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3 篇 克隆
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7 篇 湖南农业大学
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作者

24 篇 刘凤权
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15 篇 邹丽芳
12 篇 陈功友
12 篇 孙伟波
9 篇 姬广海
8 篇 袁高庆
8 篇 黎起秦
8 篇 何勇强
8 篇 林纬
8 篇 廖晓兰
8 篇 杨瑞环
8 篇 陈贤
7 篇 黎芳靖
7 篇 丁新华
6 篇 张德涛
6 篇 舒灿伟
6 篇 苏品
6 篇 周而勋
6 篇 魏昌英

语言

205 篇 中文

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排序：

水稻细菌性条斑病菌中群体感应信号途径中三个相关基因的功能分析

水稻细菌性条斑病菌中群体感应信号途径中三个相关基因的功能分析

引用

作者：刘春晖南京农业大学

学位级别：硕士

水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)包括两个致病变种,分别是水稻白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae、简称Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola,简称Xoc),二者分别在水稻(Oryza sativa)上引起白叶枯病和细菌性条斑病。目前... 详细信息

水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)包括两个致病变种,分别是水稻白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae、简称Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola,简称Xoc),二者分别在水稻(Oryza sativa)上引起白叶枯病和细菌性条斑病。目前,细菌性条斑病已严重威胁到热带和亚热带地区的水稻种植。依赖可扩散信号分子(diffusible signal factor, DSF)的群体感应(Quorum sensing, QS)系统是黄单胞属细菌生物学功能全局性调控网络的重要组成部分,在群体水平上调控病原菌的毒性因子表达、生物膜形成等重要生物学功能。目前已有研究证明,DSF信号分子合成和传导与rpf基因簇及全局性调控转录因子Clp密切相关,在野油菜黄单胞菌(X. campestris pv campestris,简称Xcc)中,其转录调控系统还包括受Clp调控的两个转录因子TetR家族的FhrR和锌吸收调控蛋Zur (zinc uptake regulator). 本研究目的在于阐明XXoc中,群体感应信号途径中类似于调控因子FhrR和Zur的两个基因fhrR、zur以及天冬酰胺合成酶基因(asparagine synthetase B,asnB)的生物学功能,以及利用实时荧光定量PCR的方法,分析这些基因在群体感系统中的调控地位。 1.通过PCR扩增的方法从Rs105基因组中克隆到fhrR、zur基因,并证实二者在基因组中均为单拷贝。采用同源重组的方法,构建fhrR、zur的缺失突变体及其互补菌株。测定突变体及互补菌株的菌体形态、运动性、致病性和对过氧化氢的耐受性等多种表型;为进一步明确fhrR、zur两个调控因子在群体感应调控体系中的地位,利用实验室已有菌株(ΔrpfF和Δclp)构建过表达菌株,并通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)的方法探明fhrR、zur在各菌株转录表达水平。与野生型菌株相比,fhrR、zur缺失突变体的生长能力并未受到明显影响,但其运动性以及对葡萄糖的趋化应答反应有明显降低;fhrR缺失突变体的致病性升高,而zur基因的缺失则引起致病性显著降低,qRT-PCR结果表明fhrR、zur基因的缺失对目前已报道的致病相关基因的转录表达有一定影响。qRT-PCR结果显示,fhrR、zur基因在△clp中转录水平明显降低,这表明,fhrR、zur受全局性调控因子Clp正向调控,由此可推断,群体感应系统通过调控fhrR、zur基因表达,从而影响细菌性条斑病菌的致病性等表型。 2.通过PCR扩增的方法从Rs105基因组中克隆到asnB基因,并证实该基因在基因组中为单拷贝。采用同源重组的方法,构建asnB的缺失突变体及其互补菌株,测定突变体及互补菌株的菌体形态、运动性、致病性及过敏性反应等表型,证明asnB基因的缺失使条斑病菌丧失致病性,并且严重影响病菌对不同氮源的吸收能力(见殷芳群毕业论文)。本文为进一步阐明asnB基因的生理功能及致病机制,通过多种表型测定以及实时荧光定量PCR的方法对其进行了研究。结果表明asnB与Xoc对过氧化氢的耐受性有直接联系,qRT-PCR结果显示,在asnB缺失突变体中,抗氧化相关基因和致病相关基因的转录表达量都较野生型显著降低,推测asnB可能通过影响病菌对氧迸发的耐受性而影响其致病性;asnB基因在ΔrpfF和Δclp中转录水平明显降低,这表明,asnB受DSF和全局调控因子Clp正向调控;另一方面,通过比对发现Xoc基因组中xoc999(asnB2)亦编码天冬酰胺合成酶,且该基因在黄单胞菌属中高度保守,并与asnB有33%同源性。采用同源重组的方法构建asnB2的缺失突变体,研究表明,asnB2与asnB在功能上并没有统一性,而且asnB2的表达也与asnB没有相关性。

