ型毒素-抗毒素(TA)系统。前期研究证实，抗毒素CopASO能与自身启动子DNA结合，但CopASO/ParESO(1∶1)复合物与DNA结合能力较弱。此外，前期研究还显示抗毒素CopASO蛋白C端的无序性对N端与DNA的亲和力有影响。然而，其它浓度比例下CopASO与ParESO如何相互作用及其复合物与DNA如何相互作用？以及CopASO的无序C端如何影响N端与DNA的相互作用？这些问题还有待解答。本研究通过尝试解析CopASO/ParESO(2∶1)复合物的晶体结构，以及探讨CopASO的C端无序区段的长度、分布和无序程度对蛋白与DNA结合的影响，以期从静态和动态角度解析CopASO/ParESO的作用机制。　　为制备CopASO/ParESO(2∶1)复合物，本研究尝试了以下两种方法:1.串联CopASO/ParESO(1∶1)与CopASO基因，构建重组表达克隆;2.通过尿素解聚CopASO/ParESO(1∶1)分离两种蛋白，然后按2∶1比例混合。为研究CopASO的C端无序区段影响N端与DNA相互作用的机制，我们设计并制备了各种CopASO无序C端的突变体，运用分子排阻层析和荧光偏振方法，检测了突变体蛋白与启动子DNA的相互作用，探讨了 C端无序区段的长度、分布和无序程度在蛋白与DNA结合中的作用。　　研究获得的主要结果如下:两种制备CopASO/ParESO(2∶1)复合物的方法均未能成功;CopASO的C端无序区段影响N端与DNA相互作用的机制得到初步揭示。后者的要点包括:1)CopASO的第51-66位氨基酸是影响蛋白与DNA相互作用的关键区段;2)该区段更加有序或更加无序都不利于CopASO与DNA的结合;3)蛋白与DNA的亲和力随着该区段长度的减短而逐渐降低。据此，本文提出了一个CopASO/ParESO调控自身表达作用机制的模型。

关键词：原核生物毒素-抗毒素系统条件协同变构调节相互作用

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结核分枝杆菌mazEF基因及结核病生物标志物的探究

结核分枝杆菌mazEF基因及结核病生物标志物的探究

引用

作者：屈艳琳石河子大学

学位级别：硕士

目的:(1).构建北京、非北京基因型结核分枝杆菌、标准株(H37RV)的mazEF3、mazEF6、mazEF9基因的过表达菌株,观测其在低氧、营养缺乏条件下的生存能力,同时检测不同电转电压下过表达菌株相应基因的mRNA表达水平。(2).检测预测的7种细胞... 详细信息

