检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：戴镜郦浙江大学

学位级别：博士

耐辐射奇球菌（Deinococcusradiodurans）是一种对于电离辐射、紫外线、干燥、高温及多种化学诱变剂胁迫具有极强抗性的微生物。作为研究极端环境生存能力及DNA损伤修复机制的模式生物之一，对耐辐射奇球菌胁迫响应机制的研究将对探讨... 详细信息

耐辐射奇球菌（Deinococcusradiodurans）是一种对于电离辐射、紫外线、干燥、高温及多种化学诱变剂胁迫具有极强抗性的微生物。作为研究极端环境生存能力及DNA损伤修复机制的模式生物之一，对耐辐射奇球菌胁迫响应机制的研究将对探讨生物在极端环境下特有的生命过程具有重要意义。本研究通过蛋白质组学、转录组学及分子生物学等手段探究了两种重要的转录后调控系统（蛋白质磷酸化修饰及毒素-抗毒素系统）参与耐辐射奇球菌胁迫响应的机制。　　我们首先利用蛋白质组学及生物信息学方法研究了蛋白质磷酸化修饰在耐辐射奇球菌中的情况，共鉴定到135个磷酸化修饰蛋白的265个磷酸化修饰位点并进行了注释。通过GO的富集分析、KEGG通路分析和亚细胞定位分析，表明蛋白磷酸化修饰在耐辐射奇球菌中参与了多种生物学过程，包括代谢相关的糖酵解和TCA循环。通过绘制蛋白之间的互作网络图谱，我们发现磷酸化的蛋白质在DNA/RNA相关的蛋白分类中明显聚集。横向比较耐辐射奇球菌同其他细菌的磷酸化蛋白质组，发现其整体磷酸化修饰水平及S/T/Y修饰位点分布与其他细菌较为相似。将耐辐射奇球菌辐照前后的两个蛋白磷酸化组学进行比较，共筛选获得18个磷酸化水平具有显著差异的蛋白。对于差异蛋白中的RecA蛋白通过EMSA，D-loop结合及ATPase等实验，并通过结构分析，发现新鉴定到的S174位点的磷酸化直接影响了其与单链DNA与双链DNA结合能力及D-loop活性，而对其ATPase没有影响。这些结果表明蛋白磷酸化修饰可能在耐辐射奇球菌的DNA修复中起着重要作用。　　同时，我们使用结构生物学、转录组学及生化实验研究了毒素-抗毒素系统（MazEF-dr系统）参与耐辐射奇球菌环境胁迫响应的机制。通过大肠杆菌表达纯化获得耐辐射奇球菌的MazF-dr蛋白，优化得到蛋白晶体并进行了结构解析。研究表明MazF-dr蛋白结构拥有MazF家族典型的MazF/CcdB折叠，与同源蛋白结构高度相似且具有保守的催化位点，但其位于二聚化互作界面的β1-β2loop与大肠杆菌存在差异。通过多个转录组数据对比筛选出650个基因作为MazF在损伤响应中可能的底物。生物信息学手段富集结果表明其中大量的基因参与了金属离子转运、渗透压胁迫及细胞分裂等通路，可能与MazEF-dr系统作为全局调控因子参与耐辐射奇球菌的胁迫响应有关。同时实验结果表明在DNA损伤剂的胁迫处理下耐辐射奇球菌胞内铁离子含量显著上升，且细胞活性氧（ROS）水平及蛋白质羰基化水平上调，而该现象在mazEF敲除株中并不显著，表明MazEF-dr系统可能通过调控胞内铁离子含量进而引起ROS水平上调，最终导致细胞持留性或者死亡。　　综上所述，本研究鉴定了耐辐射奇球菌中在正常及辐照条件下的磷酸化蛋白质组学，发现以RecA为代表的蛋白磷酸化参与调控了细胞的胁迫响应过程;探究了耐辐射奇球菌毒素-抗毒素系统MazEF系统中毒素蛋白的结构及抗毒素蛋白的可能切割底物，进而揭示MazEF介导的转录后水平损伤胁迫响应的调控机制。本研究不仅加深了对耐辐射奇球菌极端环境生存机理的认识，也有助于更好地了解原核生物中蛋白质磷酸化修饰及毒素-抗毒素系统的特征及多样性，并拓宽我们对于生物逆境胁迫适应机制的理解。

关键词：耐辐射奇球菌蛋白质磷酸化毒素-抗毒素系统 DNA损伤

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乳酸菌中毒素-抗毒素系统研究进展

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食品科学 2015年第19期36卷 260-264页

作者：徐谓李洪军贺稚非西南大学食品科学学院重庆400716

毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TAS)是广泛存在于细菌和古细菌中的一类小型功能基因。目前已发现的TAS分为五大类型。超过75种乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)中的TAS被测定,TAS调控基因(改变细菌鞭毛类型、控制毒素毒性等... 详细信息

毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TAS)是广泛存在于细菌和古细菌中的一类小型功能基因。目前已发现的TAS分为五大类型。超过75种乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)中的TAS被测定,TAS调控基因(改变细菌鞭毛类型、控制毒素毒性等)、应激环境下调节细菌代谢、在高浓度抗生素作用下形成持留细胞等调控机制已有较深入研究。本文概述近年来TAS分类发展及乳酸菌中TAS的研究情况,为深入研究乳酸菌中TAS并应用于食品工业提供理论依据。

关键词：乳酸菌毒素-抗毒素系统应用

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毒素-抗毒素系统及其在结核分枝杆菌中的研究进展

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国际呼吸杂志 2010年第2期30卷 108-111页

作者：孙照刚徐玉辉李传友北京市结核病胸部肿瘤研究所细菌免疫室 101149 河北省廊坊市畜牧水产局 065000

毒素一抗毒素系统（TAs）广泛存在于非严格胞内寄生的细菌等原核生物中，基因的多态性分析表明，它们具有共同的祖先。目前已经对TAs多个家族进行了蛋白晶体结构解析，并且分析了它们作用的方式。TAs由于具有RNA酶的活性并且能够在特定... 详细信息

毒素一抗毒素系统（TAs）广泛存在于非严格胞内寄生的细菌等原核生物中，基因的多态性分析表明，它们具有共同的祖先。目前已经对TAs多个家族进行了蛋白晶体结构解析，并且分析了它们作用的方式。TAs由于具有RNA酶的活性并且能够在特定的mRNA碱基排列位置切割mRNA，因此TAs在细菌的潜伏感染与适应环境刺激等方面发挥了重要作用。进一步对目前严重危害人类的结核分枝杆菌的全基因组分析表明：结核分枝杆菌存在36对TAs基因，目前已经有少量TAs的功能在结核分枝杆菌中得到证明。

关键词：毒素-抗毒素系统晶体结构 RNA酶结核分枝杆菌

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金葡菌第2类毒素-抗毒素系统对PJI生物膜形成和耐药作用机制研究

金葡菌第2类毒素-抗毒素系统对PJI生物膜形成和耐药作用机制研究

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作者：齐新宇广州中医药大学

学位级别：博士

目的：　　1.观察yoeB基因对Newman及JE2菌株浮游状态下的生长能力和耐药的影响。　　2.观察yoeB基因对Newman及JE2菌株生物膜状态下的生长能力和耐药能力的影响。　　3.评价yoeB基因对Newman及JE2菌株生物膜主要成分含量及相关类型生... 详细信息

