检索结果-内蒙古大学图书馆

昆虫学报 2020年第2期63卷 174-180页

作者：李盼张洁岳玥陈红燕吴维魏太云贾东升福建农林大学植物保护学院福建省植物病毒学重点实验室福州350002 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所昆明650000

【目的】由电光叶蝉Recilia dorsalis传播的水稻条纹花叶病毒(rice stripe mosaic virus,RSMV)目前在我国华南稻区大面积发生并对水稻生产造成严重危害。本研究旨在明确RSMV对介体电光叶蝉生长繁殖及取食行为的影响。【方法】通过生物... 详细信息

【目的】由电光叶蝉Recilia dorsalis传播的水稻条纹花叶病毒(rice stripe mosaic virus,RSMV)目前在我国华南稻区大面积发生并对水稻生产造成严重危害。本研究旨在明确RSMV对介体电光叶蝉生长繁殖及取食行为的影响。【方法】通过生物学实验测定RSMV侵染后电光叶蝉的生长和生命表参数;利用刺吸电位(electrical penetration graph,EPG)技术比较携带和未携带RSMV的电光叶蝉成虫在健康水稻上的取食行为差异;采用Y型嗅觉仪测定电光叶蝉成虫对感染和未感染RSMV水稻的寄主选择倾向性。【结果】与无毒电光叶蝉相比,携带RSMV的电光叶蝉若虫发育历期延长,而若虫存活率、成虫羽化率、雌虫繁殖力和卵孵化率下降。无毒电光叶蝉成虫倾向于选择取食RSMV侵染的水稻,而带毒电光叶蝉成虫倾向于选择取食健康水稻。与无毒电光叶蝉相比,带毒电光叶蝉成虫取食健康水稻所产生的刺探波、障碍波和唾液分泌波次数和持续时间均显著增加,被动取食波和休息波次数减少但时间均延长。【结论】与无毒电光叶蝉相比,感染RSMV使带毒电光叶蝉若虫发育历期延长且不利于其种群的繁殖。RSMV通过调控介体电光叶蝉成虫的取食和寄主选择行为而有利于自身在寄主水稻间的传播。

关键词：电光叶蝉水稻条纹花叶病毒刺吸电位繁殖取食行为寄主选择行为

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水稻条纹花叶病毒侵染诱导的细胞自噬及其作用机理研究

水稻条纹花叶病毒侵染诱导的细胞自噬及其作用机理研究

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作者：黄秀琴华南农业大学

学位级别：博士

水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus,RSMV)是近年发现并鉴定的细胞质弹状病毒属暂定新种,由其引致的水稻条纹花叶病在我国华南局部地区流行成灾,且呈快速扩散为害的趋势。该病毒经电光叶蝉(Recilia dorsalis)以持久增殖型方式传... 详细信息

水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus,RSMV)是近年发现并鉴定的细胞质弹状病毒属暂定新种,由其引致的水稻条纹花叶病在我国华南局部地区流行成灾,且呈快速扩散为害的趋势。该病毒经电光叶蝉(Recilia dorsalis)以持久增殖型方式传播,侵染水稻后引起植株矮化、叶片黄色条纹和轻微扭曲、稻穗变小及籽粒空瘪等症状,严重影响稻谷产量。探析该病毒的致病机制进而研发相应的防控技术是目前生产上的迫切需求。细胞自噬作为一种高度保守的自我保护机制,主要功能是清除细胞质内折叠错误的蛋白、受损的细胞器以及外来的病原物等,通过自噬泡将这些物质运输至液泡或溶酶体进行降解和重新利用。自噬在植物应对病毒侵染的过程中发挥了重要作用,但在不同的寄主-病毒组合中,自噬反应对病毒侵染的作用存在差异,一些情况下可以帮助植物清除病毒,另一些情况下可以协助病毒在植物体内完成复制和侵染。为了解析RSMV的致病机理及水稻的应答机制,本研究运用细胞生物学和分子生物学等手段,揭示自噬在水稻应答RSMV侵染中的功能,取得如下研究结果:1、证实RSMV侵染可诱导水稻产生自噬反应。透射电镜下,可在受侵的水稻叶肉细胞中观察到具有双层膜结构的自噬体。激光共聚焦显微镜下,可在经自噬特异性荧光标记物MDC染色后的受侵水稻表皮细胞中观察到大量的自噬体。RSMV侵染后,水稻叶组织中多个自噬相关基因发生上调表达,包括ATG1c、ATG3a、ATG4a、ATG6a、ATG6b、ATG6c、ATG8c、ATG13a。2、发现自噬对RSMV的侵染和复制具有抑制作用。敲除自噬关键基因ATG10a后,感病植株体内病毒积累量显著增加;而外源施用自噬诱导剂AZD8055后,感病植株体内病毒含量显著减少。3、鉴定到RSMV编码的G蛋白为诱导水稻发生自噬反应的关键因子。通过在本氏烟草中瞬时表达RSMV各编码蛋白,筛选到该病毒G蛋白具有较强的自噬诱导活性。在水稻和本生烟中转基因过表达该蛋白均能诱导自噬发生并分别降低RSMV和PVX在植株中的积累量。4、筛选到与病毒G蛋白互作的水稻自噬相关蛋白。采用酵母双杂交试验、Bi FC试验和GST-Pull down技术,发现RSMV编码的G蛋白能与水稻中自噬相关的ATG1c及ATG6b蛋白发生直接互作,因ATG1c是自噬起始复合体中的关键蛋白,ATG6b是自噬成核所必需的关键因子,表明病毒G蛋白直接影响水稻自噬发生过程。5、明确了水稻ATG1c和ATG6b与RSMV-G蛋白的亚细胞定位及其互作结构域。水稻ATG1c和ATG6b与RSMV-G蛋白均定位于细胞质,病毒G蛋白与ATG1c的C端kinase associated domain互作,与ATG6b的N端NTD结构域互作。本研究揭示了RSMV的侵染能够诱导水稻产生自噬反应,病毒编码的G蛋白是诱导自噬的关键蛋白,G蛋白与水稻自噬关键组份ATG1c和ATG6b互作干扰自噬复合体的起始和成核,在水稻防御RSMV侵染的过程中,细胞自噬起到抑制病毒增殖的作用。这一研究有利于深入认识病毒与寄主植物之间的关系,为后续筛选抗病毒药物或培育抗病品种提供理论依据。