目的:(1).构建北京、非北京基因型结核分枝杆菌、标准株(H37RV)的mazEF3、mazEF6、mazEF9基因的过表达菌株,观测其在低氧、营养缺乏条件下的生存能力,同时检测不同电转电压下过表达菌株相应基因的mRNA表达水平。(2).检测预测的7种细胞因子的mRNA的表达水平,探讨目的因子分子表达水平作为结核分枝杆菌潜伏感染诊断的生物标志物的可能性。方法:(1).利用大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361,构建出重组质粒pMV361-mazEF3、pMV361-mazEF6、pMV361-mazEF9;电穿孔将重组质粒导入北京基因型、非北京基因型结核分枝杆菌中。在卡那霉素培养基上初步筛选,提取阳性菌株的质粒进行PCR、双酶切,送公司测序,验证构建是否成功;检测不同菌株在不同生长条件下的生长情况。实时荧光定量PCR技术检测不同电转电压下mazEF3的mRNA表达水平,寻找构建mazEF3过表达菌株的最佳电转电压。(2).健康对照组64人,活动性肺结核50人,结核分枝杆菌潜伏感染60人,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结核特异性抗原刺激的外周血中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IFI35、IP10及Foxp3的mRNA表达水平。结果:(1).成功构建了H37RV、北京、非北京基因型的结核分枝杆菌的mazEF3、mazEF6、mazEF9过表达菌株。北京基因型的结核分枝杆菌在正常和应激环境下,生长状态均好于非北京基因型结核分枝杆菌。实时荧光定量检测,电转电压为2300V时,构建的过表达菌株mazEF3的mRNA表达量最高。(2).7种因子相对表达量在活动性肺结核组为2.33±0.09、4.94±0.45、150±17.82、2.02±0.55、9.53±5.96、5.56±0.97、1.24±0.17,潜伏感染组分别为3.2±0.61、10.04±1.89、202±17.6、21.89±10.25、29.17±11.19、41.35±11.46、2.14±0.67,健康组分别为1.2±0.08、2.92±0.03、53±17.82、1.48±0.17、1.28±0.77、1.63±0.25、1.03±0.67。潜伏感染组与健康组相比7种细胞因子的mRNA表达水平,差异均有统计学意义(P<0.01),相应细胞因子检测的敏感性、特异性分别为95.1%、82.5%,92.5%、88.7%,91.9%、90.1%,88.2%、51.5%,74.2%、61.2%,81.8%、73.4%和80.4%、51.3%;潜伏感染组和活动性结核组比较除IFI35因子外,其余6种细胞因子的mRNA表达水平差异均有统计学意义(P<0.05),相应细胞因子检测的特异性、敏感性分别为90.6%、80%,88.6%、92.7%,91.9%、86.2%,57.6%、60%,50%、58%,76%、72.2%和66.7%、67.1%;健康对照组和活动性结核组相比较,7种细胞因子的mRNA表达水平差异均有统计学意义(P<0.01),相应细胞因子检测的敏感性、特异性分别为92.3%、90%,88.6%、86.7%,94.4%、86.7%,89.7%、65.8%,82.4%、63.3%,88.2%、70%和92.9%、72.1%。结核病密切接触者潜伏感染率为48.97%,健康组潜伏感染率为36%。结论:(1).成功构建了北京、非北京基因型的mazEF3、mazEF6、mazEF9过表达菌株,2300V是mazEF3的最佳电转电压。(2).结核病患者血清TNF-α、IFN-γ、IL-2 mRNA水平升高,以潜伏感染者升高更显著,因此可作为诊断结核分枝杆菌潜伏感染的生物标志物。

关键词：结核分枝杆菌 mazEF 毒素-抗毒素系统过表达潜伏感染实时定量PCR技术诊断

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分枝杆菌同源重组系统的构建及应用

分枝杆菌同源重组系统的构建及应用

引用

作者：毛旭建北京协和医学院

学位级别：硕士

分枝杆菌属包括致病性结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌,目前仍然是人类健康的巨大威胁。分枝杆菌的科学研究都需要有效的分子遗传操作技术,尤其是快速有效的基因突变及基因敲除的分子操作技术。但是由于分枝杆菌生长缓慢、重组酶活性较低等... 详细信息

分枝杆菌属包括致病性结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌,目前仍然是人类健康的巨大威胁。分枝杆菌的科学研究都需要有效的分子遗传操作技术,尤其是快速有效的基因突变及基因敲除的分子操作技术。但是由于分枝杆菌生长缓慢、重组酶活性较低等原因,在分枝杆菌内的基因操作技术包括基因敲除技术的发展一直落后于其他模式生物。我们在Xer/dif敲除系统的基础上开发了一种高效、通用、完善的基因敲除系统。我们在pJV53质粒中引入gfp报告基因,用于快速筛选在重组后丢失的质粒;构建了dif-hyg-dif, dif-zeo-dif表达盒,在表达盒两边加了多克隆酶切位点便于上下游同源臂的插入;随后我们利用该系统对耻垢分枝杆菌的4对毒素-抗毒素基因进行了连续的读码框内敲除,表明该系统可成功用于分枝杆菌多基因的连续敲除,为分枝杆菌功能基因组的研究提供了新的遗传工具。我们对结核分枝杆菌中的毒素-抗毒素系统进行了初步的研究,新发现了6个在耻垢分枝杆菌中有功能的毒素-抗毒素基因。此外,我们发现12个毒素-抗毒素基因在耻垢分枝杆菌中具有稳定质粒的功能,这说明它们可能参与调控结核分枝杆菌基因组的稳定。该研究为进一步研究毒素-抗毒素系统在结核分枝杆菌中的功能打下基础。