目的：　　1.观察yoeB基因对Newman及JE2菌株浮游状态下的生长能力和耐药的影响。　　2.观察yoeB基因对Newman及JE2菌株生物膜状态下的生长能力和耐药能力的影响。　　3.评价yoeB基因对Newman及JE2菌株生物膜主要成分含量及相关类型生物膜形成的影响。　　4.观察Sub-MIC抗生素对于Newman及JE2菌株浮游状态生长的影响，观察Sub-MIC抗生素及小檗碱对于Newman及JE2菌株生物膜形成的影响，探讨yoeB基因对于该表型的影响。　　5.建立小鼠肌肉金葡菌感染模型、钛棒皮下植入感染模型及PJI模型，初步探讨yoeB基因对于小鼠肌肉感染模型和钛棒钛棒皮下植入模型细菌负荷的影响。　　方法：　　第一部分：1.金葡菌浮游状态的生长及耐药：使用麦氏比浊法将菌液浓度调整为0.5麦氏浊度,分别取100μL稀释液加至无菌96孔并置于37℃恒温培养箱孵育，使用分光光度仪每小时监测各菌液在600nm波长时的吸光值至6小时;采用E-strip法测量各菌株MIC值，将各待测菌株加入含10×MIC浓度抗生素培养基溶液中并置于恒温摇床治疗，于治疗24小时后采用平板倍比稀释法测量抗生素治疗后各菌液CFU并计算细菌生存率。2.金葡菌生物膜的形成和及耐药：生物膜的形成能力检测采用半定量和定量两种方法，半定量法检测具体如下：将各待测菌株调至相同细菌浓度后并取取100μL样品加至无菌96孔板孵育24小时，以10%浓度的福尔马林固定后以0.1%的结晶紫染色，去离子水漂洗4次后室温风干，加入30%的冰醋酸以溶解结晶紫染料并在600nm波长时测量各样品吸光值;定量检测具体方法如下：将定量后的细菌和无菌钛棒加入含有5mlTSB的无菌6孔板放入培养箱培养至72小时，各取4根待测钛棒进行超声裂解器，采用琼脂平板倍比稀释法对超声裂解液中的细菌浓度定量分析;生物膜的抗生素耐药实验在培养72小时后进行，分别加入10×MIC浓度的头孢唑林和万古霉素治疗24-48小时，分别于治疗后24小时和48小时对钛棒上的细菌定量，计算其生存率。***基因对Newman及JE2菌株生物膜主要成分含量影响：首先对生物膜样品进行处理，过滤除菌后分别根据需要使用试剂去除样品中的蛋白质、多糖及DNA。首先采用BCA法测量生物膜中总蛋白的含量，即根据已知的蛋白标准品浓度建立标准曲线，推测生物膜中的蛋白浓度;采用核酸荧光染色法测量生物膜中eDNA浓度，即对生物膜中的eDNA染色后测量其荧光值而推断核酸浓度。采用化学发光法测量生物膜中多糖的浓度。分别使用proteinaseK、高碘酸钠和DNaseI对各样本治疗以去除生物膜中的蛋白质、多糖及DNA成分，判断治疗后WT及yoeB基因突变株生物膜的变化。4.亚抑菌浓度抗生素及小檗碱对于金葡菌浮游状态生长及生物膜形成的影响。在96孔板采用二倍稀释法建立各亚抑菌浓度，加入菌液后放入暖箱孵育24小时，观察不同亚抑菌浓度条件下WT及yoeB突变体的生长能力差异。分别使用0.5×MIC、0.25×MIC浓度抗生素对钛棒生物膜诱导并与没有添加抗生素的对照组比较，使用平板稀释法检查各组生物膜CFU的差异;中药黄连有效成分小檗碱对于金葡菌生物膜形成的影响，使用CLSI检测WT及yoeB突变株对小檗碱的MIC，使用10×MIC浓度的小檗碱分别对各组钛棒表面生物膜分别干预，具体方法参照第二部分。　　第二部分：建立小鼠肌肉感染模型、皮下植入钛棒周围感染模型及PJI模型。将24只健康的C57BL/6小鼠随机分为WT组、yoeB1突变组和yoeB2突变组。首先建立小鼠肌肉感染模型，细菌定量为1×107CFU/ml，对小鼠大腿备皮消毒后注射100μL菌液，72小时后处死小鼠，取大腿肌肉组织研磨后进行细菌定量分析。皮下植入钛棒感染模型是将无菌的钛棒插入小鼠的皮下，再经切口注射10μL菌液(1×106CFU/ml)造成感染，72小时后取出钛棒进行细菌定量。PJI模型与皮下感染模型类似，内植入物使用3D打印金属材料，手术过程与临床类似，即在无菌条件下切除小鼠半月板及韧带组织，经针头开口后插入涂抹有骨水泥的金属假体，缝合完毕后经关节腔注射10μL菌液(1×106CFU/ml)造成感染，72小时对假体及周围组织细菌进行定量。　　结果：　　***1和yoeB2基因突变株浮游状态下生长速度快于WT，浮游状态下的WT对头孢唑林和万古霉素菌耐药性均强于yoeB基因突变组。Newman的WT株、yoeB1和yoeB2突变株24小时10×MIC头孢唑林和万古霉素生存率分别为0.05%、0.02%、0.02%和0.17%、0.03%、0.08%。JE2的WT株、yoeB1和yoeB2突变株使用10×MIC浓度头孢唑林和万古霉素24小时生存率分别为0.46%、0.03%、0.

关键词：金黄色葡萄球菌毒素-抗毒素系统生物膜假体周围感染小檗碱

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副溶血性弧菌毒素-抗毒素系统VPA0769-VPA0770的结构和功能研究

副溶血性弧菌毒素-抗毒素系统VPA0769-VPA0770的结构和功能研究

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作者：宋晓杰天津大学

学位级别：硕士

毒素-抗毒素系统(TA系统)编码一种抑制细菌生长的毒素和一种中和毒素毒性的抗毒素,广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。毒素比较稳定,而抗毒素较不稳定,正常条件下抗毒素能够中和毒素,TA系统对细胞增殖的影响不大,但在细菌受到压力胁迫... 详细信息

