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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌持留性细胞清除及毒素抗毒素系统分子靶点鉴定

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌持留性细胞清除及毒素抗毒素系统分子靶...

引用

作者： Gul Habib 中国科学技术大学

学位级别：博士

社区获得型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和医院获得型型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的出现使耐药性金黄色葡萄球菌的治疗更加困难。我们对金黄色葡萄球菌的耐药机制并不陌生,但抗性菌的带来的挑战日益严峻。金黄色葡萄球菌耐药菌株能产生许... 详细信息

社区获得型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和医院获得型型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的出现使耐药性金黄色葡萄球菌的治疗更加困难。我们对金黄色葡萄球菌的耐药机制并不陌生,但抗性菌的带来的挑战日益严峻。金黄色葡萄球菌耐药菌株能产生许多亚型细胞,其中一种并未获得遗传抗性但能通过休眠来抵御抗生素杀伤的亚型被称为持留性细胞。持留性是细胞具有的一种能抵御如抗生素杀伤、热休克等不利外界条件及多种压力条件的能力。目前对于如何缓解和加剧持留性细胞形成的研究甚少。典型的毒素-抗毒素（TA）系统是由毒素及其抗毒素组成的二元系统,TA系统预谋的或自发的参与到如转录、翻译、复制和其他一些未知的细胞行为。金黄色葡萄球菌作为葡萄球菌属中功能最多样化的种类含有很多TA系统,但只有很少的几种被定义。目前只有两种Ⅰ型和三种Ⅱ型TA系统被研究报道。金黄色葡萄球菌中TA系统功能呈多样性,但影响持留性细胞的形成的作用并未被报道。有研究证实,ATP消耗可以诱导金黄色葡萄球菌持留细胞的形成,但如何根治持留性细胞仍不清楚。本论文调研了金黄色葡萄球菌中的TA系统并鉴定了包括已知的3个TA系统在内的15个推定的TA系统。我们将他们分为两大类:在毒性岛上的TA系统和不在毒性岛上的TA系统。我们证明,MRSA菌株中在毒性岛上的TA系统具有细胞毒性,而不在毒性岛上的TA系统不具有该能力。除此之外,我们鉴定了一种新的三组分Ⅰ型TA系统,其毒素基因具有多种功能,毒素可以降低持留性细胞的形成。毒素的过表达使胞内状态受到威胁,抑制七型分泌系统核心组分EssC、多药耐药性外排泵NorA和钠离心逆转运蛋白系统的表达。此外,毒素蛋白可以靶向50S核糖体蛋白L17和L10并激活ClpP蛋白酶。ClpP蛋白酶是一种蛋白切割酶,作用于毒素蛋白。敲除毒素基因能上调持留性细胞的形成水平。毒素对细胞生产细胞毒性,抗毒素与之结合抵消毒素的毒性。在这个TA系统中有一个调节因子,在压力条件下上调毒素的表达。因此,该毒素-抗毒素-调控因子是一个新型的三组分Ⅰ型TA系统,可以降低金黄色葡萄球菌中持留性细胞的形成水平。

关键词：持留性细胞耐甲氧西林金黄色葡萄球菌毒素-抗毒素系统多重耐药性NorA 七型分泌系统

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2型猪链球菌89K毒力岛上毒素—抗毒素系统SezAT的发现与实验研究

2型猪链球菌89K毒力岛上毒素—抗毒素系统SezAT的发现与实验研究

引用

作者：王敏第三军医大学

学位级别：硕士

2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype2, S. suis2）是一种重要的人畜共患病病原体。S. suis2感染不仅可致猪的急性关节炎、脑膜炎、败血症、心内膜炎及急性死亡，并且可通过呼吸道和伤口等途径传播，导致人类的感染发病和死亡。... 详细信息