关键词：分枝杆菌基因敲除毒素-抗毒素系统

来源：评论

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*** MazF 毒素蛋白的结构和功能研究

引用

作者：王晓蕾北京师范大学

学位级别：硕士

mazEF毒素-抗毒素系统在应激条件下细菌的生长抑制与死亡过程中发挥着十分重要的作用。mazEF系统由一个表达毒素蛋白的mazF基因和一个表达抗毒素蛋白的mazE基因所组成。毒素蛋白MazF的性质非常稳定,而不稳定的抗毒素蛋白MazE在体内则很... 详细信息

mazEF毒素-抗毒素系统在应激条件下细菌的生长抑制与死亡过程中发挥着十分重要的作用。mazEF系统由一个表达毒素蛋白的mazF基因和一个表达抗毒素蛋白的mazE基因所组成。毒素蛋白MazF的性质非常稳定,而不稳定的抗毒素蛋白MazE在体内则很容易被ATP依赖的丝氨酸蛋白酶所降解。毒素蛋白MazF是一个序列特异性的RNA内切酶,它能够在单链RNA的ACA位点的第一个A和C之间发生特异性的切割反应。抗毒素蛋白MazE与毒素蛋白MazF结合后相互作用形成MazE/MazF蛋白复合体,MazF的毒性作用受到抑制。该复合体与单独的Maze能够分别结合到mazEF的启动子区发生负反馈调节。MazF与其同源蛋白一起共同形成了一个序列保守的毒素蛋白家族,被称之为mRNAInterferase。对MazE/MazF复合体的结构进行研究,发现它是一个由交替的两个MazF二聚体和一个MazE二聚体构成的不对称异六聚体蛋白(MazF2-MazE2-MazF2)。到目前为止,对MazF的RNA切割机理的研究仍在进行中。在本篇论文中,研究发现毒素蛋白MazF的四个氨基酸残基的点突变(E24A,G27A,R29A和K79A)均能够显著影响其RNA切割活性,它们分别位于S1-S2 loop和D片层S6上,可能共同参与构成MazF的活性中心。我们在2.0(A)的分辨率下得到了MazF K79A二聚体的蛋白晶体结构。MazF晶体结构分析表明MazF的C末端螺旋在其二聚体形成的过程中起着十分重要的作用,二聚体的形成是MazF具有RNA切割活性的前提。MazF S1-S2 loop区和S3-S4 loop区在结合MazE前后发生了十分显著的变化,Maze的结合能够抑制MazF的RNA切割活性。S1-S2 loop区在MazF的二聚体结构中呈开放状态,由于S1-S2 loop区在MazF的RNA切割活性中具有重要的作用,我们推测这一区域在MazF结合RNA前后会发生构象改变,从而激活MazF的切割活性。

关键词：毒素-抗毒素系统 mazEF系统抗毒素蛋白 RNA切割活性点突变蛋白晶体结构

来源：评论

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稳定遗传元件的挖掘表征及藻毒素生物降解的研究

稳定遗传元件的挖掘表征及藻毒素生物降解的研究

引用

作者：付欢欢北京化工大学

学位级别：硕士

水体富营养化使得湖泊中蓝藻水华频繁爆发,蓝藻在裂解死亡后产生藻毒素对水体造成二次污染。在蓝藻藻毒素中,微囊藻藻毒素(MCs)分布范围较广,毒性较强,而在所有的微囊藻藻毒素中LR亚型(MC-LR)毒性最强。利用物理方法或者化学方法降解MC-... 详细信息