关键词：水稻条纹花叶病毒细胞自噬 G蛋白自噬相关基因

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水稻条纹花叶病毒侵染水稻引起的细胞病理学变化研究

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电子显微学报 2019年第2期38卷 139-143页

作者：刘传荷杨新伦璇周国辉黄吉雷华南农业大学测试中心广东广州510642 华南农业大学农学院广东广州510642

水稻条纹花叶病毒(RSMV)是近年在广东省发现的一种新的细胞质弹状病毒,对水稻生产有严重危害。用携带RSMV的电光叶蝉取食水稻幼苗,获得RSMV侵染的植株。被感染幼苗发育迟缓,叶片有黄色花叶。对病叶超微结构观察发现,病毒粒子首尾相连并... 详细信息

水稻条纹花叶病毒(RSMV)是近年在广东省发现的一种新的细胞质弹状病毒,对水稻生产有严重危害。用携带RSMV的电光叶蝉取食水稻幼苗,获得RSMV侵染的植株。被感染幼苗发育迟缓,叶片有黄色花叶。对病叶超微结构观察发现,病毒粒子首尾相连并集聚成晶状结构分布于细胞质中。细胞质中含有纤维状病毒基质,病毒在其中生成,部分排列成聚集体。成熟病毒粒子由内质网膜芽生,并聚集在扩大的内质网池中,还有病毒分布在核周腔中。部分叶绿体片层结构疏松并瓦解。此外,在叶片表皮细胞和维管束细胞中也发现RSMV侵染的细胞病理学特征。本研究在细胞病理学上证明RSMV对水稻的发育有严重危害。

关键词：水稻条纹花叶病毒细胞质弹状病毒水稻细胞病理学

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水稻条纹花叶病毒在介体电光叶蝉体内的侵染机制

水稻条纹花叶病毒在介体电光叶蝉体内的侵染机制

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作者：孙想福建农林大学

学位级别：硕士

水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus,RSMV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)胞质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)的一个新种,由半翅目的电光叶蝉(Recilia dorsalis)以持久增殖型方式传播,不经卵传播。持久增殖型病毒均需在介体昆... 详细信息