关键词：水稻细菌性条斑病菌调控因子 asnB基因群体感应

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水稻细菌性条斑病菌GX01菌株预测的主要致病系统基因的突变研究

水稻细菌性条斑病菌GX01菌株预测的主要致病系统基因的突变研究

引用

作者：黄萍广西大学

学位级别：硕士

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,简称Xoc)属于Y-变形杆菌的黄单胞菌属,其宿主植物主要是水稻,能导致水稻细菌性条斑病(Bacterial leaf streak)。Xoc通过叶片的气孔或者伤口进入到水稻的叶肉组织,并在其中增殖,导... 详细信息

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,简称Xoc)属于Y-变形杆菌的黄单胞菌属,其宿主植物主要是水稻,能导致水稻细菌性条斑病(Bacterial leaf streak)。Xoc通过叶片的气孔或者伤口进入到水稻的叶肉组织,并在其中增殖,导致病害。该病菌造成减产达20%-50%。借助风和雨的传播,发病叶片上的Xoc能二次感染寄主植物,从而感染整片稻田。本研究根据黄单胞菌属的致病相关基因信息对最近完成测序的Xoc GX01菌株进行致病相关基因研究。根据Xcc8004中不同致病因子和致病系统,我们预测了GX01较为典型的致病相关候选基因15个,其中有编码Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ system, T3SS)元件的HrcC、HrcV的XOC4122,XOC4132;Ⅱ型分泌系统(Type Ⅱ system, T2SS)编码分泌通道蛋白的XOC3508；与胞外多糖分泌相关的gum基因簇的XOC1701；编码胞外蛋白酶类的XOC0172、XOC1023、XOC1545、XOC2796、XOC3520;编码双组份调控系统RpfG/RpfC基因(?)XC2054、XOC2055;编码信号分子环二鸟苷单磷酸的磷酸二脂酶A(c-di-GMP phosphodiesterase A)的XOC2063;编码RNA聚合酶σ-54因子(RNA polymerase sigma-54factor)的XOC2153；编码RNA结合蛋白RsmA,又称CsrA (carbon storage regulator)的XOC2555；毒力调控子(virulence regulator)基因XOC3268。通过构建它们的整合突变体并进行生理生化以及致病力的检测发现,12个整合突变体的致病力都有所下降(XOC0172,XOC1023,XOC3520突变体致病力检测还在进行中),其中NK1701、NK2054、NK3508、NK4122、NK2555降得很低,与野生型相比几乎完全丧失致病力,NK4132、NK1545、NK2796、NK3268、NK2055、NK2063、NK2153也显著降低。胞外蛋白酶基因突变体NK1545相对酶活力为0；T2SS编码分泌通道蛋白的突变体NK3508相对酶活性几乎丧失,NK1701、NK2054相对酶活力显著增大,NK2153、NK4132相对酶活力显著降低；突变体NK1701,NK2054胞外多糖分泌极显著减少,NK2055、NK2063、NK3508胞外多糖显著降低；NK1545、NK1701、NK2054、NK2055、NK2153、NK2796、NK3508、NK4122游动性极显著变化,NK2063、NK3268、NK4132游动性显著变化。在所有突变的编码胞外蛋白酶的基因中,XOC1545突变体的蛋白酶活性几乎丧失,致病力显著降低,而其他编码蛋白酶基因的突变体的蛋白酶活性无明显变化。对XOC1545进行反式互补,基本上恢复其致病力以及胞外蛋白酶的活力。对比Xcc8004关于胞外蛋白酶的研究发现,Xcc8004编码主要胞外蛋白酶PrtA的基因XC3379和GX01编码主要胞外蛋白酶的XOC1545并非同源基因,但分别行使Xcc8004和Xoc GX01菌株中的主要蛋白酶活力的功能。