水体富营养化使得湖泊中蓝藻水华频繁爆发,蓝藻在裂解死亡后产生藻毒素对水体造成二次污染。在蓝藻藻毒素中,微囊藻藻毒素(MCs)分布范围较广,毒性较强,而在所有的微囊藻藻毒素中LR亚型(MC-LR)毒性最强。利用物理方法或者化学方法降解MC-LR,成本高且污染环境;从水体中筛选可降解MC-LR的野生菌株周期长,降解效率低;通过构建基因工程菌的方法,构建周期短且可以提高降解效率,但是需添加抗生素保证菌株稳定遗传,而在水体中添加抗生素成本高且易导致耐药菌的出现,因此本研究构建了一个可以替代抗生素筛选作用的稳定遗传元件和一株可降解MC-LR的基因工程菌。本研究中稳定遗传元件的构建基于大肠杆菌毒素-抗毒素(TA)系统之一,同时也是细胞程序性凋亡调控元件的Maz E-Maz F。菌株中缺少Maz E,无法与Maz F形成复合体时,就会死亡。通过研究maz E基因缺失对细胞生长的抑制程度,利用没食子酸生物合成验证质粒上maz E基因的表达强度对产物产量和传代产量稳定性的影响,解析了Maz E-Maz F的调控机制,明确了maz E-maz F在质粒与基因组中表达强度适配性是影响质粒传代稳定性的关键因素,以此为基础,构建了一个稳定遗传的筛选元件,传代60代后,与抗生素筛选的效率相当。验证该元件可用后,查阅文献筛选来自鞘氨醇单胞菌的MC-LR降解基因mlr A、mlr B和mlr C,鉴定并表征这三种蛋白的催化能力,利用这三种蛋白以及转运蛋白Mlr D在大肠杆菌中构建MC-LR降解途径,实现了利用重组大肠杆菌将MC-LR降解到基本无毒的Adda,与已报道的野生藻毒素降解菌株ACM3962相比,降解效率提高9倍。总之,本研究挖掘并表征了一个代替抗生素筛选作用的稳定遗传筛选元件,其效率与抗生素筛选相当,此外,还构建了一株降解MC-LR的基因工程菌株,可将毒性很强的MC-LR降解为基本无毒的Adda,为水体中微囊藻藻毒素的降解奠定了理论基础。

关键词：大肠杆菌稳定遗传元件毒素-抗毒素系统生物合成藻毒素降解抗生素

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钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用的研究

钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用的研究

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作者：辛晓阳浙江大学

学位级别：硕士

目的了解钩端螺旋体毒素-抗毒素系统中毒性蛋白VapC的功能及其对宿主细胞的毒性作用。方法以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长vapB、vapC、vapBC基因并构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋... 详细信息

目的了解钩端螺旋体毒素-抗毒素系统中毒性蛋白VapC的功能及其对宿主细胞的毒性作用。方法以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长vapB、vapC、vapBC基因并构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rVapB和rVapC表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rVapB和rVapC.检测rVapB和rVapC有无水解问号钩体赖株及THP-1细胞DNA或RNA活性。分别采用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot试验,检测问号钩体赖株感染THP-1细胞前后vapB和vapC基因转录及表达水平的变化。采用免疫荧光激光共聚焦显微镜法检测VapB和VapC蛋白在问号钩体赖株感染THP-1细胞中表达情况。构建vapB和vapC基因真核表达载体并转染细胞,采用CCK-8试剂检测VapB和VapC蛋白对细胞活性的影响。结果所克隆的vapB和vapC基因核苷酸及氨基酸序列与文献报道完全相同。所构建的原核表达系统能分别表达rVapB和rVapC。rVapC可水解RNA,但不水解DNA。问号钩体赖株感染THP-1细胞后,vapB和vapC基因转录及表达水平均显著上调,部分毒性蛋白VapC外分泌。问号钩体赖株感染细胞内可检出毒性蛋白VapC,转染vapC基因的人肾小管上皮细胞HEK293大量死亡结论问号钩体赖株VapC蛋白为RNA酶,可在感染宿主细胞过程中外分泌并对细胞有明显毒性。

关键词：致病性钩端螺旋体毒素-抗毒素系统毒性蛋白核酸酶活性细胞毒性

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鲍曼不动杆菌耐药持留菌的形成机制研究

鲍曼不动杆菌耐药持留菌的形成机制研究

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作者：马亚男安徽大学

学位级别：硕士

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanmii)是一种重要的院内感染致病菌,能够引发呼吸道感染、泌尿系统感染等。鲍曼不动杆菌耐药问题一直是临床感染治疗的最大障碍。持留菌的存在可能是其临床治疗失败和感染复发的真正原因,同时也是导致... 详细信息