水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus,RSMV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)胞质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)的一个新种,由半翅目的电光叶蝉(Recilia dorsalis)以持久增殖型方式传播,不经卵传播。持久增殖型病毒均需在介体昆虫体内增殖扩散并突破介体昆虫体内的多重屏障才能有效传播。然而,由于RSMV是新报道的病毒,目前尚无关于RSMV与介体昆虫互作以及在介体昆虫体内增殖和扩散方面的研究报道。为此,本研究通过免疫荧光标记和透射电子显微镜技术较为系统地分析了 RSMV在电光叶蝉培养细胞和虫体内的侵染。首先,本论文通过免疫荧光标记技术明确了 RSMV的三个结构蛋白 Nucleoprotein(N)、Phosphoprotein(P)和 Matrix protein(M)在介体电光叶蝉培养细胞内的定位,蛋白N、P和M均定位于细胞质,细胞核内无分布。在细胞质内N和P可共定位形成颗粒状内含体,M主要以颗粒状围绕在P周围。免疫电镜发现,结构蛋白N的胶体金颗粒可以特异性标记在病毒粒体和内含体上,因此推测蛋白N和P形成的内含体结构即为病毒原质,且N和P蛋白为RSMV的病毒原质组分。常规电镜观察,发现RSMV首先会以胞吞的方式侵入介体电光叶蝉培养细胞,随后病毒粒体在细胞质内复制、装配、聚集,且主要以囊泡包裹的形式聚集,部分病毒粒体会分布在胞质膜上。随后,RSMV以出芽方式释放到细胞外,并聚集在细胞膜和细胞间隙处,随着病毒粒体在细胞间隙的运动,再次以胞吞方式侵入临近的新的健康介体细胞。其次,利用免疫荧光标记技术,研究了 RSMV在介体电光叶蝉体内侵染路径,发现RSMV随介体取食进入介体电光叶蝉消化道后,最先在滤室建立初侵染点,随后向滤室表面的肌肉层扩散,通过由滤室延伸出的肌肉悬带直接快速扩散至唾液腺。同时,RSMV从滤室向消化道其它组织、血淋巴和中枢神经系统扩散。为了系统地从微观层面观察RSMV侵染介体电光叶蝉的特点,本研究制作电光叶蝉消化系统(唾液腺、肠道)和中枢神经系统的常规电镜样品,通过超薄切片观察,发现RSMV侵染介体电光叶蝉消化系统时,病毒粒体倾向于侵染不同组织的表层,如滤室与前中肠之间的细胞间隙、肌肉悬带外层纤维结构、食道和唾液腺的肌肉层以及腺泡细胞膜。同时,RSMV在介体电光叶蝉体内的侵染具亲神经性,RSMV倾向于侵染中肠内神经结构、消化道肌肉层、肌肉悬带和中枢神经系统。RSMV在侵染介体电光叶蝉中枢神经系统时,主要分布在中枢神经系统外层的神经纤维丝、神经围膜、胶质细胞和轴突外“髓鞘”,在中枢神经系统的轴突内并未发现病毒粒体分布。表明RSMV在介体电光叶蝉中枢神经系统胶质层细胞内复制增殖后,直接经与脑部其它组织相连接的神经节扩散。RSMV侵染介体电光叶蝉消化系统和中枢神经系统各组织时,病毒粒体的形态存在一定的差异。如在中肠上皮细胞、唾液腺细胞质和中枢神经系统胶质细胞质内病毒粒体均为无包膜杆状。而在肌肉层、肌肉悬带、细胞质膜和胶质细胞螺旋形成“髓鞘”上,RSMV均为有包膜杆状病毒粒体。由此推测RSMV在细胞内增殖时均为无包膜,而在扩散过程中均为有包膜。综合以上研究,本论文初步明确了 RSMV在介体电光叶蝉体内的侵染路径,阐明了 RSMV在介体电光叶蝉消化系统和中枢神经系统的侵染特点和扩散方式,为进一步研究RSMV的传播机制奠定了基础。

关键词：水稻条纹花叶病毒电光叶蝉侵染路径中枢神经系统

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水稻条纹花叶病毒反向遗传学体系构建

水稻条纹花叶病毒反向遗传学体系构建

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作者：王郅怡华南农业大学

学位级别：硕士

水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus,RSMV)是弹状病毒科细胞质弹状病毒属(Cytorhabdovirus)新种,该病毒经电光叶蝉(Recilia dorsalis)以持久增殖方式进行传播,引致水稻产生叶片花叶或扭曲、分蘖增多、谷粒空瘪等症状。该病毒基... 详细信息