毒素-抗毒素系统(TA系统)编码一种抑制细菌生长的毒素和一种中和毒素毒性的抗毒素,广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。毒素比较稳定,而抗毒素较不稳定,正常条件下抗毒素能够中和毒素,TA系统对细胞增殖的影响不大,但在细菌受到压力胁迫时,抗毒素被降解,游离的毒素会对细胞产生毒性作用,使细菌进入休眠状态。毒素与多种细胞过程的微调有关,例如DNA复制、转录、翻译、生物膜形成等。毒素和抗毒素之间的相互作用可能在致病菌的毒力和持久性中起关键作用。根据抗毒素不同的性质和作用方式,目前TA系统被分为八种类型,其中,II型毒素抗毒素均为蛋白质,在细菌质粒、染色体和噬菌体等移动遗传原件中大量存在,因此对II型TA系统的研究较为广泛。弧菌属于革兰氏阴性菌,是一种水生浮游细菌,不仅能够感染水生动物形成水产疾病,还能侵入人体造成胃肠炎、伤口感染、筋膜炎以及败血症等多种疾病。目前常见弧菌病原体中发现的TA模块的结构和功能尚比较少,本文聚焦于副溶血性弧菌中的一对毒素-抗毒素系统VPA0769-VPA0770。本论文通过将这一系统的基因克隆到原核表达载体上,经大肠杆菌表达系统进行外源共表达,利用亲和层析、凝胶过滤层析等手段获得高纯度高浓度目的蛋白后进行结晶,最终通过X射线衍射法获得了2.88(?)分辨率的蛋白复合物晶体结构。三维结构显示VPA0769和VPA0770形成独特的异十二聚体,它包含两对VPA0769四聚体和两对VPA0770二聚体。抗毒素VPA0769由9个α螺旋构成,总体结构与Xre结构域相似。毒素VPA0770由6个β折叠链和8个α螺旋构成,与RES结构域同源。位于结构中间的β夹心折叠形成两个反向平行的β片层,此β片层和外部的α螺旋之间形成一个凹槽,抗毒素C末端的α螺旋通过疏水作用插入到该毒素的凹槽中,阻断了毒素的活性位点。根据相互作用界面的分析构建了单点突变体,证明了抗毒素的W111、Y117、L144、H146、F149是中和毒素的关键氨基酸,R27和E48是毒素活性位点的关键氨基酸。本研究的结果为进一步理解TA系统在细菌细胞内的作用机制以及设计抗毒素药物提供了的结构基础。

关键词：毒素-抗毒素系统副溶血性弧菌晶体结构

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猪链球菌ZY05719菌株Ⅱ型毒素-抗毒素系统的研究

猪链球菌ZY05719菌株Ⅱ型毒素-抗毒素系统的研究

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作者：王丹南京农业大学

学位级别：硕士

猪链球菌(Streptococcus suis,***)是一种重要的人畜共患病病原,是造成猪链球菌病的最主要的病原菌之一,人类也可通过直接接触病猪或者病猪肉副产品而感染此菌。2005年四川爆发猪链球菌病疫情患病猪中分离出猪链球菌2型菌株强毒株ZY0571... 详细信息

猪链球菌(Streptococcus suis,***)是一种重要的人畜共患病病原,是造成猪链球菌病的最主要的病原菌之一,人类也可通过直接接触病猪或者病猪肉副产品而感染此菌。2005年四川爆发猪链球菌病疫情患病猪中分离出猪链球菌2型菌株强毒株ZY05719用于本研究中。猪链球菌根据荚膜多糖表面抗原的差异可分为33个公认的血清型,其中猪链球菌2型临床分离率高,强毒株的报道较多,对人类和猪都有致病性,危害严重,有重要的公共卫生学意义。滞留菌是指细菌在应激环境中休眠的特殊形式,其构成微生物群体中休眠细胞的亚群,能够形成对抗生素的耐受性而备受关注。毒素-抗毒素系统(TA)已经被证明参与多种细菌的滞留菌形成。近年来,细菌TA系统和细菌毒力以及生理特性的研究逐渐增多,但目前对猪链球菌滞留性和TA系统研究比较少。本研究主要通过构建TA系统缺失株,原核表达毒素和抗毒素来研究他们的生物学特性,生物学功能以及在滞留性等方面的影响,从而为猪链球菌ZY05719的TA系统和滞留菌的形成提供试验资料和理论基础。毒素-抗毒素(TA)系统由一种稳定的毒素及与其同源的不稳定的抗毒素组成的双顺反子基因元件构成。本研究通过生物信息学分析,预测出猪链球菌2型ZY05719中的9对Ⅱ型TA系统,并且对其进行筛选鉴定。通过自然转化的的方式成功构建7个TA缺失株,通过PCR扩增和DNA测序的方法证明缺失株构建成功。对TA缺失株进行细菌形态学的观察和生长曲线的测定,但是与野生株相比没有发现显著差异。本研究将构建成功的重组质粒pBADHisA-toxin和pBADHisA-toxin-antitoxin转化至Top10感受态细胞,通过诱导剂阿拉伯糖诱导表达,绘制生长曲线。结果表明,诱导毒素表达时,含有pBADHisA-T1质粒的细菌生长明显受到抑制,在4h后生长趋势已经基本不变,并且抗毒素蛋白1能够中和相应的毒素蛋白,使细菌生长恢复正常。探究滞留菌形成与TA系统之间的关系。本研究选取猪链球菌高度敏感的抗生素利福平和氨苄青霉素测定细菌最小抑菌浓度(MIC),并通过100倍MIC抗生素筛选滞留菌,平板计数测定菌落形成单位(CFU),用于监测滞留水平。再用氨苄青霉素测定TA缺失株的滞留性。结果发现猪链球菌2型血清型菌株ZY05719能在利福平和氨苄青霉素的100倍MIC中形成滞留菌,TA缺失株在100倍MIC氨苄青霉素环境也能形成滞留菌。并通过RT-qPCR对RelA/RelQ进行转录水平分析,RelA/RelQ在猪链球菌滞留菌形成不同时期的转录水平变化显著,但是否调控滞留菌的形成需进一步验证。然而TA1缺失导致的RelA/RelQ转录变化并不直接影响缺失株滞留菌的形成,因此推测猪链球菌在抗生素环境中形成滞留菌并不是单一因素调控的结果,其机制尚需进一步探索。