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanmii)是一种重要的院内感染致病菌,能够引发呼吸道感染、泌尿系统感染等。鲍曼不动杆菌耐药问题一直是临床感染治疗的最大障碍。持留菌的存在可能是其临床治疗失败和感染复发的真正原因,同时也是导致耐药率不断上升的原因之一。近些年持留菌引起的耐药问题受到广泛重视,鲍曼不动杆菌持留菌的基本特征及形成机制的研究对于更好的控制持留菌引起的耐药及感染问题具有重要的指导意义,也为其他物种中持留菌的研究提供理论依据。本研究以鲍曼不动杆菌标准株ATCC 19606为研究对象,开展鲍曼不动杆菌耐药持留菌的基本特征及其形成机制的研究。首先检测了鲍曼不动杆菌的生长曲线和抗生素抗性谱。生长曲线测定结果帮助确定鲍曼不动杆菌的对数期与平台期的培养时间。抗性谱的测定结果与美国临床实验室标准化协会(CLSI)制定的标准比较发现鲍曼不动杆菌标准株ATCC 19606抗生素的抗性水平较低：对多数(9/13)抗生素敏感,仅对氨苄西林(AMP)和头孢吡肟(CPM)耐药。这些结果为后续实验时间点的选取和抗生素的选择提供了实验依据。为了了解持留菌形成特点及规律,本研究首先优化了分离及定量鲍曼不动杆菌的持留菌细胞的方法,比较了不同的生理状态下以及不同的抗生素压力条件下鲍曼不动杆菌持留菌水平的差异情况。实验结果表明鲍曼不动杆菌在持留菌的形成过程中具有与其他细菌类似的二相型死亡曲线,即大量敏感细菌快速裂解死亡,而持留菌的量维持相对稳定。平台期的细菌菌群中含有的持留菌比例要显著高于对数生长期,说明鲍曼不动杆菌的持留菌水平与菌株的生理状态密切相关。此外,持留菌的形成呈现出十分明显的抗生素种类和浓度依赖性,不同的抗生素的死亡曲线的情况大不相同,其中多粘菌素B(PB)与高浓度的妥布霉素(TOB)具有消除持留菌细胞的能力。以上这些结果让我们对鲍曼不动杆菌持留菌的基本特征有了进一步的认识。借助生物信息学工具对721株已测序的鲍曼不动杆菌基因组中可能的II型毒素-抗毒素系统(TA系统)进行了彻底的搜索,结果表明鲍曼不动杆菌持留菌的中II型TA系统十分多样,包含至少15对的TA系统。我们挑选其中报道有功能的5对TA系统,分别为RelB/RelE、HicA/HicB、GP49/Cro(HigB/HigA)、 HTH/GNAT及DUF497/COG3514系统,在44株临床多耐药鲍曼不动杆菌菌株中的分布情况做了进一步分析。结果表明,HTH/GNAT、GP49/Cro(HigB/HigA) 与DUF497/COG3514的分布十分广泛广泛,分别占总菌株的61%、56%和40%。另一方面, real-time PCR的方法对持留菌与非持留菌中II型TA系统的表达量进行了确认,结果表明持留菌中3类II型TA系统(GP49/Cro (HigB/HigA)、 HTH/GNAT及DUF497/COG3514)的表达量要显著高于非持留菌。以上结果表明3类Ⅱ型TA系统在持留菌形成过程中扮演重要角色。为了更为全面的了解持留菌形成及恢复生长过程中起主要调控作用的基因和通路情况,深入的认识持留菌发生及转化的调控机制,我们借助Miseq高通量测序平台在转录组水平上对持留菌形成及恢复生长的整个过程中差异表达的基因和基因所富集到的通路进行了分析。结果表明在加入抗生素的第一个小时和重新培养的第5小时差异表达的基因数目最多,上调和下调2倍的基因数目分别是898个、566个和704个、964个。差异表达的基因所富集的通路分析结果表明碳水化合物代谢途径和能量代谢途径在持留菌形成和恢复生长过程中均有表达,而异源物质的生物降解途径在持留菌形成阶段特异存在,推测异源物质降解相关基因在持留菌形成过程中扮演了重要角色。聚类分析找到了一些在持留菌时期表达量升高而在持留菌恢复生长时下降的基因,另外对4类TA系统的表达情况的结果表明GP49(HigB)/Cro(HigA)、DUF1044/RelB这两对TA系统在持留菌的潜伏期(E1-E3)显著升高。这些基因可能在持留菌形成过程中发挥了重要作用。总之,鲍曼不动杆菌持留菌的形成机制是极为复杂的,后续我们将进一步缩小这一范围并开发有效的控制持留菌感染的新方法。

