检索结果-内蒙古大学图书馆

水稻白叶枯病菌转录调控因子基因fleQxoo和σ^54因子基因rpoNxoo的分子鉴定

植物病理学报 2008年第5期38卷 449-455页

作者：张静许景升吴茂森何晨阳中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas ***,简称Xoo)鞭毛生物合成及运动性的调控机理,本研究首先通过基因克隆、序列分析、缺失突变及表型测定,对转录调控因子fleQxoo和编码σ54因子的基因rpoNxoo进行了分子鉴定。通过基因特异性扩增,成... 详细信息

为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas ***,简称Xoo)鞭毛生物合成及运动性的调控机理,本研究首先通过基因克隆、序列分析、缺失突变及表型测定,对转录调控因子fleQxoo和编码σ54因子的基因rpoNxoo进行了分子鉴定。通过基因特异性扩增,成功地从Xoo菌株PXO99A中克隆了fleQxoo和rpoNxoo。其基因序列与其它黄单胞病原菌中的同源序列高度保守。FleQxoo是NtrC家族激活蛋白成员之一,具有与σ54作用的结构域和DNA结合保守结构域(HTH)。用标记交换法构建了△fleQxoo和△rpoNxoo基因缺失突变体。与PXO99A相比,△fleQxoo和△rpoNxoo鞭毛产生能力丧失,运动性减弱,基因互补可以使之恢复;但其胞外纤维素酶和木聚糖酶活性以及对烟草叶片组织的致敏性无明显改变。因此,FleQxoo和σ54主要参与了鞭毛生物合成及其运动性的调控。

关键词：水稻白叶枯病菌 FleQxoo σ^54 调控鞭毛运动性

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水稻白叶枯病菌harpin基因的克隆与表达

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植物病理学报 2001年第4期31卷 295-300页

作者：闻伟刚王金生南京农业大学植物保护学院

利用 PCR方法从水稻黄单胞菌白叶枯致病变种 (Xanthomonas oryzae ***,Xoo) Jxo III菌株中克隆到编码诱导植物过敏性反应激发子的基因 hrf A。同源性比较发现其推测产物与水稻白叶枯病菌菲律宾小种 Pxo86的 Hpa1有 97.2 %的序列一致性 ,... 详细信息

利用 PCR方法从水稻黄单胞菌白叶枯致病变种 (Xanthomonas oryzae ***,Xoo) Jxo III菌株中克隆到编码诱导植物过敏性反应激发子的基因 hrf A。同源性比较发现其推测产物与水稻白叶枯病菌菲律宾小种 Pxo86的 Hpa1有 97.2 %的序列一致性 ,比 Hpa1少了一个 - GGG- GG-氨基酸残基序列重复。基因经 Nde I和 Bam HI双酶切后连到含 T7启动子的高表达载体 p ET30 a(+ )上构建重组质粒 p HRF4 ,并转化宿主菌 BL2 1(DE3)产生表达菌株 BL HR4。经过 IPTG诱导之后 ,BL HR4产生一分子量为 15 .6k D的蛋白质。研究表明 ,该蛋白在性质与功能上类似于其它已发现的 harpins,即能够在烟草上引起典型的过敏性反应 ,富含甘氨酸、热稳定以及对蛋白酶敏感。因此 ,我们把该蛋白定名为 harpin Xoo。harpin Xoo还具有诱导植物抗病性的功能。

关键词：水稻白叶枯病菌过敏性反应 hrfA harpinxoo 诱导抗病性基因克隆

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水稻白叶枯病菌内源过氧化氢在细胞分裂周期中的时空定位变化

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中国农业科学 2012年第8期45卷 1499-1504页

作者：李欣李鑫玲庞新跃朱文学樊金玲罗磊杜琳王娜王利平河南科技大学食品与生物工程学院中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室河南科技大学医学技术与工程学院

【目的】分析细菌内源过氧化氢在细胞分裂周期中的时空变化,探讨细菌增殖中过氧化氢的生理功能。【方法】采用组织化学法通过透射电子显微镜技术观察水稻白叶枯病菌内源过氧化氢的积累位置。【结果】不同菌株内源过氧化氢水平不同,在细... 详细信息