水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus,RSMV)是弹状病毒科细胞质弹状病毒属(Cytorhabdovirus)新种,该病毒经电光叶蝉(Recilia dorsalis)以持久增殖方式进行传播,引致水稻产生叶片花叶或扭曲、分蘖增多、谷粒空瘪等症状。该病毒基因组为一条负义单链RNA,一共编码7个蛋白。目前仅有少数植物负链病毒的反向遗传学体系被成功建立,且还未见水稻上负链病毒反向遗传学体系构建成功的报道,因此在该领域实现技术突破具有十分重要的意义。在本研究中,我们对RSMV的反向遗传学体系进行了构建,为今后深入探究该病毒致病机理以及提供水稻病毒载体系统打下了基础。主要取得如下结果: 1、构建得到分别基于RSMV基因组和反基因组的微型复制子(minireplicon,MR)系统(RSMV-g MR/ag MR)。该系统以p CB301载体为骨架,由双35S启动子驱动的病毒leader到N基因起始前的5′UTR片段、报告基因GFP片段、病毒NP基因之间的间隔区N 3′UTR-IS-P 5′UTR片段、报告基因m RFP片段以及病毒L基因尾部的3′UTR到trailer片段组成。两微型复制子系统均包括RSMV微型基因组、RSMV核心蛋白(N、P和L)以及RNA沉默抑制子p GD-VSRs(包含p19、Hc Pro和γb三个抑制子蛋白)。将该系统各组分共注射本氏烟后,均能检测到报告基因成功表达,表明所构建的两个MR系统能够正常运行,并且发现基于反基因组的ag MR表达水平更高。 2、证实RSMV的最小侵染单位是RNP核心复合物。RSMV的MR系统完整表达需要MR与核心蛋白(N、P和L)以及RNA沉默抑制子p GD-VSRs共同参与。同时发现MR系统中无论缺失何组分,MR的第一个报告基因均能够直接表达,推测可能是第一个表达框能够瞬时表达。进一步探究发现,将MR系统中第一个报告基因替换回RSMV的N基因,并与其他组分共注射烟草,Western-blot和共聚焦显微镜可检测到N蛋白的表达,能够支持MR系统的正常运行。 3、获得RSMV基因组全长12774 nt的c DNA克隆。利用分段扩增的策略,成功获得了覆盖RSMV全长基因组的四个c DNA片段,并利用“酵母-大肠杆菌-农杆菌”三元穿梭载体快速拼接得到RSMV全长c DNA克隆。 4、构建得到基于g RNA和ag RNA的带GFP报告基因(插入在N和P基因之间)的RSMV全长侵染性克隆(g RSMV/ag RSMV-GFP)。两侵染性克隆中包含:病毒基因组全长转录载体与病毒核心蛋白表达载体p GD-NPL(表达病毒N、P和L核心蛋白)以及RNA沉默抑制子表达载体p GD-VSRs(表达沉默抑制子p19、Hc Pro和γb蛋白)。三个载体共注射本氏烟,RT-q PCR检测发现,基于ag RNA的RSMV侵染性克隆ag RSMV-GFP能够高效表达病毒各基因,且各基因的表达水平符合弹状病毒梯度转录的特性;而基于g RNA的RSMV侵染性克隆g RSMV-GFP表达能力弱,推测可能是病毒基因组复制所需的时间更长。后期利用双链RNA检测证实,基于RSMV反基因组的侵染性克隆ag RSMV-GFP侵染的本氏烟细胞中存在病毒复制中间体ds RNA。对注射ag RSMV-GFP侵染性克隆的烟草进行持续观察发现,该侵染性克隆只能在注射叶中进行复制和表达,不能系统侵染。此外,共注射混合液中缺少N、P和L三个蛋白,RSMV基因组无法表达,证实RSMV全长侵染性克隆的表达必须由病毒核心蛋白的支持。 5、探究了RSMV基因组承载外源基因的能力。装载RFP报告基因的RSMV全长c DNA侵染性克隆共注射本氏烟草后,受侵细胞可表达RFP荧光,但表达强度不高,表明侵染性克隆可驱动较大的外源基因的表达,但表达活性尚有待改进提高。综上所述,本研究首次构建得到了RSMV的微型复制子系统和全长侵染性克隆,并成功将其在本氏烟上进行表达。该结果为在水稻上构建RSMV反向遗传学体系奠定了良好的基础,且为研究该病毒各基因及水稻基因的功能提供了新的手段。

关键词：水稻条纹花叶病毒反向遗传学植物负链病毒微型复制子侵染性克隆

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水稻条纹花叶病毒调控寄主m6A修饰系统的功能研究

水稻条纹花叶病毒调控寄主m6A修饰系统的功能研究

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作者：曹雪华南农业大学

学位级别：硕士

水稻条纹花叶病毒（Rice stripe mosaic virus,RSMV）是2015年在我国广东罗定发现的一种水稻病毒新种,属于单链负义RNA病毒细胞质弹状病毒属。水稻染病后植株矮化,叶片上可见黄色条纹,穗发育不良,严重时可导致空粒,严重影响水稻生产。因... 详细信息