关键词：水稻细菌性条斑病菌致病系统致病相关基因整合突变胞外蛋白酶基因

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水稻细菌性条斑病菌注释致病相关基因的功能研究

水稻细菌性条斑病菌注释致病相关基因的功能研究

引用

作者：禚优优广西大学

学位级别：硕士

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzaepathovaroryzicola，简称Xoc)是水稻的主要病原菌之一，其引发的水稻细菌性条斑病可造成严重的水稻减产。但目前国内对Xoc的分子致病机理的研究处于起步阶段。因此系统地研究该致病菌各基因，尤其... 详细信息

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzaepathovaroryzicola，简称Xoc)是水稻的主要病原菌之一，其引发的水稻细菌性条斑病可造成严重的水稻减产。但目前国内对Xoc的分子致病机理的研究处于起步阶段。因此系统地研究该致病菌各基因，尤其是致病相关基因及其功能是非常有必要的。本研究结合文献中黄单胞茵属中已经报道的致病基因以及生物学的分析，12个ORF被挑选作为候选基因，运用整合突变的方法构建候选基因的突变体，对突变体的致病力以及其他各种生理生化表型进行检测和分析。实验结果显示ORFXOC1701、XOC1702、XOC3174、XOC3176、XOC3508、XOC4127和XOC4138的整合突变体完全没有致病力，ORFXOC2151、XOC2152、XOC3721的整合突变体致病力有所降低，ORFXOC1167和XOC3394的整合突变体致病力没有变化。ORFXOC1701、XOC1702、XOC2151和XOC2152的整合突变体游动性和胞外多糖明显降低，其他的没有显著变化。ORFXOC3508的整合突变体分泌胞外蛋白酶的能力显著降低。ORFXOC3174、XOC3176XOC4127和XOC4138的整合突变体在非寄主蓖麻上的过敏反应完全丧失。由于时间原因，本研究只对ORFXOC2152进行了重点研究，根据基因组注释和结构域分析，XOC2152编码一个双组份调节系统的响应调控蛋白。其突变体对重金属、渗透压、蛋白变性剂和H2O2的耐受性降低，在寄主水稻中的致病性显著降低，游动性和胞外多糖分泌能力也明显降低。本研究对其突变体进行了反式功能互补，其表型变化基本都能得到恢复。

关键词：水稻细菌性条斑病菌致病基因突变研究功能鉴定

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水稻细菌性条斑病菌中六个假定外泌蛋白的鉴定与致病功能研究

水稻细菌性条斑病菌中六个假定外泌蛋白的鉴定与致病功能研究

引用

作者：张雁冰南京农业大学

学位级别：硕士

水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）包括水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola,简称Xoc）和水稻白叶枯病菌（X. oryzae pv. oryzae,简称Xoo）两个致病变种。其中,Xoc从水稻的气孔侵入,引起细菌性条斑病；Xoo从水稻的水孔侵入,... 详细信息