关键词：猪链球菌2型毒素-抗毒素系统耐药性滞留菌

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铜绿假单胞菌新型Ⅱ型毒素-抗毒素系统的功能研究

铜绿假单胞菌新型Ⅱ型毒素-抗毒素系统的功能研究

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作者：周靖怡南开大学

学位级别：硕士

持留菌是一种休眠或生长缓慢的细胞,能够高度耐受营养缺乏和抗生素等环境压力。持留菌的形成主要是由于表型的转换,当环境压力消除后,持留菌能够恢复正常生长。持留菌的形成是临床上导致细菌慢性感染和复发性感染的主要原因之一。毒素-... 详细信息

持留菌是一种休眠或生长缓慢的细胞,能够高度耐受营养缺乏和抗生素等环境压力。持留菌的形成主要是由于表型的转换,当环境压力消除后,持留菌能够恢复正常生长。持留菌的形成是临床上导致细菌慢性感染和复发性感染的主要原因之一。毒素-抗毒素系统（TA系统）在持留菌的形成中起着重要的作用。TA系统由稳定的毒素和不稳定的抗毒素组成,毒素能够影响细胞重要的生理生化过程,比如抑制DNA的复制、RNA的转录、蛋白质的合成、细胞壁的合成、细胞的分裂或者降低膜电位,抑制细菌的生长。在正常的生长环境中,毒素能够被其相对应的抗毒素中和;而当细菌处于环境压力状态时,抗毒素会被降解从而使毒素活化。根据抗毒素的性质及其作用机制,TA系统被分为7种类型（I-VII）,其中Ⅱ型TA系统在细菌基因组中广泛存在。例如在结核分枝杆菌和大肠杆菌中分别鉴定出了至少79种和12种Ⅱ型TA系统。典型的Ⅱ型TA系统由位于同一操纵子上分别编码毒素蛋白和抗毒素蛋白的两个基因组成,毒素的活性通过与其抗毒素直接结合而受到抑制,抗毒素能够与TA系统操纵子的启动子区域直接结合,从而使TA系统操纵子的转录被抑制。铜绿假单胞菌是环境中常见的革兰氏阴性条件致病菌,能够在免疫功能低下的患者中引起一系列急慢性感染。在铜绿假单胞菌中,已经鉴定出至少4对Ⅱ型TA系统参与持留菌的形成,这四对Ⅱ型TA系统分别是:Par D/Par E,Hic A/Hic B,Rel E/Rel B和Hig B/Hig A。一项生物信息学分析表明,在铜绿假单胞菌的染色体上存在7对可能参与持留菌形成的Ⅱ型TA系统,分别是:PA14＿51010/PA14＿51020,PA14＿40220/PA14＿40210,PA14＿21710/PA14＿21720,PA14＿28790/PA14＿28780,PA14＿60050/PA14＿60040,PA14＿71340/PA14＿71330和PA14＿28120/PA14＿28130。了解TA系统的作用机制将有助于我们阐明铜绿假单胞菌的持留菌形成机制。在本研究中,我们检测了上述7个预测的Ⅱ型TA系统在铜绿假单胞菌野生型菌株PA14持留菌形成中的作用。毒素基因PA14＿51010的过表达或者抗毒素基因PA14＿51020的敲除会增加细菌对抗生素的耐受性,而共同过表达或者同时敲除PA14＿51010和PA14＿51020这两个基因能够将细菌的持留水平恢复至野生型状态。这两个基因位于同一操纵子,且该操纵子能够被抗毒素PA14＿51020抑制,同时我们也证明了毒素蛋白PA14＿51010和抗毒素蛋白PA14＿51020之间的直接相互作用。序列分析表明,毒素蛋白PA14＿51010包含一个保守的RES结构域,属于RES蛋白家族。PA14＿51010的过表达会降低胞内NAD+的水平,RES结构域的突变能够消除PA14＿51010降低胞内NAD+水平和促进持留菌形成的能力。此外,nrt R基因突变使胞内NAD+的含量升高,中和了过表达PA14＿51010造成的胞内NAD+含量的降低,消除了PA14＿51010过表达在持留菌形成中的促进作用。综合来讲,我们的研究确定了铜绿假单胞菌中一对新型Ⅱ型TA系统,并发现其能够通过降低胞内NAD+的水平来促进持留菌的形成。