2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype2, S. suis2）是一种重要的人畜共患病病原体。S. suis2感染不仅可致猪的急性关节炎、脑膜炎、败血症、心内膜炎及急性死亡，并且可通过呼吸道和伤口等途径传播，导致人类的感染发病和死亡。科学家在丹麦发现并首次报道人感染S. suis2病例，随后在世界各地都有报道，但多为散发病例。然而，1998年和2005年我国江苏省和四川省分别暴发大规模S. suis2感染猪和人类疫情，病人中出现高比例的、国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征（streptococcal toxicshock syndrome, STSS），临床症状表现为急性高热、休克、全身多器官衰竭，病程短而凶险，致死率高，引发严重的公共卫生事件。为了对造成这两次暴发感染事件的S. suis2流行菌株的高致病性进行深入研究，我们课题组对1998年江苏分离的强致病株98HAH12和2005年四川分离的强致病株05ZYH33（两株均分离自STSS病人）进行了全基因组测序和功能注释，并与Sanger研究中心公布的标准株P1/7的全基因组序列进行比较，发现了我国分离的这两株测序菌株均含有一个89kb大小的具有毒力岛（pathogenicity island, PAI）特征的大片断，我们将这个特异性的片段命名为89K PAI。随后对89K PAI行生物信息学分析，发现89K PAI编码多个可能与致病相关的成分和结构，如二元信号转导系统（two-component signaltransduction system, TCS），Ⅳ型分泌样系统（type IV-like secretion system, T4SS-like）以及一个Zeta毒素等。我们通过实验证实了这个二元信号转导系统SalK/SalR参与了细菌的致病过程，而IV型样分泌系统则参与了STSS的形成。近期研究表明该毒力岛可以从宿主菌染色体上自发切离下来，并在染色体上形成类似质粒的环化分子，该环化分子可作为底物通过IV型样分泌系统介导转移至不含89K毒力岛的S. suis2受体菌中。我们试图通过各种诱导质粒消除的方法获得一株89K毒力岛缺失的S. suis2突变株，但始终未能成功。我们推测毒力岛上存在一个参与稳定作用的结构。进一步生物信息学分析发现89K毒力岛有一个与Epsilon-zeta（ε-ζ）同源的Ⅱ型毒素-抗毒素（type II toxin-antitoxin）系统，我们将其命名为SezAT（Streptococcus suis epsilon zeta）系统，其中SezA为抗毒素蛋白，SezT为毒素蛋白。近期研究发现TA系统可在细菌的一些可移动遗传元件中发挥稳定作用。因此，高致病性S. suis2的89K PAI编码的SezAT系统很可能参与到89K PAI的稳定机制当中。但生物信息学分析结果只能是提示，该TA系统是否具有生物学功能尚需实验验证。为此，本文旨在对89K PAI编码的SezAT系统行活性验证，并通过同源重组的方法对SezAT系统进行敲除，为下一步验证其功能和获得89K PAI缺失突变株奠定基础。具体实验内容和结果包括以下几个方面： 1. SezAT系统的生物信息学分析和RT-PCR验证：我们通过生物信息学分析发现，89K PAI的负链上05SSU0936（sezT）和05SSU0937（sezA）构成一对II型TA系统并与Epsilon-zeta （ε-ζ）同源，且两ORF有一个碱基对的重叠，提示两ORF共转录。为证实两ORF共转录，抽提S. suis2的总RNA行RT-PCR，结果证实两ORF共转录。 2. SezAT系统的活性分析：以05ZYH33基因组DNA为模板，分别扩增SezA和SezT编码基因的全长片段，分别插入双启动子表达质粒pJS298中，构建重组质粒pJS-AT。通过电转化的方法导入到大肠杆菌BL21（DE3），分别用一定浓度的诱导剂IPTG （终浓度为1mM）和L-阿拉伯糖（0.2%）诱导表达，同时设定不同时间点测定菌液的OD600值，绘制生长曲线。结果显示，单纯诱导表达毒素蛋白SezT可在短时间内迅速抑制细菌生长，而同时诱导表达抗毒素蛋白SezA可中和SezT的抑制作用，维持细菌正常生长。提示该SezAT系统构成一对有活性的TA系统。 3. SezAT系统基因敲除突变株的构建：以S. suis05ZYH33的基因组DNA为模板，设计特异性引物，PCR分别扩增sezT单基因和sezAT的左右臂（上下游片段）；同时以穿梭质粒pSET2的DNA为模板，PCR扩增壮观霉素抗性基因SpcR片段，分别将它们克隆到pUC18载体的多克隆位点上，构建成用于靶基因敲除的载体pUC::Se

关键词：毒素-抗毒素系统 2型猪链球菌高致病性毒力岛基因敲除

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金黄色葡萄球菌Ⅱ型毒素--抗毒素系统的分布和遗传特征

金黄色葡萄球菌Ⅱ型毒素--抗毒素系统的分布和遗传特征

引用

作者：徐洁郑州大学

学位级别：硕士

金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）是一类可引起人类多种感染性疾病的革兰氏阳性细菌，广泛存在于人和动物体内以及食品、养殖场等各种环境中，是诱发社区获得性和医院相关性菌血症的主要病原菌。Ⅱ型毒素-抗毒素系统(typeⅡToxin-Antitoxin... 详细信息