水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）包括水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola,简称Xoc）和水稻白叶枯病菌（X. oryzae pv. oryzae,简称Xoo）两个致病变种。其中,Xoc从水稻的气孔侵入,引起细菌性条斑病；Xoo从水稻的水孔侵入,引起白叶枯病。一直以来,细菌性条斑病和白叶枯病严重危害我国的水稻种植。目前,对Xoc致病机理的研究主要集中在群体感应受体蛋白编码基因LuxR、无毒基因（如AvrXa7）、Ⅲ型分泌系统及其转运的效应因子、双组分调控系统、DSF型群体感应调控系统等基因和系统的功能分析,对于假定外泌蛋白的研究则少有报道。通过生物信息学分析,我们从水稻条斑病菌的全基因组（X. oryzae pv. oryzicola strain BLS256）中找到了另外6个编码假定的外泌蛋白的基因（Xoryp010100004540, Xoryp10100011980, Xoryp10100015235, Xoryp010100018640, Xoryp010100020851和Xoryp010100022495）,有趣的是,这些蛋白缺席于水稻白叶枯细菌的全基因组当中,说明它们是一些新颖的对比于水稻白叶枯病菌是水稻条斑病菌中所独有的蛋白,并且它们在细菌致病性中扮演的角色还是未知的。（一）采用PCR的方法从Rs105基因组中克隆到上述6个基因,通过插入突变的方法,分别构建了这6个基因的突变株。用针刺接种法对水稻叶片进行接种,结果表明：与野生型相比,突变体AXoryp010100015235的致病性有显著性减弱。而对烟草叶片的致敏性则无明显改变。所以我们认为Xoryp010100015235是最优的致病相关基因。（二）从Rs105基因组中克隆到Xoryp010100015235基因,并证实这个基因在基因组中为单拷贝。用同源重组法构建缺失突变体,测定突变体及其互补菌株的致病性和过敏性反应、菌体形态、游动性、胞外多糖与蛋白酶的产生能力、在水稻叶片中的繁殖能力以及生长能力等表型,研究显示Xoryp10100015235这个基因突变后可造成致病性的明显减弱和胞外多糖（水稻条斑病菌重要的毒力因子之一）产量的显著性降低,我们命名Xoryp10100015235为epv （extracellular polysaccharide and virulence related gene）。实时定量荧光PCR （qRT-PCR）显示基因gumB （编码胞外多糖生物合成最后一步的关键酶）和一个已报道的毒性相关基因pgk（编码磷酸甘油酸激酶）在epv的突变体中转录水平对比与野生型Rs105有显著性下调。此外,我们发现epv的转录水平在X. oryzae pv. oryzicola中受可扩散性信号分子（DSF）和全局调控因子Clp的正向调控。综上所述,首次报道epv这一新颖的致病相关基因,其在水稻细菌性条斑病菌中所扮演的角色是与胞外多糖产量和毒力密切相关。据我们所知,遗传学研究中关于epv在植物黄单胞菌属中有关其同系物的角色也无人报告。

关键词：水稻细菌性条斑病菌假定外泌蛋白 epv DSF 胞外多糖致病性

来源：评论

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水稻细菌性条斑病菌中受DSF群体感应系统调控的外泌蛋白的功能研究

水稻细菌性条斑病菌中受DSF群体感应系统调控的外泌蛋白的功能研究

引用

作者：周奕景南京农业大学

学位级别：硕士

小分子DSF （Diffusible Signal Factor）介导的群体感应（Quorum sensing, QS）系统在黄单胞菌的侵染和致病过程中具有关键作用,但DSF调控的外泌蛋白的种类和功能仍不清楚。由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicol... 详细信息