关键词：铜绿假单胞菌持留菌毒素-抗毒素系统

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西瓜噬酸菌毒素-抗毒素系统HipBA的鉴定与功能研究

西瓜噬酸菌毒素-抗毒素系统HipBA的鉴定与功能研究

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作者：张皓吉林农业大学

学位级别：硕士

瓜类细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch,BFB)是由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)引起的极具毁灭性的细菌性种传病害,对我国的西甜瓜产业造成了严重的危害和极大的经济损失。毒素-抗毒素(Toxin-Antitoxin,TA)系统普遍存在于细菌的... 详细信息

瓜类细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch,BFB)是由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)引起的极具毁灭性的细菌性种传病害,对我国的西甜瓜产业造成了严重的危害和极大的经济损失。毒素-抗毒素(Toxin-Antitoxin,TA)系统普遍存在于细菌的染色体上,通常由毒素和抗毒素两个基因组成,分别编码稳定的毒素蛋白和不稳定的抗毒素蛋白。二者通常相互作用,保护细胞不受毒素的影响。TA系统作为细菌应激反应的系统,在面对恶劣环境、抗生素胁迫等方面都发挥着重要的作用。目前根据抗毒素的性质以及与同源毒素中和的方式将TA系统分为8种类型(I-VIII),其中HipBA属于II型TA系统。由于TA系统在人体病原菌中的毒力和休眠方面可能发挥作用,因此在人体病原菌中关于TA系统的研究获得了大量关注,然而在植物病原菌中关于TA系统的研究还很缺乏,在西瓜噬酸菌中少有报道。本研究以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,对西瓜噬酸菌Aac5中hipA和hipB编码的TA系统进行了鉴定,对HipBA是否参与西瓜噬酸菌Aac5的胁迫耐受进行了探究。具体研究结果如下:1.西瓜噬酸菌Aac5中II型TA系统HipBA的鉴定通过生物信息学分析,在西瓜噬酸菌AAC00-1基因组中发现了一个假定TA系统HipBA,该系统与其他细菌物种中已验证的TA系统HipBA同源。将候选蛋白HipA在大肠杆菌中异源表达,发现了HipA对大肠杆菌的生长具有明显的抑制作用;通过共转录实验在转录水平上证明了基因hipA与hipB的开放阅读框位于同一m RNA上,即二者共转录;通过细菌双杂交实验证明了HipA与HipB在体内可以相互作用;凝胶阻滞(EMSA)实验表明了候选抗毒素蛋白HipB可以与自身启动子特异性结合。以上实验结果表明西瓜噬酸菌Aac5中存在一个II型TA系统HipBA。2.不同环境胁迫下西瓜噬酸菌Aac5中hipA与hipB的转录水平分析本研究通过检测西瓜噬酸菌Aac5在不同条件胁迫下hipA与hipB的转录水平变化,探讨TA系统HipBA是否响应应激胁迫。对目的基因hipA和hipB在不同pH和抗生素(氯霉素)压力下的生长能力和转录水平的变化进行测定。结果表明:p H和氯霉素胁迫后hipA与hipB的转录水平较未胁迫时有不同程度的上调或下调。表明TA系统HipBA在转录水平上响应了和p H和氯霉素胁迫。在西瓜噬酸菌Aac5侵染西瓜幼苗后,对Aac5中hipA与hipB的转录水平进行测定。实验结果表明,在病原菌-寄主互作过程中hipA与hipB被激活,证明TA系统HipBA会参与病原菌-寄主的应激反应。综上所述,本研究对西瓜噬酸菌中HipBA编码的TA系统进行鉴定,并对TA系统HipBA的生理功能进行了初步探究,丰富了对植物病原菌中HipBA TA系统的认识。

关键词：毒素-抗毒素系统西瓜噬酸菌 HipBA 功能探究

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假结核耶尔森氏菌中Phd-Doc毒素-抗毒素系统的鉴定和功能探索

假结核耶尔森氏菌中Phd-Doc毒素-抗毒素系统的鉴定和功能探索

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作者：杨昶杏西北农林科技大学

学位级别：硕士

毒素-抗毒素系统(Toxin-Antitoxin system,TAs)普遍存在于细菌和古菌的染色体和质粒上,该系统由两个共表达的基因组成,分别编码稳定的毒素和不稳定的抗毒素。毒素表达后通常能够影响细胞的重要生理过程,最终导致细胞生长停滞或者死亡,... 详细信息