水稻条纹花叶病毒（Rice stripe mosaic virus,RSMV）是2015年在我国广东罗定发现的一种水稻病毒新种,属于单链负义RNA病毒细胞质弹状病毒属。水稻染病后植株矮化,叶片上可见黄色条纹,穗发育不良,严重时可导致空粒,严重影响水稻生产。因此,探究RSMV侵染水稻的致病机理具有重要的科学意义和实际意义。目前已知真核生物的RNA上存在多种化学修饰,N6-甲基腺嘌呤（m6A）是其中存在最广泛、最重要的修饰,对mRNA的稳定性、翻译、加工和出核等方面有着重要的影响。有研究表明,哺乳动物在受到病毒侵染后,宿主会利用自身甲基化修饰相关蛋白对病毒RNA上的m6A修饰水平进行调控,从而影响病毒对宿主的侵染。本论文从水稻受到RSMV侵染后m6A修饰水平的变化入手,通过分子生物学、生物化学、遗传学等技术手段探究m6A修饰在病毒侵染过程中的作用。取得如下研究结果: 1、发现受RSMV侵染的水稻mRNA上m6A修饰在腺嘌呤上的比例显著提高。在RSMV侵染30天时,提取水稻叶片mRNA,并将其酶解为单核苷酸,通过UPLC-MS分析四种核苷酸和m6A的含量,发现感病水稻mRNA的m6A丰度显著高于健康对照。 2、RSMV侵染调控水稻m6A修饰系统相关基因的表达。在病毒侵染的前期,相较于同时期的健康水稻,感病水稻四个m6A修饰相关的甲基转移酶Os MTA1、Os MTA2、Os MTA3、Os MTA4,两个去甲基酶Os ALKBH9B、Os ALKBH10B和一个m6A修饰特异性识别蛋白Os ECT的表达量均显著上调;而到了侵染后期,两个m6A去甲基酶的表达量下调;除了Os MTA3显著上调外,其余三个水稻m6A水稻甲基转移酶表达量与健康水稻相比并无差异。 3、构建了水稻m6A修饰系统相关基因的突变体和过表达植株。利用CRISPR/Cas9技术获得了osmta1、osmta2、osmta3、osalkbh9b、osalkbh10b五个基因的纯和突变体植株。其中osalkbh10b的纯和突变体相较于野生型水稻,表现出明显的植株矮小,穗发育不良且抽穗延迟,籽粒无法灌浆、空瘪,千粒重也显著减少的表型。而osmta4经过多次尝试均无法获得纯合突变体植株,表明Os MTA4在水稻发育过程中具有不可或缺的作用。因此,进一步构建了Os MTA4和Os ALKBH10B的过表达水稻,用于后续的实验。上述结果表明水稻m6A水平的稳态关系着植株的正常生长和开花结实。 4、RSMV在已获得的m6A修饰系统相关基因突变体水稻上的侵染没有明显差异。在RSMV侵染osmta1、osmta2、osmta3突变体水稻15天和30天时,提取水稻叶片总蛋白,通过Western Blot检测RSMV编码的N蛋白积累量,发现与野生型相比没有显著差异。 5、RSMV编码的G蛋白与水稻Os MTA4互作。酵母双杂交筛选发现,病毒的G蛋白可与水稻主要的m6A甲基转移酶Os MTA4蛋白互作,随后采用Bi FC和Pull-Down进一步验证了两者间的互作,且该互作发生在细胞质和细胞核核膜上。实验室前期已获得DEX诱导表达G蛋白的转基因水稻,通过DEX诱导后获得高表达G蛋白的水稻植株,提取mRNA后利用UPLC-MS进行m6A的含量分析,发现与对照相比,病毒G蛋白的表达会显著降低水稻转录本中m6A的丰度,暗示G蛋白可能影响Os MTA4的功能。 6、G蛋白的表达能抑制水稻m6A修饰相关基因的表达量。在由DEX诱导表达病毒G蛋白的转基因水稻中,通过q RT-PCR检测m6A修饰相关基因的表达量,发现与对照相比,Os MTA1、Os MTA2、Os MTA3、Os MTA4、Os ECT和Os ALKBH9B等基因的表达量都显著下调。 7、不同水稻品种的mRNA上m6A修饰水平受RSMV侵染的影响存在差异。通过UPLC-MS分析了华南稻区主栽水稻品种在RSMV侵染时m6A的修饰水平变化,其中象牙占、黄华占、Y两优911和野香优莉丝这四个品种水稻在RSMV侵染20 dpi时,其mRNA m6A水平显著提高,而日本晴、美香占和软华优911在病毒侵染20 dpi时,其mRNA m6A水平未发生显著变化。综上所述,本研究基于RSMV侵染影响水稻mRNA的m6A修饰水平这一现象,对病毒与水稻m6A修饰系统间的互作关系进行探索,发现了病毒编码的G蛋白通过与水稻主要的m6A甲基转移酶Os MTA4互作来调控宿主mRNA的甲基化水平,从而影响寄主水稻对RSMV侵染的防御能力,为研究水稻的抗病性和病害的绿色科学防控提供了新的思路。