金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）是一类可引起人类多种感染性疾病的革兰氏阳性细菌，广泛存在于人和动物体内以及食品、养殖场等各种环境中，是诱发社区获得性和医院相关性菌血症的主要病原菌。Ⅱ型毒素-抗毒素系统(typeⅡToxin-Antitoxinsystem，Ⅱ-TAs)对细菌遗传物质的维持、生物膜形成、噬菌体抑制和应激管理具有重要作用。然而对于金葡菌基因组中Ⅱ-TAs的编码能力，尚缺乏系统研究。挖掘金葡菌中Ⅱ-TAs分布及遗传特征将为抗金葡菌药物的研发提供新靶标。　　目的　　1.识别金葡菌基因组中的Ⅱ-TAs并建立相关信息库，分析其序列特征对其进行归类，以阐明金葡菌中Ⅱ-TAs的多样性，为后续实验研究提供数据基础。　　2.比较分析Ⅱ-TAs在不同来源及不同分型金葡菌中的分布情况，挖掘Ⅱ-TAs在金葡菌中的分布特征。　　3.评估不同种类Ⅱ-TAs分布之间的相关性，对其邻域基因进行注释并结合其侧翼基因构建系统发育树，了解其遗传特征，以揭示Ⅱ-TAs在金葡菌中形成现有分布状态的进化过程。　　方法　　1.利用TAFinder、结构域识别以及人工检索对金葡菌全基因组中的Ⅱ-TAs进行预测识别，提取其序列信息构建成库:依据序列相似性对其归类分组并应用Expasy、SOPMA以及SWISS-MODEL预测Ⅱ-TAs序列的理化性质、二级结构和三级结构。　　2.基于管家基因构建金葡菌全基因组系统发育树并将注释得到的Ⅱ-TAs的分布信息映射到系统发育树中，表征Ⅱ-TAs在不同系统发育分支中的分布情况。　　3.利用Spearman秩相关系数以及Jaccard距离表征不同种类的Ⅱ-TAs是否倾向于同时出现;通过Pearson卡方检验比较不同种类Ⅱ-TAs是否与分离源、细菌分型存在显著关联;通过进一步计算卡方检验的标准残差阐明其分布情况;利用差异检验（t检验，ANOVA检验，Mann-WhitneyU检验，Kruskal-WallisH检验）判别不同类型TA的拷贝数是否存在显著差异。　　4.随机选取20个代表株，利用R软件将Ⅱ-TAs位点在金葡菌基因组中的位置进行可视化;通过Flag软件对其邻域基因进行注释并构建查询序列的系统发育树。　　结果　　1.金葡菌中Ⅱ-TAs的基本信息　　从NCBI数据库共收集621株金葡菌，其中在601(96.78％)株菌中识别到3923个Ⅱ-TAs。基于严格的序列比对阈值，可将其分为60个TAs组和19个单一的序列结构单元。基因组大小与TAs数量呈现显著的弱相关（r=0.3，P＜0.001）。Ⅱ-TA在染色体和质粒中的种类和数量分布均不相同，染色体中分布最多的TAs为PIN_HTH_1，而质粒中分布最多的TAs为COG3832_like_1。　　2.金葡菌中Ⅱ-TAs的序列特征　　抗毒素蛋白的分子量小于对应毒素蛋白，不稳定指数多高于对应毒素蛋白。金葡菌中毒素蛋白和抗毒素蛋白的氨基酸序列与已经报道的其他菌株中的序列均存在明显差异，但是其在金葡菌内部均高度保守。同一家族毒素蛋白的二级和三级结构会呈现较高的相似性。　　3.不同金葡菌中Ⅱ-TAs的分布特征　　(1)Ⅱ-TAs在金葡菌中广泛分布，部分Ⅱ-TAs在不同来源的金葡菌中的分布存在差异。PIN_HTH_1在亚洲来源的菌株中出现的概率高于其他几个区域来源的菌株（P＜0.05，z-score=2.1)，pfam12568_HTH、PIN-HTH1在畜类宿主来源菌株中出现的概率高于其他宿主来源菌株(P＜0.001，z-score=2.2;P＜0.001，z-score=3.1)。环境选择和水平基因转移似乎都参与了Ⅱ-TAs的扩散。　　(2)进一步对不同Ⅱ-TAs在金葡菌中的系统发育分布特征进行分析，发现几乎所有谱系的菌株都存在Ⅱ-TAs，但不同谱系菌株的Ⅱ-TAs编码能力不同。VapC_Xre_1在克隆谱系30(ClonalComplexes，CC)中的分布多于其他几个CC，COG2856_Xre_9存在于所有纳入的CC59菌株中，提示Ⅱ-TAs的转移获取可能在金葡菌克隆群的分化中发挥着重要作用。　　(3)耐甲氧西林金葡菌中的Ⅱ-TAs的数量要多于甲氧西林敏感金葡菌(P=0.024)。不同SCCmec型别菌株编码Ⅱ-TAs的种类存在明显差异。移动遗传元件SCCmec中编码的抗毒素基因要多于毒素基因（抗毒素:185;毒素:122）;不同类型的SCCmec元件中TAs的种类不同，Ⅱ型元件中TAs的携带率最高(94.29％);说明SCCmec元件与Ⅱ-TAs在金葡菌间的转移有关。　　4.金葡菌中Ⅱ-TAs的遗传特征　　多种Ⅱ-TAs之间存在正相关（r≥0.5，P＜0.05，Jaccard距离＜0.6）;具有正相关关系的Ⅱ-TAs在基因组中集中分布并保持一定的顺序，表明其相互之间可能存在相似或

关键词：毒素-抗毒素系统金黄色葡萄球菌水平基因转移遗传特征分布状态

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结核分枝杆菌中毒素——抗毒素系统的研究

结核分枝杆菌中毒素——抗毒素系统的研究

引用

作者：赵龙旋北京师范大学

学位级别：硕士

近年来研究表明，细菌染色体编码的毒素抗毒素系统参与不良条件下细菌生长调控，使细菌在应激条件下进入休眠状态而得到保护。典型的毒素抗毒素系统包含共表达的一对基因分别表达不稳定的抗毒素和稳定的毒素。目前研究得最深入的是***... 详细信息