【目的】分析细菌内源过氧化氢在细胞分裂周期中的时空变化,探讨细菌增殖中过氧化氢的生理功能。【方法】采用组织化学法通过透射电子显微镜技术观察水稻白叶枯病菌内源过氧化氢的积累位置。【结果】不同菌株内源过氧化氢水平不同,在细菌的整个细胞分裂周期中观察到过氧化氢在细胞壁上的积累水平维持稳定,在多个菌株的细胞分裂过程中,除细胞壁之外,还在2个新的位点(类间体结构和核区)出现过氧化氢的大量积累,表现出数量和空间定位的显著变化。【结论】在多个水稻白叶枯病菌菌株中发现胞内额外的大量过氧化氢积累和定位与细胞分裂的进程密切相关,这种过氧化氢的时空变化很可能是细菌分裂时的普遍现象。推测过氧化氢应在细菌增殖中具有重要作用。

关键词：细胞分裂过氧化氢定位类间体结构核区水稻白叶枯病菌

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水稻白叶枯病菌室内链霉素抗性菌株的诱导及其抗性分子机制和风险评价

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农药学学报 2013年第1期15卷 43-51页

作者：徐颖祝晓芬周明国南京农业大学植物保护学院南京210095 上海市园林科学研究所上海200232

通过紫外光照射诱导获得了6株水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae ***抗链霉素突变体。测得链霉素对水稻白叶枯病菌敏感菌株ZJ173及其抗性突变体的最低抑制浓度(MIC)分别为0.10和600μg/mL;对敏感菌株的有效抑制中浓度(EC50)为0.03μg/mL... 详细信息

通过紫外光照射诱导获得了6株水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae ***抗链霉素突变体。测得链霉素对水稻白叶枯病菌敏感菌株ZJ173及其抗性突变体的最低抑制浓度(MIC)分别为0.10和600μg/mL;对敏感菌株的有效抑制中浓度(EC50)为0.03μg/mL,对抗性菌株的平均EC50值为11.64μg/mL,平均抗性倍数为388。通过PCR扩增了敏感菌株ZJ173及5株抗性菌株的rpsL基因(编码S12核糖体蛋白)和rrs基因(编码16S rRNA),并检测了strA基因是否存在。序列分析表明,5株被测抗性菌株的rpsL基因均发生了突变,其中4株在氨基酸43位、1株在88位,均由赖氨酸突变为精氨酸,而rrs基因未发生突变,strA基因未被检测到。表明实验室诱导获得的水稻白叶枯病菌抗性菌株对链霉素的抗药性是由rpsL基因突变引起的。抗性风险研究表明,抗性突变体的抗药性在无药剂压力下可稳定保持,其致病性、生长速率与敏感菌株相比无明显差异,竞争性低于或略低于敏感菌株,抗性自发突变率较高,且抗性突变为单一位点突变,病害循环为多循环,因此由rpsL基因突变引起的水稻白叶枯病菌对链霉素的抗性风险较高。

关键词：水稻白叶枯病菌链霉素诱导抗性 rpsL基因抗性风险

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水稻白叶枯病菌毒性表达的负调控因子PXO02944的分子鉴定

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中国农业科学 2014年第13期47卷 2563-2570页

作者：李潇桐杨凤环梁士敏田芳陈华民何晨阳中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室

【目的】水稻黄单胞水稻致病变种(Xanthomonas oryzae ***,简称Xoo)侵染引起水稻白叶枯病,在侵染过程中Xoo可产生胞外多糖(EPS)、胞外酶、黏附因子、T3SS以及其产生的效应因子等毒性因子。细菌第二信使环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)的水平在Xo... 详细信息