毒素-抗毒素系统(Toxin-Antitoxin system,TAs)普遍存在于细菌和古菌的染色体和质粒上,该系统由两个共表达的基因组成,分别编码稳定的毒素和不稳定的抗毒素。毒素表达后通常能够影响细胞的重要生理过程,最终导致细胞生长停滞或者死亡,而抗毒素能够中和毒素的毒性从而对细菌起保护作用。TA系统通常被认为是细菌应激反应的基因模块,在细胞胁迫适应性、营养应激反应、细菌耐药性、抗生素耐受性、持留细胞(Persister Cells/Persisters)的形成等方面发挥重要作用。Phd-Doc TA系统属于Ⅱ型TA系统,其中Phd为抗毒素,Doc为毒素。它们最先作为成瘾模块(addiction module)存在于大肠杆菌噬菌体P1的质粒上。假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis,Yptb)是人畜共患肠道致病菌,也是微生物科学研究中的模式细菌。目前,Yptb TA系统在其胁迫耐受性中功能的相关报道较少。在本研究中,我们主要开展了YptbⅡ型Phd-Doc TA系统的鉴定和功能研究,探讨了Phd-Doc TA系统与Yptb胁迫耐受性之间的关系。具体研究内容及结果如下:***中Phd-Doc TA系统的鉴定生物信息学分析显示Yptb中Doc、Phd与噬菌体P1、大肠杆菌、噬菌体P7的Doc、Phd具有极高相似性。在大肠杆菌中异源表达Yptb毒素Doc能够引起大肠杆菌形态发生变化及生长抑制,该毒性可以被Yptb的抗毒素Phd中和。共转录实验和细菌双杂交实验结果表明:Yptb phd和doc共转录且其编码的两个蛋白在体内具有较强的相互作用。EMSA和β-半乳糖苷酶活性检测,表明抗毒素Phd能够与自身的启动子结合,且毒素的存在增强抗毒素与启动子的结合效果,从而抑制启动子活性。以上结果表明Yptb基因组上具有一对有活性的Ⅱ型Phd-Doc TA系统。***-Doc TA系统对Yptb生长特性的影响通过同源重组和质粒回补分别构建了doc毒素基因缺失突变菌株Δdoc,phd-doc基因缺失的突变菌株ΔphdΔdoc及相应的回补菌株CΔdoc,CΔphdΔdoc。测量野生型菌株Yptb、Δdoc及ΔphdΔdoc的生长曲线,结果表明phd-doc基因的缺失对Yptb自身的正常生长无影响。在野生型菌株Yptb及双缺突变菌株ΔphdΔdoc内过表达Doc,Doc毒素的过表达对Yptb的正常生长无影响。***-Doc TA系统对Yptb胁迫应激方面的影响为探讨Phd-Doc TA系统是否响应胁迫应激,在抗生素胁迫和氧胁迫压力下生长曲线及转录水平。结果表明:野生型菌株Yptb和突变体菌株Δdoc、ΔphdΔdoc生长无明显差异;但胁迫后抗毒素基因phd的转录水平较未胁迫的有不同程度的上升(1.5倍～2倍)。此外,经氯霉素胁迫后,抗毒素基因phd的转录水平显著提高(25倍～30倍),明显高于其他胁迫后的转录水平,表明Phd-Doc TA系统对氯霉素胁迫尤为敏感。因此,Yptb中Phd-Doc TA系统在转录水平上响应了抗生素胁迫和氧胁迫,其中对氯霉素胁迫最为敏感。***-Doc TA系统影响Yptb生物被膜的形成研究表明多数TA系统与细菌生物被膜形成相关。本研究通过在M9培养基中培养野生型菌株、突变菌株ΔphdΔdoc,并检测其生物被膜形成的能力。实验结果表明,在营养缺乏条件下,Phd-Doc TA系统的缺失可以减弱Yptb生物被膜的形成。综上所述,本研究在假结核耶尔森氏菌Yptb基因组上发现了一对有活性的Ⅱ型Phd-Doc TA系统,并对该TA系统的生理功能进行了初步探讨,丰富了对Phd-Doc TA系统的认识。

关键词：毒素-抗毒素系统 Phd-Doc 自体调控环境胁迫生物被膜

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铜绿假单胞菌PAO1毒素-抗毒素系统的预测及功能验证

铜绿假单胞菌PAO1毒素-抗毒素系统的预测及功能验证

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作者：苏国明广东医学院

学位级别：硕士

【目的】\n 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种重要的条件致病菌，是医院内感染最常见的病原菌之一，该菌具有较强的耐药性，其致病机理目前尚不完全明了。有文献报道PA持留现象与疾病复发和病程迁延有关，而细菌毒... 详细信息