关键词：水稻条纹花叶病毒 N6-甲基腺嘌呤 RNA表观修饰蛋白互作抗病性

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水稻条纹花叶病毒编码的RNA沉默抑制子的功能分析

水稻条纹花叶病毒编码的RNA沉默抑制子的功能分析

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作者：陈栋福建农林大学

学位级别：硕士

在植物中，RNA沉默（RNA silencing）是植物抵御病毒侵染的重要策略。在植物与病毒的长期共进化过程中，植物病毒编码一个或多个病毒沉默抑制子（Viral suppressor of RNA silencing，VSR）来抑制植物基因沉默促进病毒侵染或致病。因此... 详细信息

在植物中，RNA沉默（RNA silencing）是植物抵御病毒侵染的重要策略。在植物与病毒的长期共进化过程中，植物病毒编码一个或多个病毒沉默抑制子（Viral suppressor of RNA silencing，VSR）来抑制植物基因沉默促进病毒侵染或致病。因此，研究植物的抗病毒RNA沉默和病毒的沉默抑制过程成为全面了解植物与病毒互作的重要环节。水稻条纹花叶病毒（Rice stripe mosaic virus，RSMV）于2015年在中国广东省罗定县首次发现，随后该病害在中国的广西和海南等地有零星发生。RSMV是弹状病毒科（Rhabdoviridae）细胞质型弹状病毒属（Cytorhabdovirus）的新成员，由介体昆虫电光叶蝉（Recilia dorsalis）以持久增殖型方式传播。RSMV感染的水稻病株呈现轻微的矮化，叶片呈现黄色条纹、花叶和叶尖扭曲等症状。截至目前，关于RSMV编码的病毒沉默抑制子鉴定及其功能尚不清楚。　　为了明确RSMV编码的RNA沉默抑制子及其功能，本研究利用农杆菌介导的烟草瞬时表达法，将RSMV编码的六个蛋白与绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的农杆菌共注射16C烟草叶片，通过观察GFP荧光信号的积累，确定了RSMV编码的基质蛋白（Matrix protein，M）具有弱的沉默抑制子活性。另外，通过酵母双杂交、亚细胞共定位、双分子荧光互补实验证明M与水稻内源基因沉默抑制子3（Rice Suppressor of gene silencing3，OsSGS3）存在互作。进一步研究发现，在水稻中转基因过表达M并不改变OsSGS3的mRNA积累量，然而利用烟草瞬时表达系统，发现M能够通过泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径影响OsSGS3蛋白的稳定性。其次，利用马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）异源病毒表达系统中表达M能够增强PVX的致病性。最后通过水稻遗传转化体系获得M的过表达转基因水稻，结果显示M过表达引起一定程度的水稻的植株矮化、分蘖增多等类似于RSMV侵染水稻后的病害症状的表型。以上研究结果表明，M具有弱的沉默抑制子活性，它可能通过抑制OsSGS3的蛋白稳定性发挥病毒沉默抑制作用，同时，PVX异源表达和水稻遗传学证据也证实M可能在RSMV致病过程中发挥功能。　　RSMV目前在中国并没有大面积的爆发危害，但其对水稻产量潜在威胁却是存在的，因此鉴定RSMV编码的沉默抑制子及其功能有助于全面理解水稻与病毒间的防御与反防御过程，从而为深入解析病毒致病和水稻抗病毒过程提供线索，对于辅助抗病毒分子育种具有重要意义。

关键词：水稻条纹花叶病毒基因编码基质蛋白 RNA沉默抑制子

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病毒新种—水稻条纹花叶病毒鉴定及介体传毒特征研究

病毒新种—水稻条纹花叶病毒鉴定及介体传毒特征研究

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作者：杨新华南农业大学

学位级别：博士

水稻是我国乃至世界的重要主粮作物之一,而病毒病的发生对东南亚水稻生产构成了严重威胁。在我国华南稻区,多种病毒病常常混合发生,其大面积的爆发流行,对我国水稻产量造成了严重损失。病毒检测是病害测报和防控的技术基础。本研究建立... 详细信息