【目的】水稻黄单胞水稻致病变种(Xanthomonas oryzae ***,简称Xoo)侵染引起水稻白叶枯病,在侵染过程中Xoo可产生胞外多糖(EPS)、胞外酶、黏附因子、T3SS以及其产生的效应因子等毒性因子。细菌第二信使环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)的水平在Xoo毒性调控中发挥了重要的作用,而PXO2944是包含REC、GGDEF和EAL结构域的蛋白,是c-di-GMP信号蛋白家族的成员,研究旨在阐明水稻白叶枯病菌的环鸟苷二磷酸信号蛋白家族成员PXO2944的基因结构和功能。【方法】根据PXO2944基因序列信息,以PXO99A基因组DNA为模板,设计引物扩增PXO2944基因全长,将其GGDEF结构域和EAL结构域分别与已经报道的保守的GGDEF结构域或EAL结构域蛋白进行氨基酸序列比对分析;分别扩增PXO2944左右臂片段,将其与目的载体pK18mobsacB载体连接,得到质粒pK2944,将pK2944与pMD-GmR载体回收获得的GmR基因片段进行连接,获得重组质粒pK2944-GmR,用于构建基因突变体。将PXO2944全长基因克隆到载体pHM1上,获得重组质粒pHM1-2944并转化到ΔPXO2944中,即获得互补菌株ΔPXO2944::C。对野生型菌株、突变体和互补菌株进行表型测定,分析PXO2944基因缺失突变对Xoo致病性和EPS产生、生物膜形成、胞外酶活性和鞭毛运动性的影响,并通过qRT-PCR方法测定EPS合成基因和毒性相关基因的表达。【结果】用特异性引物进行PCR扩增,成功地从野生型菌株PXO99A中克隆了PXO2944;生物信息学分析发现,PXO2944蛋白具有磷酸化信号接收的REC输入结构域和GGDEF、EAL输出结构域,但GGDEF和EAL结构域保守序列发生了突变。与野生型菌株PXO99A相比,虽然PXO2944突变体胞外纤维素酶和木聚糖酶活性、鞭毛运动性都无明显变化,但其对水稻的致病性、EPS产生和生物膜形成能力显著增强,T3SS调控基因hrpG和EPS合成基因gumG的转录水平也明显升高。【结论】应答调控因子PXO2944负调控了水稻白叶枯病菌致病性、EPS产生和生物膜形成这些毒性因子的表达。

关键词：水稻白叶枯病菌 c-di-GMP信号毒性表达应答调控因子

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水稻白叶枯病菌HD-GYP结构域蛋白PXO_03945的功能鉴定

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植物病理学报 2017年第5期47卷 605-611页

作者：钱珊珊杨凤环田芳陈华民何晨阳中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

为了揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ***,简称Xoo)环二鸟苷酸(c-di-GMP)信号相关蛋白PXO_03945的生物学功能,本研究通过基因同源重组和无标记交换,对PXO_03945基因进行了缺失突变,对野生型、突变体和互补菌株进行表型测定,分析... 详细信息

为了揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ***,简称Xoo)环二鸟苷酸(c-di-GMP)信号相关蛋白PXO_03945的生物学功能,本研究通过基因同源重组和无标记交换,对PXO_03945基因进行了缺失突变,对野生型、突变体和互补菌株进行表型测定,分析该基因缺失突变对病菌胞内c-di-GMP水平、致病性、运动性、胞外多糖产生和生物膜形成的影响。结果表明,PXO_03945蛋白具有参与c-di-GMP降解的磷酸二酯酶(PDE)的HD-GYP结构域和功能未知的DUF3391结构域。全长基因缺失可导致体内c-di-GMP浓度明显上升。与野生型相比,ΔPXO_03945对水稻品种日本晴的致病性显著下降,而游动性增强,胞外多糖产生和生物膜形成增加。基因互补可以使之恢复。因此,HD-GYP结构域蛋白PXO_03945可能通过降解胞内c-di-GMP,正向调控了致病性,负向调控了运动性、EPS产生和生物膜形成能力。

关键词：水稻白叶枯病菌环二鸟苷酸 HD—GYP结构域磷酸二酯酶功能鉴定

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水稻白叶枯病菌c-di-GMP受体Clpxoo关键结合功能位点的确定

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生物技术通报 2016年第12期32卷 124-129页

作者：李建宇李波陈华民杨凤环何晨阳田芳中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

旨在确定水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)c-di-GMP信号受体Clpxoo的关键功能位点。通过对Clpxoo蛋白氨基酸位点基因突变,表达载体构建、蛋白诱导表达及其Ni-NTA Resin亲和层析,进行了Clpxoo及其点突变蛋白的原核表达和产物... 详细信息