近年来研究表明，细菌染色体编码的毒素抗毒素系统参与不良条件下细菌生长调控，使细菌在应激条件下进入休眠状态而得到保护。典型的毒素抗毒素系统包含共表达的一对基因分别表达不稳定的抗毒素和稳定的毒素。目前研究得最深入的是***染色体上的mazE-mazF系统。在正常状态下，毒素MazF与抗毒素MazE结合形成复合体。MazE和MazE-MazF复合体都能与MazEF启动子结合，自反馈抑制基因表达。在氨基酸缺乏的情况下，警报信号因子ppGpp合成增加，抑制了MazE-MazF基因的表达，MazE被蛋白酶降解，MazF得以发挥核糖核酸内切酶活性，通过降解mRNA抑制蛋白质合成，从而抑制细菌生长。　　结核分枝杆茵(Mycobacterium tuberculosis)基因组上存在多个mazF的同源基因。我们通过计算机序列分析，发现其中一个mazF同源基因Rv1991c与其上游一个开放读框Rv1991a可能组成一对典型的毒素-抗毒素系统。在***和耻垢分枝杆茵中诱导表达Rv1991c均能导致细菌生长抑制;而在表达Rv1991c的同时表达Rv1991a能使细菌生长正常，证明了Rv1991c和Rv1991a是一对毒素和抗毒素。经原核表达纯化获得Rv1991c和Rv1991a蛋白。两者经共同孵育后，在非变性电泳中可检测到复合体的条带。将复合体条带切下来进行变性电泳，显示出2条分别和Rv1991c和Rv1991a蛋白一样大小的条带。这些结果表明Rv1991a通过与Rv1991c形成蛋白复合体的形式来抑制Rv1991c的毒性。通过进一步体外实验发现，Rv1991c蛋白能切割人工合成的RNA底物，而加入Rv1991a蛋白能抑制该活性。我们还发现了Rv1991a的上游存在着一个99bp的有启动子活性的区域。Rv1991a蛋白和Rv1991a-Rv1991c复合体均能与上游启动子区DNA结合，这暗示了rv1991a-rv1991c系统存在可能的自反馈调控方式。通过定点突变Rv1991aN端高度保守的氨基酸残基（S25和R26）能使Rv1991a丧失结合启动子区DNA的能力。　　以上结果显示结核杆菌基因组上的rv1991a-rv1991c操纵子是一个典型的毒素抗毒素系统，其中Rv1991c是毒素蛋白，通过发挥其RNA内切酶活性来抑制细茵的生长;而Rv1991a蛋白是抗毒素，能与毒素直接形成复合体，从而中和Rv1991c的毒性。抗毒素和毒素-抗毒素复合体都能通过抗毒素N端与其上游的启动子区结合。但是rv1991a-rv1991c毒素-抗毒素系统在应激条件下的表达调控及其生理作用还有待深入研究。

关键词：毒素-抗毒素系统结核分枝杆菌细菌生长调控细菌程序性细胞死亡核糖核酸酶

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毒素—抗毒素系统介导细菌应激与持留菌形成的单细菌水平研究

毒素—抗毒素系统介导细菌应激与持留菌形成的单细菌水平研究

引用

作者：章苗苗厦门大学

学位级别：硕士

毒素—抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统几乎存在于所有环境微生物和众多致病微生物中。TA系统通常由同一启动子下的两个共转录基因组成,分别编码不稳定的抗毒素分子(蛋白或RNA)和稳定的毒素蛋白。TA系统调控细胞内多个重要的细胞过程,... 详细信息

毒素—抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统几乎存在于所有环境微生物和众多致病微生物中。TA系统通常由同一启动子下的两个共转录基因组成,分别编码不稳定的抗毒素分子(蛋白或RNA)和稳定的毒素蛋白。TA系统调控细胞内多个重要的细胞过程,如翻译、DNA复制、细胞壁合成等,并在协助细菌应对应激环境、耐受抗生素作用中发挥了重要作用。研究表明TA系统的异质性表达是细菌进入休眠状态形成小部分(占细菌群体的10-4-10-6)多药耐受持留菌的关键,对TA系统的表达与作用机制进行研究有望发现新的药物作用靶标,减少或者消除持留菌的形成,从而减少临床上的反复感染与慢性疾病,缓解严峻的细菌耐药形势。目前TA系统的研究主要在基因水平与转录水平,如:实时定量逆转录PCR、RNA印迹技术等。但是蛋白质是生物体中各种生理功能的主要执行者,TA系统主要在蛋白水平调控细菌的代谢,仅在转录水平分析TA系统将遗漏导致持留菌形成的关键因素。蛋白质印迹技术(western blot,WB)是蛋白水平常用的研究方法,但集权平均的研究方法会掩盖TA系统在细菌个体间的异质性表达,无法揭示少数细菌形成持留菌时TA系统的表达情况,也无法准确研究TA系统的作用机制。采用荧光显微镜在单细菌水平对TA系统进行分析受限于通量低而难以得到具有统计代表性的数据。因此建立一种快速、灵敏、高通量的对单个细菌内毒素与抗毒素蛋白进行同时分析的检测方法至关重要。本论文利用实验室自行研制的纳米流式检测装置(nano-flow cytometer,nFCM)高灵敏、多参数表征的优势,结合适用于活体标记的双砷染料一四半胱氨酸(FlAsH-TC)体系,发展了毒素与抗毒素的单细菌水平研究方法,发现抗毒素在细菌应激中的调控作用并探讨毒素抗毒素比例与持留菌的关系。本论文包括以下主要内容:第一章为文献综述,主要介绍TA系统在细菌应激反应、持留菌的形成中发挥的重要作用以及研究方法和研究现状,并阐述了本论文的选题思路和研究内容。第二章通过单细菌水平研究解析抗毒素蛋白在细菌应激中的调控作用。基于nFCM-TC-FlAsH体系,以MqsR/MqsATA系统为模型建立抗毒素蛋白与细菌生长同时检测的方法。我们首次发现天然启动子指导下的TA系统,在无环境压力时存在高表达与低表达MqsA抗毒素蛋白的两个细菌亚群。在环境压力如胆汁应激、热激和氨基酸饥饿条件下,这两个细菌亚群通过不同的反应来调控MqsA降解或表达。此外,我们发现MqsA抗毒素蛋白在氨基酸饥饿时先降解后重新增长。同时分析MqsA抗毒素蛋白与细菌生长,发现细菌生长在环境压力下的反应与MqsA抗毒素蛋白的表达一致,但反应时间滞后60 min。以上研究结果表明,MqsA的随机增加有助于细菌存活,并且两个不同表型的亚群使得细菌能够应对变化的环境。本章发展的方法将为TA系统的异质性分析提供先进的技术手段。第三章为单细菌水平毒素、抗毒素同时检测nFCM-TA-双荧光检测法的建立,T/A比例的获取及其与持留菌形成关系的探讨。基于nFCM-TC-FlAsH体系,我们在单细菌水平检测到天然启动子指导下微量表达的MqsR毒素蛋白。通过双砷染料对MqsR-TC毒素蛋白进行标记,免疫荧光技术对MqsA-His抗毒素蛋白进行标记,结合nFCM建立nFCM-TA-双荧光检测法,在单细菌水平实现低丰度毒素与抗毒素蛋白的同时检测。为了揭示T/A比例与持留菌的关系,通过利福平诱导持留菌形成,nFCM-TA-双荧光检测法对单个细菌内的毒素与抗毒素蛋白进行同时检测。我们发现利福平作用前存在MqsA高表达MqsR低表达和MqsA与MqsR均低表达的两个亚群,前者在利福平作用后消失。特别值得注意的是在利福平作用12h时出现了第三个亚群:MqsR高表达(是同时间MqsR低表达亚群的25倍)MqsA低表达的亚群,其比例随着利福平作用时间增加而增加,24h时达到24.7%。进一步结合nFCM-TC-FlAsH体系与非跨膜型核酸染料碘化丙啶(propidiumiodide,PI)对MqsR毒素蛋白的表达与细菌生理状态进行分析,发现高表达MqsR毒素蛋白的细菌PI信号强度介于死菌和活菌之间,共聚焦显微镜观察其形态与活菌无异,说明MqsR高表达MqsA低表达的亚群依然具有生物活性。结合持留比例分析,在利福平作用下细菌个体通过先降解MqsA抗毒素蛋白,后增加MqsR毒素蛋白的双重作用来不断增加T/A比例,从而协助细菌耐受高浓度抗生素的作用。论文第四章为总结与展望。总结本论文在TA系统调控细菌应激及持留菌形成中的工作,展望TA系统与细菌耐药及TA系统交互作用方面的研究。