水稻是我国乃至世界的重要主粮作物之一,而病毒病的发生对东南亚水稻生产构成了严重威胁。在我国华南稻区,多种病毒病常常混合发生,其大面积的爆发流行,对我国水稻产量造成了严重损失。病毒检测是病害测报和防控的技术基础。本研究建立了同时检测华南稻区4种常见水稻病毒的多重RT-PCR检测体系,利用该技术监测了华南稻区病毒病的发生情况;在田间调查中发现了一种新的水稻病毒病,进而对该新病害的病原进行了鉴定,并着重研究了该病毒传播介体种类及其传毒特征,并初步鉴定了该病毒编码的RNA沉默抑制子。本文的主要研究结果如下:1.明确了华南稻区4种主要病毒(SRBSDV、RRSV、RGDV和RBSDV)的分布特点及发生情况。本研究根据4种病毒基因组特点,设计并筛选了针对不同病毒的特异性引物,并建立了多重RT-PCR检测方法。基于该方法,对2013-2015年间采自华南稻区的582个疑似病样进行了检测,检测结果表明,上述4种病毒在华南稻区均有分布,其中以RGDV为主,检出率为36.08%,随后依次为RRSV、SRBSDV和RBSDV,各占检测样品数的34.02%、30.07%和0.515%。进一步分析发现,4种病毒在华南稻区的分布存在明显的地理差异,海南南部以RRSV为主,广东西南部及东北部以RGDV为主,其它地区以SRBSDV为主,RBSDV仅在广西北部地区有发生。2.发现并鉴定了一种新的水稻病毒:水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus,RSMV)。田间调查及人工接种观察揭示,该病毒引致水稻病害的症状主要表现为植株轻度矮化、叶片黄色条纹或花叶、部分叶片叶尖扭曲、抽穗不完整和籽粒空瘪。超薄切片电镜观察显示,感病水稻叶肉组织细胞质中存在大量具有包膜的杆状病毒粒体,其长300–375 nm,宽45–55 nm(n=50)。利用小RNA测序和RT-PCR技术获得了病毒全基因组序列,该病毒基因组为负义单链RNA,正义链编码7个ORFs,依次为N、P、P3、M、G、P6和L基因。对纯化的病毒粒体进行蛋白序列分析,结果表明N、P、M、G和L蛋白为病毒结构蛋白。进一步以病毒N、G和L基因编码产物氨基酸序列构建的进化树分析,结果显示该病毒为弹状病毒科细胞质弹状病毒属的一个新种,与CBDaV亲缘关系较近。该病毒可经电光叶蝉传播,自然条件下可侵染马唐草和鸭舌草。该病毒目前在广东西南部发生为害,部分田块病株率高达70%以上,对水稻造成了严重的产量损失。3.明确了新病毒介体电光叶蝉的传毒特性。研究显示,无毒电光叶蝉成虫和若虫在病株上取食3 min后,就能获毒,且带毒率为19.2%(10/52)和24.4%(10/41)。成虫取食5 min、10 min和30 min,带毒率相差不大,分别为28%(14/50)、25.9%(14/54)和29.3%(12/41);若虫取食5 min和10 min的带毒率差异不大,分别为36.4%(12/33)和32.7%(17/52),但取食30 min后,带毒率明显升高,为45%(18/40)。成虫和若虫取食1 h后,带毒率分别达到了40.4%(21/52)和50%(15/30);而取食3 h后,介体带毒率明显提高,且若虫带毒率(66.7%)高于成虫(58.9%)。带毒电光叶蝉成虫和若虫,在健康稻苗上取食3 min、5 min和10 min,均不能使健康稻苗感病;取食30 min,可致5%(1/20)和15%(3/20)稻苗感病;取食1 h后,稻苗感病率分别达50%(12/24)和57.1%(16/28)。RSMV在虫体内的最短循回期为6天,最长的为18天,多数为10–16天,个体间差异显著。部分介体在病毒渡过循回期后,在生命结束之前可以持续带毒并传毒;部分带毒介体在传毒过程中存在间歇性,不传毒的间歇期最短为2天,最长为6天;少数带毒介体在死亡前不能传毒。4.初步鉴定RSMV编码的P蛋白为RNA沉默抑制子。本文克隆了RSMV编码的6个基因全长序列(L基因除外),分别构建了植物表达载体,并转化农杆菌EHA105,与GFP表达载体共浸润转基因16c本氏烟。结果显示,RSMV编码的P蛋白具有较弱的局部抑制RNA沉默和延缓系统RNA沉默的活性。本研究从病毒监测开始,明确了华南稻区主要病毒的发生情况及分布特点,为深入研究病害的发生规律及优化病害测报和防控技术体系提供了基础资料。RSMV的发现和鉴定及其介体传毒特征的研究,不但揭示了植物病毒在自然界中的多样性,而且及时发现了水稻新病原,为研发防控措施确保粮食生产安全打下了基础。