旨在确定水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)c-di-GMP信号受体Clpxoo的关键功能位点。通过对Clpxoo蛋白氨基酸位点基因突变,表达载体构建、蛋白诱导表达及其Ni-NTA Resin亲和层析,进行了Clpxoo及其点突变蛋白的原核表达和产物纯化;通过等温滴定量热法(ITC),检测了Clpxoo及其点突变蛋白与c-di-GMP的结合作用。利用基因定点突变和桥接PCR方法,在优化的诱导表达和纯化条件下,成功地获得了Clpxoo点突变蛋白和与c-di-GMP不发生结合的Clpxoo点突变体。结果表明,Clpxoo蛋白第70位天冬氨酸和第99位谷氨酸是与c-di-GMP结合的关键功能位点。

关键词：水稻白叶枯病菌 c-di-GMP 信号受体蛋白点突变体结合作用

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水稻白叶枯病菌两个sRNA靶向Ⅲ型分泌系统发挥毒性作用

水稻白叶枯病菌两个sRNA靶向Ⅲ型分泌系统发挥毒性作用

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作者：胡逸群南京农业大学

学位级别：博士

水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pathovar oryzae,Xoo）是稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）的两个变种之一,可引起水稻白叶枯病并导致水稻严重减产。细菌非编码小RNA（Small non-coding RNA,sRNA）作为一类重要的转录后调控因子,... 详细信息

水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pathovar oryzae,Xoo）是稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）的两个变种之一,可引起水稻白叶枯病并导致水稻严重减产。细菌非编码小RNA（Small non-coding RNA,sRNA）作为一类重要的转录后调控因子,可直接或间接调控动物和植物病原细菌的多种功能。近年来,动物病原细菌中毒性或致病性相关的sRNA被陆续鉴定且功能研究较为透彻,而植物病原细菌中的相关研究较少。本研究针对水稻白叶枯病菌PX099A的致病相关sRNA做了三方面的研究工作。首先在全基因组水平上筛选鉴定到两个毒性sRNA trans217和trans3287;其次预测并验证sRNA trans217的直接靶标为编码Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ Secretion System,T3SS）装置蛋白的hrpD1基因,且sRNA trans217正调控其表达;最后对野生型与sRNA trans217缺失突变体进行转录组测序揭示毒性sRNA trans217的调控网络。为全面研究Xoo PXO99A菌株全基因组范围内的sRNA,分别收集基本培养条件（PSA培养基）和hrp基因簇诱导培养条件（XOM2培养基）下的细菌菌体,提取总RNA并进行高通量测序。分析测序结果以获得sRNA的数量和基因组分布信息,构建PXO99A的sRNA文库。在PX099A基因组中共鉴定到601个sRNA,根据其编码区域及其在基因组中的位置信息,分为顺式（cis-）和反式（trans-）两类,其中cis-sRNA个数337个,trans-sRNA个数264个。基于sRNA在两种培养条件下的表达水平差异,筛选出12个候选的毒性sRNA。通过定量分析验证高通量测序数据的可靠性,并确证候选sRNA的差异表达。对候选sRNA分别产生sRNA序列缺失突变体菌株并进行水稻致病性和烟草过敏反应测定,明确sRNA trans217和trans3287是PXO99A的两个毒性sRNA,对调控寄主致病性和非寄主过敏反应有重要作用。为研究毒性sRNA与T3SS之间有无调控关系,以T3SS关键组分hrpG和hrpX为指示基因,在野生型和sRNA突变体菌株中定量分析其表达量,结果表明毒性sRNA能够调控T3SS的表达。为进一步分析sRNA与效应子泌出的关系,将T3SS效应子PthXol与标签腺苷酸环化酶Cya融合后转入野生型和sRNA相关菌株以检测PthXo1的泌出,结果表明sRNA trans217和trans3287分别缺失后均影响PthXo1的正常泌出,证明毒性sRNA trans217和trans3287通过调控T3SS并阻断效应子泌出而调控细菌毒性功能。靶标鉴定是sRNA功能研究的重要内容。通过在线平台TargetRNA2预测sRNA trans217的靶基因,初步分析确定编码T3SS装置蛋白的hrpD1是sRNA trans217的直接靶标。应用绿色荧光报告系统证明hrpD1是trans217直接靶标,将sRNA克隆到高拷贝载体pZK001,将靶基因克隆到带有gfp报告基因的低拷贝载体pXG-10SF,两载体共同转化大肠杆菌以分析两者是否存在调控关系,结果表明,转录水平上sRNA trans217正调控hrpD1的表达,蛋白水平上sRNA trans217诱导靶基因翻译产物HrpD1的积累。体内实验进一步检测这一调控关系,定量实验和Northern杂交检测sRNA trans217存在与否对hrpD1 mRNA表达量的影响,结果显示,野生型菌株的hrpD1表达量总是显著高于sRNA trans217突变体菌株,证明体内条件下sRNA trans217在转录水平正调控靶标mRNA的表达。为检测蛋白水平的表达,构建HrpD1与HA标签融合的相关菌株,Western杂交检测HrpD1蛋白表达量,结果并未检测到体内条件下sRNA trans217诱导HrpD1的蛋白积累。Hfq蛋白作为多数sRNA的伴侣分子,为验证sRNA trans217是否为Hfq依赖型sRNA,构建了hfq基因缺失突变体菌株,表型实验表明hfq基因对细菌的正常生长和水稻上的致病力无明显贡献,Northern杂交结果表明hfq基因的缺失不会使sRNA trans217表达量有明显变化,表明sRNA trans217的正常表达不依赖Hfq蛋白。上述研究结果均表明sRNA trans217作为毒性sRNA,对水稻白叶枯病菌PXO99A的正常功能有重要作用,为全面揭示sRNA trans217的调控网络,委托公司测定野生型及sRNA trans217缺失突变体在PSA和XOM2中的基因差异表达。转录组测序发现,sRNA trans217缺失突变后,在普通培养条件下引起6