关键词：毒素-抗毒素系统应激反应持留菌单细菌分析双砷染料-四半胱氨酸体系纳米流式

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单细菌水平毒素抗毒素系统研究新方法

单细菌水平毒素抗毒素系统研究新方法

引用

作者：宋毅怡厦门大学

学位级别：硕士

细菌的抗药性危害日益严重，毒素-抗毒素(TA)系统在细菌内的异质性表达是多药耐受性存留细胞形成的重要原因。阐明致病菌中毒素-抗毒素系统的作用机理和生理功能对研发防控致病菌的新策略和疾病诊断治疗等具有重要意义。目前，对TA系统... 详细信息

细菌的抗药性危害日益严重，毒素-抗毒素(TA)系统在细菌内的异质性表达是多药耐受性存留细胞形成的重要原因。阐明致病菌中毒素-抗毒素系统的作用机理和生理功能对研发防控致病菌的新策略和疾病诊断治疗等具有重要意义。目前，对TA系统的研究主要集中在基因水平或转录水平，而传统基于蛋白质水平的检测方法，如Western Blot等都是对大量细菌裂解液中的毒素抗毒素蛋白进行检测，是大量细菌内毒素抗毒素蛋白表现的集权平均。对单细菌水平的毒素-抗毒素蛋白进行快速逐一分析可揭示因集权平均而被掩盖的个体差异，有益于TA系统的异质性考察及亚类表征。　　本论文旨在将双砷染料-四半胱氨酸体系与免疫荧光技术联用，结合实验室自行研制的超高灵敏流式细胞仪（high sensitivity flow cytometry, HSFCM），通过对单细菌水平毒素和抗毒素的同时检测，发展TA系统研究新方法，建立单细菌水平毒素、抗毒素蛋白定量表征技术并考察各参数之间的相互关系;建立TA系统在不同应激条件下的超高灵敏检测模式，确定TA系统在诱发细菌程序性阻滞和程序性死亡中的作用;引入双质粒体系，考察Lon蛋白对TA系统调控的单细菌水平检测的可行性，为考察TA系统间交互作用并发展方便、快捷的毒素蛋白诱导因子筛选方法垫定基础。本研究发展了单细菌水平、原位、高通量、普适性的TA系统研究新方法，对揭示TA系统的作用机理和研究对抗致病菌及细菌耐药性的战略具有重要价值。　　论文第一章为文献综述。重点介绍了毒素抗毒素系统现有的研究方法和单细菌水平研究TA系统的重要性及超高灵敏流式检测装置在细菌检测中的应用。本章的最后介绍了本论文的选题思路和主要研究内容。　　论文第二章我们以MqsR/MqsA TA系统为研究对象，构建了毒素带TC标签和抗毒素带TC标签的重组体系。通过对染色方法、染色时间、染料浓度等的优化，经HSFCM检测，天然启动子下抗毒素及毒素带TC标签实验组与不带TC标签的阴性对照组的TC-FlAsH荧光信号可以明显区分，成功建立了TA-TC-FlAsH的单荧光检测体系，实现了对天然启动子下单细菌水平毒素蛋白和抗毒素蛋白的分别检测。通过对不同表达量TA系统的检测，确定了我们的方法能够灵敏检测出毒素蛋白和抗毒素蛋白含量的微小变化，为体系应用于应激条件下TA系统的含量检测提供了可行性验证。通过在实验室模拟氨基酸饥饿，异亮氨酸饥饿和热激等几种细菌常见的应激环境，结合HSFCM，建立了TA系统应激模式的TA-TC-FlAsH体系超高灵敏分析方法。对不同应激条件下MqsA蛋白的表达水平进行检测，结果表明抗毒素对不同的应激条件表现不同:氨基酸饥饿会促使抗毒素蛋白MqsA的降解，异亮氨酸饥饿下抗毒素MqsA的降解是一个可以恢复的过程，对热应激抗毒素MqsA表现不敏感。　　论文第三章为实现对单细菌水平毒素蛋白和抗毒素蛋白的同时检测，我们将TC序列和His-tag分别构建在毒素和抗毒素序列的末端使其融合表达，将双砷染料-四半胱氨酸标签体系与免疫荧光技术联用，结合HSFCM建立了单细菌水平天然启动子下毒素蛋白和抗毒素蛋白同时检测的双荧光超高灵敏分析法。利用双荧光分析方法对低拷贝数的天然启动子指导下的TA系统进行检测，同时带His-tag和TC-tag的实验组跟不带双标签的阴性对照组荧光信号的完全分离;对不同表达量的TA系统进行检测，验证了所建立的双荧光分析方法可以灵敏、准确地对单个细菌内毒素蛋白和抗毒素蛋白的微量变化进行双参数同时表征。　　论文第四章为建立单细菌水平TA系统调控模式的超高灵敏分析方法，我们进一步引入pBAD30-lon构建双质粒体系，通过诱导Lon蛋白酶来调控TA系统的表达，利用HSFCM对细菌进行快速地逐一检测分析，探究Lon蛋白酶调控下单细菌水平毒素蛋白和抗毒素蛋白相对含量的变化。结果表明，与正常生长条件下细菌表达的TA系统相比，Lon蛋白酶诱导表达的pT5-lac下的实验组，其抗毒素蛋白MqsA在Lon蛋白酶作用5-8 h的时候发生降解，而相应的毒素蛋白含量变化不大，单个细菌内毒素蛋白与抗毒素蛋白的相对比率上升;Lon蛋白酶诱导表达的天然启动子下的实验组，其抗毒素蛋白MqsA在Lon蛋白酶作用下含量变化不明显，相应的毒素蛋白含量随着Lon蛋白酶诱导时间延长而增加，单个细菌内毒素蛋白与抗毒素蛋白的相对比率上升。该实验成功验证了Lon蛋白对TA系统调控的单细菌水平检测的可行性。　　论文第五章为总结和展望。总结了本论文的研究工作和成果，并对未来进一步的研究工作进行了展望。