关键词：水稻病毒病毒检测多重RT-PCR 水稻条纹花叶病毒电光叶蝉传毒特征 RNA沉默抑制子

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水稻条纹花叶病毒在介体电光叶蝉体内的侵染

水稻条纹花叶病毒在介体电光叶蝉体内的侵染

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中国植物病理学会2017年学术年会

作者：孙想贾东升赵萍毛倩卓吴维魏太云福建农林大学植物病毒研究所福建省植物病毒学重点实验室

水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus,RSMV),属于弹状病毒科质型弹状病毒属的一个新种,由半翅目的电光叶蝉以持久增殖型方式传播。持久增殖型病毒均需在介体昆虫体内增殖扩散才能被有效传播。然而,由于RSMV是新发现的病毒,其在... 详细信息

水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus,RSMV),属于弹状病毒科质型弹状病毒属的一个新种,由半翅目的电光叶蝉以持久增殖型方式传播。持久增殖型病毒均需在介体昆虫体内增殖扩散才能被有效传播。然而,由于RSMV是新发现的病毒,其在介体电光叶蝉内的侵染机制和传播特性尚不清楚。为此,本研究通过免疫荧光标记技术系统地分析了RSMV在电光叶蝉体内的侵染途径,明确RSMV首先侵染电光叶蝉滤室上皮细胞,增殖后即向细胞表面扩散,同时侵染前中肠。随后病毒可通过链接滤室表面和唾液腺的连接线扩散到唾液腺,同时处于叶蝉胸下神经中枢也会被病毒侵染。通过电镜切片观察发现,RSMV病毒粒子在介体电光叶蝉脑组织和消化系统(唾液腺、滤室、前中肠)内大量聚集,且病毒粒子的形态存在一定的差异。其病毒粒子在昆虫体内主要存在有包膜和无包膜两种形态,其长度可达50～600nm不等。RSMV病毒粒子在电光叶蝉唾液腺内腔规则排列,几乎铺满整个唾液腺内腔,且多为有包膜的病毒粒体,长度约为200～300nm。而在脑组织和中肠内,病毒粒子倾向于在特异性膜结构上分布,且多为无包膜形态,病毒粒体长度差异较大,最长可达600nm,最短仅有50～60nm。综合以上研究,本课题初步明确了RSMV在介体电光叶蝉体内的侵染途径,为进一步研究RSMV的传播机制奠定了基础。

关键词：水稻条纹花叶病毒电光叶蝉侵染途径

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水稻条纹花叶病毒编码结构蛋白的抗体制备与检测

水稻条纹花叶病毒编码结构蛋白的抗体制备与检测

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中国植物病理学会2017年学术年会

作者：赵萍贾东升郭剑光魏太云福建农林大学植物病毒研究所福建省植物病毒学重点实验室

水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus,RSMV),属于弹状病毒科质型弹状病毒属的一个新种,由电光叶蝉以持久增殖型方式传播。该病毒共编码2个非结构蛋白P3和P6,以及5个结构蛋白:核衣壳蛋白(N)、糖蛋白(G)、核糖核酸聚合酶(L)、磷酸... 详细信息

水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic virus,RSMV),属于弹状病毒科质型弹状病毒属的一个新种,由电光叶蝉以持久增殖型方式传播。该病毒共编码2个非结构蛋白P3和P6,以及5个结构蛋白:核衣壳蛋白(N)、糖蛋白(G)、核糖核酸聚合酶(L)、磷酸化蛋白(P)和基质蛋白(M)。由于是2017年首次报道的新病毒,目前对该病毒由介体昆虫传播的机制尚不清楚。为了便于研究RSMV在介体昆虫体内的侵染机制,本研究首先通过原核表达N、P、M、G蛋白,并免疫注射小鼠制备了N、P、M、G蛋白的多克隆抗体。通过Western blot检测,N、P、M、G蛋白均可在RSMV侵染的昆虫体内检测到特异性蛋白条带。随后对抗血清进行纯化,并交联荧光素。通过免疫荧光标记检测RSMV侵染的电光叶蝉消化道组织,共聚焦显微镜观察发现N、P抗体可特异性标记电光叶蝉消化道内的病毒,表明N和P抗体可用于昆虫体内病毒的免疫荧光标记检测;而M和G抗体不能特异性标记RSMV编码的蛋白,相关抗体仍需改变方法进行重新制备。针对N和P抗体,笔者通过免疫荧光标记方法对实验室饲毒条件下电光叶蝉的带毒率进行检测,发现饲毒后6天的电光叶蝉带毒率高达60%以上,RT-PCR方法也验证了该检测结果。综合以上研究结果,本研究制备的N和P抗体可用于检测病毒在介体昆虫体内的分布,并可用于昆虫带毒率的检测,为解析RSMV与介体昆虫间的互作机制和病害田间检测奠定了基础。

关键词：水稻条纹花叶病毒抗体制备 Western blot检测免疫荧光标记检测

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