关键词：鲍曼不动杆菌持留菌细菌耐药毒素-抗毒素系统

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模式链霉菌可移动基因组的比较分析

模式链霉菌可移动基因组的比较分析

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作者：邵钰城上海交通大学

学位级别：硕士

本研究主要利用比较基因组分析的手段研究通过水平基因转移事件获得的基因组岛对链霉菌基因组结构的影响。选取了亲缘的2个链霉菌模式菌株作为本论文的主要研究对象:天蓝色链霉菌A3(2)和变铅青链霉菌TK24。为解决多个细菌基因组比对在... 详细信息

本研究主要利用比较基因组分析的手段研究通过水平基因转移事件获得的基因组岛对链霉菌基因组结构的影响。选取了亲缘的2个链霉菌模式菌株作为本论文的主要研究对象:天蓝色链霉菌A3(2)和变铅青链霉菌TK24。为解决多个细菌基因组比对在数目、基因组大小和运算时间上的限制,我们开发了基于并行计算的细菌基因组差减杂交模拟工具mGenomeSubtractor,可以快速地识别细菌基因组保守骨架和菌株特异性基因。该工具能够在1～2分钟的时间内完成一个基因组与多达30个预置基因组和10个上传基因组的比对任务。通过天蓝色链霉菌A3(2)和其亲缘的变铅青链霉菌TK24的比较分析,从变铅青链霉菌TK24基因组7,751个编码蛋白的基因中识别出472个菌株特异性基因。连续分布的特异性基因构成大小为597 kb的附属区,包含9个较大的可变区。序列特征表明这些可变区是外源基因组岛。我们用PCR技术考察了8个基因组岛在链霉菌中的分布,发现它们仅存在于变铅青链霉菌中。用相同的方法我们识别出天蓝色链霉菌A3(2)上的14个基因组岛。进而分析所识别基因组岛上重要基因的功能,探讨了dnd基因簇,dnd限制修饰系统,II型毒素-抗毒素系统等新颖的有重要生物学意义的外源基因(簇),为进一步研究这些基因功能和进化过程等提供了新思路。借助生物信息学分析,发现在变铅青链霉菌66中首次报道的dnd基因簇通过水平转移方式以基因组岛的形式广泛存在于分类地位和生态差异很大的细菌和古细菌中。综合分子遗传、生物化学和蛋白功能等多方面实验和生物信息学数据,我们建立了DNA硫修饰数据库dndDB,收录了来自29个物种的32个dnd基因簇,140个dnd基因及蛋白的相关信息。此外,还整合了丰富的相似性搜索、序列比对、进化树分析等工具。有助于了解dnd基因簇的来源与进化和揭示DNA硫修饰的生物学意义。在已识别的链霉菌基因组岛和一些编码DNA硫修饰系统的基因组岛中,常发现携带毒素-抗毒素基因座位。为深入探讨II型毒素-抗毒素系统在链霉菌逆境应答及维持外源基因稳定性等遗传过程所扮演的重要角色,我们建立了细菌和古细菌II型毒素-抗毒素基因座位数据库TADB。目前,通过对260多篇文献的挖掘,该二级生物数据库系统地收录了在一千多个原核生物中所识别的一万多个II型毒素-抗毒素基因座位,并通过比较分析将这些基因分类为14个家族。此外,通过本文对链霉菌模式菌株的研究工作,我们结合分子生物学实验技术和生物信息学方法建立了细菌比较组学分析平台,为本课题组系统研究肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌等重要耐药条件致病菌中的可移动遗传学元件提供了有力支撑。

关键词：模式链霉菌比较基因组学基因组岛 DNA磷硫酰化修饰毒素-抗毒素系统

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