关键词：致病菌毒素-抗毒素系统免疫荧光技术双砷染料-四半胱氨酸体系超高灵敏流式细胞仪

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结核分枝杆菌毒素-抗毒素RelBE系统缺失突变株的构建与鉴定

结核分枝杆菌毒素-抗毒素RelBE系统缺失突变株的构建与鉴定

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第十三届全国免疫学学术大会

作者：袁俐谢婉莹申爱平石河子大学医学院

背景:伴随着HIV感染的流行、耐药菌株的出现及流动人口的增加,全球结核病形势急剧恶化。全球约20亿人曾受到结核分枝杆菌的感染。结核分枝杆菌的流行有地区差异,根据WHO调查报告显示,印度、印度尼西亚、中国、菲律宾和巴基斯坦等5个国... 详细信息

背景:伴随着HIV感染的流行、耐药菌株的出现及流动人口的增加,全球结核病形势急剧恶化。全球约20亿人曾受到结核分枝杆菌的感染。结核分枝杆菌的流行有地区差异,根据WHO调查报告显示,印度、印度尼西亚、中国、菲律宾和巴基斯坦等5个国家的结核病新发病例占56%。我国是全球22个结核病高负担国家之一,发病人数占全球的11%,居世界第三位。新疆是中国结核病发病率高的地区。毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system, TAS)最早发现于一些低拷贝的质粒,由两个共表达的基因组成,其中一个基因编码不稳定的抗毒素蛋白,另一个基因编码稳定的毒素蛋白,这一系统依赖抗毒素阻止活性毒素从亲和性的毒素-抗毒素蛋白复合物中释放出来。其中活性毒素可以导致细菌程序性细胞死亡,或者通过抑制细胞生长使得细菌在质粒水平恢复正常。Ramandeep Singh等对毒素-抗毒素RelBE系统进行研究,发现RelBE可以调控结核分枝杆菌的代谢,当毒素RelE表达量增多时细菌的代谢减慢,进而导致细菌的生长滞留,尤其是在抗结核药物存在时,毒素抗毒素在mRNA水平也发生了变化。目的 :构建与鉴定结核分枝杆菌毒素-抗毒素RelBE系统缺失株。方法 :首先以聚合酶链反应(PCR)分别从H37Rv标准株和PUC-19K质粒上扩增出目的基因RelBE的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因;然后应用融合PCR技术将目的基因RelBE的同源臂和kan基因进行杂交拼接,获得目的融合片段,将该融合片段克隆于pMD-19T (simple)载体形成自杀质粒pMD-19T-ΔrelBE-kan,并将自杀质粒分别转化至大肠杆菌DH5a中;最后利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv感受态细胞中;在卡那霉素抗性改良罗氏培养基上筛选出H37RvΔrelBE缺失突变株单个菌落,提取阳性菌株全基因组DNA为模板,PCR扩增克隆片段并测序,并对所获得H37RvΔrelBE缺失突变株进行遗传稳定性检测。结果 :获得H37RvΔrelBE缺失突变株,经传代15代后,再次测序,未发生回复性突变,即得到具有遗传稳定性的H37RvΔRelBE基因缺失株。结论 :成功构建成结核分枝杆菌毒素-抗毒素RelBE系统缺失株,为下一步研究结核分枝杆菌毒素-抗毒素RelBE基因的作用奠定基础。

关键词：结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统 relBE基因同源重组

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毒素-抗毒素对介导的Candida glycerinogenes基因编辑系统的构建及应用

毒素-抗毒素对介导的Candida glycerinogenes基因编辑系统的构建...