关键词：水稻白叶枯病菌 trans217 trans3287 毒性sRNA 靶基因hrpD1 伴侣蛋白Hfq 转录组

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水稻白叶枯病菌HrpF_(Xoo)与GFP的体外融合表达

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江苏农业学报 2008年第4期24卷 410-413页

作者：刘红霞陈德峰刘凤权董汉松南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开发实验室江苏南京210095

从水稻白叶枯病菌中克隆hrpF基因,hrpF与gfp(Green fluorescent protein)基因融合,连接pET30a(+)载体,构建重组质粒pET30a(+)::hrpFXoo::gfp,转化宿主菌BL21(DE3)产生表达菌株pOFG。表达菌株经IPTG诱导培养,获得了HrpF的GFP融合蛋白。收集菌体通过超声波破碎后,分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳,可见116 300大小的组氨酸标记的HrpF与GFP的融合蛋白条带,与分析软件推测大小一致。该研究结果将促进HrpF蛋白功能研究。

关键词：水稻白叶枯病菌 HrpF GFP 融合蛋白体外表达

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水稻白叶枯病菌拮抗细菌B56菌株的拮抗活性研究

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 1999年第6期25卷 573-577页

作者：阮红陈卫良谌晓曦傅恩军李德葆浙江大学生物技术研究所浙江杭州310029

B56 菌株经30 ℃振荡培养去菌体,其上清液经2 m ol/L 硫酸铵沉淀获得对水稻白叶枯病菌有拮抗活性的初提液。该初提液具有耐热性,经一定强度热处理后仍保持强的抑菌能力;抑菌效果在pH3～9 之间无明显差异;用胰蛋白酶、蛋白酶K 等处理后... 详细信息

B56 菌株经30 ℃振荡培养去菌体,其上清液经2 m ol/L 硫酸铵沉淀获得对水稻白叶枯病菌有拮抗活性的初提液。该初提液具有耐热性,经一定强度热处理后仍保持强的抑菌能力;抑菌效果在pH3～9 之间无明显差异;用胰蛋白酶、蛋白酶K 等处理后拮抗活性无明显变化。利用PhenylSepharose CL-4B疏水色谱柱和DEAE-Sephacel阴离子交换柱分离B56 菌株初提液, 得到一个具有拮抗活性的洗脱峰。该洗脱峰经SDS-PAGE检测发现具有一条分子量约为36 kD 的蛋白带。质粒提取和检测发现B56菌株存在一个稳定的内源质粒。

关键词：水稻白叶枯病菌枯草杆菌拮抗活性内源质粒

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