【目的】\n 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种重要的条件致病菌，是医院内感染最常见的病原菌之一，该菌具有较强的耐药性，其致病机理目前尚不完全明了。有文献报道PA持留现象与疾病复发和病程迁延有关，而细菌毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）系统可介导细菌持留表型形成。本研究应用毒素-抗毒素数据库（Toxin-antitoxin database，TADB）在线工具，分析PA基因组DNA上Ⅱ型TA系统，构建pa0124/pa0125基因双表达载体A-T-pJS298，观察pa0124/pa0125基因选择性表达对大肠埃希菌BL21(DE3)生长的影响，探讨PA基因组上存在的TA系统，为研究TA系统介导PA持留表型形成机理奠定基础。\n 【方法】\n TADB为细菌、古细菌Ⅱ型TA系统在线预测工具，其根据已鉴定的TA系统编码基因保守序列和TA系统典型遗传特征进行预测，如2个基因紧密相连，所编码的蛋白相对分子质量都较小等。通过 TADB在线工具分析铜绿假单胞菌基因组DNA上可能存在的Ⅱ型TA系统，利用国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）网站上所提供的局域相似性比对（basic local alignment search tool，BLAST）对TA系统编码蛋白进行分析，进一步确定毒素蛋白、抗毒素蛋白。\n 采用双酶切法在 pJS298基础上构建 pa0124/pa0125基因双表达载体A-T-pJS298，测序鉴定后，将重组质粒 A-T-pJS298通过化学转化法导入大肠埃希菌BL21(DE3)中，然后，以含50μg/ml卡那霉素和0.2%葡萄糖的 LB平板筛选获得阳性细菌。分别挑取单菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养。次日按1:50的比例转接于含50μg/ml卡那霉素的的液体LB培养基中，于37℃振荡培养至OD600约为0.4，然后，取4支试管并编号为A、B、C、D，并取4 ml上述OD600约为0.4的菌液分别加入到4支试管，同时加入诱导剂IPTG（终浓度为1 mmol/L）或L-阿拉伯糖（0.2％），即A试管（IPTG-，L-阿拉伯糖-）两种诱导剂都不加，B试管（IPTG-，L-阿拉伯糖+）仅加入L-阿拉伯糖，C试管（IPTG+，L-阿拉伯糖-）仅加入IPTG，和D试管（IPTG+，L-阿拉伯糖+）同时加入IPTG和L-阿拉伯糖。于加入诱导剂后1，2，3，4，5，6，7小时分别吸取菌液测定记录OD600值，绘制大肠埃希菌生长曲线。\n 【结果】\n 1.用TADB在线工具分析出14对TA系统，其中4对预测的TA系统的评分>60％，即pa0124/pa0125、pa1030/pa1029、pa1878/pa1879和pa3270/pa3269。\n ***法和测序鉴定结果表明本课题在质粒pJS298的基础上成功构建pa0124/pa0125基因双表达载体。\n 3.在不加 IPTG和L-阿拉伯糖的（IPTG-，L-阿拉伯糖-）管或只加入 IPTG的（IPTG+，L-阿拉伯糖-）管的情况下，细菌能正常生长，生长曲线无明显改变；仅加入L-阿拉伯糖的（IPTG-，L-阿拉伯糖+）管，即加入诱导剂 L-阿拉伯糖诱导毒素蛋白 PA0124表达的细菌在约4 h后生长受到明显抑制，在加入阿拉伯糖4 h后OD600维持在1.5～2.0低值，生长曲线低平；而（IPTG+，L-阿拉伯糖+），即同时加入 IPTG和 L-阿拉伯糖诱导两种蛋白质表达的细菌生长无明显抑制，生长曲线接近正常水平。在加入诱导剂6 h时肉眼观察到（IPTG-，L-阿拉伯糖-）、（IPTG+，L-阿拉伯糖-）和（IPTG+，L-阿拉伯糖+）试管菌液浑浊程度无明显差异，而（IPTG-，L-阿拉伯糖+）试管中菌液的浑浊度较其他试管明显澄清，与生长曲线图相符。\n 【结论】\n 1.用 TADB在线工具分析出4对评分大于60%能的 TA系统，即pa0124/pa0125、pa1030/pa1029、pa1878/pa1879和pa3270/pa3269。\n 2.成功构建了基于质粒pJS298的pa0124/pa0125基因双表达载体A-T-pJS298。\n 3.铜绿假单胞菌的pa0124/pa0125基因可能是一对具有生物学活性的毒素-抗毒素系统。

关键词：铜绿假单胞菌毒素-抗毒素系统 pa0124/pa0125基因预测系统

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