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作者：吕玟江南大学

学位级别：硕士

高效的基因编辑技术是研究酵母生理功能、分析代谢调控机理和构建基因工程菌株的基础。产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）是一株工业酵母,具有多重抗逆特性以及杰出的发酵性能,但该菌株因筛选标记较少、基因编辑效率低等问题,... 详细信息

高效的基因编辑技术是研究酵母生理功能、分析代谢调控机理和构建基因工程菌株的基础。产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）是一株工业酵母,具有多重抗逆特性以及杰出的发酵性能,但该菌株因筛选标记较少、基因编辑效率低等问题,限制了进行深层次的遗传修饰。细菌毒素-抗毒素系统因其分离后致死效应已被应用于多种遗传操作技术。本课题旨在从毒素-抗毒素系统中挖掘适用于***的低成本、稳定的筛选标记,构建高效的基因编辑系统,促进***在基因工程和代谢工程领域的研究,并为在其他非模式菌株中构建和优化基因编辑系统提供可参考的途径。主要研究内容包括: （1）为了精确控制毒素基因的表达,严格调控***的生长,筛选了各类***内源诱导型启动子表达来自Escherichia coli K12的毒素-抗毒素对rel BE、maz EF。发现在渗透压调控型启动子PSTL1的驱动下,rel BE毒素-抗毒素对能够有效调控***的生长。进一步将毒素基因rel E整合至基因组中多拷贝的5.8s r DNA位点,以此构建基因编辑系统宿主细胞。在进行基因组位点特异性整合时,将目的基因插入rel E位点;在编辑基因组任意位点时,将rel B克隆到修复模板或游离表达载体中,中和Rel E的毒性。（2）根据毒素插入失活和毒素中和策略分别构建整合和游离的基因编辑系统,对构建的基因编辑系统性能进行评估。评估基因组敲除、替换和整合的可行性,trp1和gpd基因的敲除效率分别为90%、68%,与常用的基于营养缺陷型标记的敲除系统相比,trp1敲除效率提高了3.5倍;trp1基因替换成报告基因gfp的替换效率为90%;整合gpd基因的反义序列的整合效率为100%。评估不同基因编辑系统中单链编辑菌株的回复突变率,使用rel BE对的菌株的回复突变率为3%,低于使用营养缺陷型标记的菌株。评估遗传稳定性,发现培养64代后,毒素基因表达盒、游离表达载体和整合表达载体的遗传稳定性良好;评估对生长和发酵性能的影响,与基于营养缺陷型标记的基因编辑系统相比,构建的基因编辑系统产生了更高的生物量和甘油产量。评估毒素蛋白Rel E的表达对Cas9的切割效率的影响,发现Rel E并没有降低Cas9的切割效率。（3）将构建的基因编辑系统在实际中进行应用,利用构建的基因编辑系统整合表达***中2-苯乙醇（2-Phenylethanol,2-PE）合成途径艾利希途径关键限速酶aro9和aro10,使2-PE产量达到3.94 g·L-1,整合表达抗逆基因元件hog1和slc1,使2-PE产量达到3.87 g·L-1,与野生型菌株相比产量分别增加了13.54%和11.53%;利用构建的基因编辑系统游离表达蛋白酶基因,使***中乙醇产量增加了4.14%-11.42%。

关键词：产甘油假丝酵母二倍体基因编辑系统毒素-抗毒素系统筛选标记

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鱼腥藻PCC7120染色体毒素—抗毒系统基因all2402/asl2401的研究

鱼腥藻PCC7120染色体毒素—抗毒系统基因all2402/asl2401的研究

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作者：刘炳君中南民族大学

学位级别：硕士

毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TAS)由两个共同表达的基因组成,其中一个编码不稳定的毒素蛋白,另外一个编码稳定的毒素蛋白。TA系统通过共同表达的基因产物的相互作用参与介导胁迫环境下的细胞生长抑制或者死亡的生理活动。毒... 详细信息

毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TAS)由两个共同表达的基因组成,其中一个编码不稳定的毒素蛋白,另外一个编码稳定的毒素蛋白。TA系统通过共同表达的基因产物的相互作用参与介导胁迫环境下的细胞生长抑制或者死亡的生理活动。毒素-抗毒素系统广泛存在于原核生物中,通过生物信息学分析,在已测序的原核生物中发现了671个可能的毒素-抗毒素位点,隶属于7个经典的毒素-抗毒素基因家族,分别是:ccdAB,relBE,parDE,higBA,mazEF,phd/doc和vapBC/vag。目前研究较多的是relBE和mazEF家族,正常生长条件下,relBE和mazEF连续合成毒素和过量的抗毒素,通过形成异源六聚体抑制毒素蛋白的毒性作用,而当细胞遭遇外界胁迫时,蛋白酶降解抗毒素并释放复合体中的毒素,通过毒素蛋白特异性地切割mRNA来阻断蛋白质的合成,从而引起细菌的生长抑制。本实验通过构建双启动子表达载体对鱼腥藻PCC7120染色体上一对基因asl2401和all2402进行研究,通过控制单独和同时诱导表达来分析毒素蛋白和抗毒素蛋白对细胞生长的影响,进而确定其蛋白产物的毒素-抗毒素作用。主要包括以下几方面的内容及结论:1)通过生物信息学分析基因asl2401和all2402的序列,对其编码产物、蛋白性质和高级结构的预测,进而确定他们所属的毒素-抗毒素基因家族是higBA,目前对该家族的TA系统研究较少,毒素作用机理不明确,因此本实验的研究对丰富TA系统有一定的作用。2)将基因asl2401和all2402分别单独构建克隆载体和表达载体,对其诱导表达,经SDS-PAGE检测后,看到抗毒素基因asl2401很容易构建成功且能够高效诱导表达,而毒素基因all2402的表达载体却很难构建,极少数构建成功后诱导蛋白的表达量不高。将构建成功的表达载体保存一段时间后测序显示无结果,推测毒素基因表达出了毒素蛋白而使细胞死亡,导致实验无法继续下去,因此构建双启动子诱导表达载体,以验证推测是否正确,从而进行下一步实验,确定目的基因在鱼腥藻PCC7120体内生理调控功能。3)将毒素基因all2402置于PBAD启动子之下,抗毒素基因asl2401置于PLAC启动子构建双启动子诱导表达载体,经诱导表达后,分析蛋白产物对细胞的毒素和抗毒素作用:毒素基因all2402在L-(+)-阿拉伯糖的诱导下产生毒素蛋白,对细胞产生毒素作用;抗毒素基因asl2401在L-(+)-阿拉伯糖和IPTG同时诱导下表达出抗毒素蛋白,与毒素蛋白相互作用后从而解除毒素蛋白的毒性,从而确定目的基因在鱼腥藻PCC7120体内生理调控功能。4)TA系统作为原核细胞应对营养缺乏时的调控机制,是对细菌代谢调控的重要补充;且目前我国湖泊和水库因为藻类爆发而污染,期待蓝细菌染色体上TA系统的研究也能够为环境中除藻提供思路。

关键词：鱼腥藻PCC7120 双启动子表达毒素-抗毒素系统基因对asl2401/all2402

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鱼腥藻PCC7120染色体Ⅱ型毒素—抗毒素基因对asr0757/alr0758的研究与鉴定

鱼腥藻PCC7120染色体Ⅱ型毒素—抗毒素基因对asr0757/alr0758的研...

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作者：陈洁中南民族大学

学位级别：硕士

蓝藻(Cyanophyceae)又可称为蓝细菌,是一种古老的原核生物,适应环境能力极强,大量繁殖时会引起水华污染环境。鱼腥藻PCC7120是引起水华现象的最主要的藻种之一,其内存在着大量的毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin systerm,TAS)基因。毒素... 详细信息

蓝藻(Cyanophyceae)又可称为蓝细菌,是一种古老的原核生物,适应环境能力极强,大量繁殖时会引起水华污染环境。鱼腥藻PCC7120是引起水华现象的最主要的藻种之一,其内存在着大量的毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin systerm,TAS)基因。毒素-抗毒素系统由两个具有重叠碱基序列的基因组成,毒素基因编码稳定的毒素蛋白,抗毒素基因编码不稳定的抗毒素蛋白,有研究表明,环境胁迫条件下,毒素蛋白作用于宿主细胞,导致其生长抑制或死亡。asr0757/alr0758位于鱼腥藻PCC7120的染色体上,经NCBI序列比对发现与大肠杆菌中的MazEF有较高的同源性,且具有相同遗传结构特征,预测asr0757/alr0758可能构成TAS,为研究asr0757/alr0758是否属于TAS并验证其生物学功能,本实验分为两大部分进行:1):根据NCBI上提供的asr0757和alr0758碱基序列设计特异性引物,经Touch-Down PCR扩增后回收目的片段,构建TA克隆,目的片段插入表达载体pET-30a后导入表达菌*** BL21中构建重组表达载体pET-30a-asr0757,pET-30a-alr0758,IPTG诱导蛋白表达,优化表达条件并对表达产物进行western blot鉴定,结果表明:asr0757与alr0758在37℃诱导6h,均成功诱导表达出了目的蛋asr0757(13.5KD)和alr0758(17.9KD),抗毒素表达量较好,毒素蛋白alr0758表达量较少,通过设置诱导时间梯度和IPTG浓度梯度优化毒素基因表达条件,优化结果显示:毒素基因alr0758在28℃,IPTG浓度为0.4mM,诱导10h时有最大表达量,蛋白纯化与western blot结果显示:诱导蛋白为目的蛋白。2):构建含asr0757/alr0758的双启动子表达载体,选择性诱导基因表达,并验证了其表达产物对细菌生长的影响,结果显示:成功诱导表达出了目的蛋白asr0757(13.5KD)和alr0758(17.9KD),当单独诱导asr0757基因表达时,细菌生长状况不受影响,单独诱导alr0758表达时细菌生长明显受到抑制,同时诱导asr0757和alr0758基因时细菌生长恢复正常,说明asr0757和alr0758构成具有生物功能的MazEF家族系统基因对,具有抗毒性与毒性功能。目前只有少数细菌的染色体上的TAS基因对是验证过的,本文的创新点在于:首次对asr0757/alr0758进行系统化的分析鉴定,验证了其是属于II型毒素-抗毒素系统,其后首次构建双启动子表达载体,通过诱导产物对宿主细胞生长影响验证其毒性与抗毒性作用。本实验结果为鱼腥藻染色体上其它预测基因的研究打下了基础,创造较好的研究条件,同时对于完善TA系统理论,补充发展其分子机制具有重要的理论意义。

关键词：鱼腥藻PCC7120 毒素-抗毒素系统 asr0757/alr0758 表达优化鉴定

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