小分子DSF （Diffusible Signal Factor）介导的群体感应（Quorum sensing, QS）系统在黄单胞菌的侵染和致病过程中具有关键作用,但DSF调控的外泌蛋白的种类和功能仍不清楚。由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc）引起的水稻细菌性条斑病是我国水稻生产上一种重要的细菌病害。本研究以Xoc为对象,研究受DSF调控的外泌蛋白的种类、致病功能及机制,研究结果如下：（一）本实验室赵延存博士的前期研究中鉴定了Xoc中受DSF调控的53个外泌蛋白（赵延存论文,2011）。本研究选取了其中15个感兴趣的目标蛋白用于后续研究。这15个蛋白的功能涉及小分子蛋白介导的群体感应、细胞结构、细胞进程、氧化压力环境的适应、中间代谢、蛋白降解以及功能未知的蛋白。采用基因定向缺失技术,对这15个蛋白的编码基因进行敲除,获得相应的基因缺失突变株。致病性测定显示其中4个突变株显著削弱了Xoc对寄主水稻的致病性,其对应的蛋白/基因分别是XOC0319（Ax21同系物,依赖XA21的水稻免疫激发子）、XOC2128（多聚半乳糖醛酸酶）、XOC3806（蛋白酶）和XOC1601（半胱氨酸蛋白酶）。表型分析表明,这4个基因对Xoc的定殖能力、胞外多糖产量、游动性、生物膜的形成、胞外蛋白酶活性、抗氧化压力等毒力相关表型造成了不同程度的影响。具体结果如下：这4个基因的突变没有影响Xoc的生长速率,但影响了Xoc在水稻中接种发病后的定殖量,同时还均降低了胞外多糖的产量。XOC2128和XOC1601的突变减弱了菌体游动性,XOC0319的突变减弱了生物膜的形成,XOC3806和XOC1601的突变减弱了胞外蛋白酶活性,XOC3806和XOC2128的突变使Xoc的抗氧化压力能力有所增强。荧光定量显示这四个基因在Rs105△rpfF的表达水平在一定程度上取决于培养基的营养状况,相关结果和Rs105△rpfF中差异蛋白表达情况不完全一致；同时我们还发现这四个基因对10个已知的致病相关基因存在一定的转录调控作用。xpsE是Ⅱ型分泌系统关键基因,荧光定量PCR还显示Rs105△rpfF中xpsE的转录表达水平显著下降,说明DSF群体感应系统对Ⅱ型分泌系统的功能存在某种程度的调控作用。此外,Ax21（水稻XA21先天免疫激发子）是Xoo泌出的能在依赖XA21的水稻上激发先天免疫的硫化蛋白,并且Ax21还被认为是Xoo中一种新型群体感应的信号分子；XOC0319就是Ax21在Xoc的同系物,本研究说明这两种QS系统的功能很可能存在交叉和联系。本研究是黄单胞菌中第一次对受DSF介导的群体感应调控的外泌蛋白及其功能进行了系统深入分析,相关结果显示了DSF型群体感应系统对11分泌系统毒力因子及AX21介导的群体感应有重要的调控作用,进一步明确了Xoc中DSF型群体感应系统的功能。（二）病原菌在寄主表面的黏附性是其成功侵染的先决条件,主要在细菌黏附、定殖等侵染早期进程中起重要作用,而这个过程是由被称为黏性因子的蛋白质来完成的。因此我们选择了T5SS泌出的两个非菌毛黏性蛋白XadA、YapH进行研究,对相关基因xadA、yapH进行了缺失敲除,并对它们的致病机制及其与DSF型群体感应系统的关系进行了试验和分析。XadA和YapH是通过V型分泌系统泌出的两个黏性蛋白。我们找到了xadA、yapH的同系物,即XOC、808、XOC、2467,然后构建了缺失突变体△xadA、△yapH。致病相关表型的测定的结果显示这两个黏性蛋白均和Xoc的喷雾接种时的致病性、水稻叶片表面黏附性、胞外多糖合成能力相关,但与非生物表面的黏附性无关。实时定量荧光PCR表明,xadA、yapH的在模拟植物汁液的培养条件下的转录表达水平的变化存在差异,其中yapH能够被这种培养基诱导表达；xadA、 yapH的转录表达受DSF型群体感应通路调控的模式不同,其中yapH受rpfF、clp正向调控,xadA受rpfF、clp负向调控,说明DSF群体感应系统很可能与外泌黏性蛋白功能的发挥密切相关。本研究首次为XadA、YapH在Xoc致病过程中的作用和特点提供了参考。

关键词：水稻细菌性条斑病菌群体感应外泌蛋白功能研究

来源：评论

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水稻细菌性条斑病菌突变体库的构建与致病相关基因的筛选

水稻细菌性条斑病菌突变体库的构建与致病相关基因的筛选

引用

作者：韦雪雪广西大学

学位级别：硕士

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzaepathovaroryzicola，简称Xoc)是水稻的主要病原菌之一，其引发的水稻细菌性条斑病可造成水稻严重减产。但目前还没有有效的方法控制该病的发生，国内外对Xoc的分子致病机理的研究还处于初步阶段，... 详细信息

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzaepathovaroryzicola，简称Xoc)是水稻的主要病原菌之一，其引发的水稻细菌性条斑病可造成水稻严重减产。但目前还没有有效的方法控制该病的发生，国内外对Xoc的分子致病机理的研究还处于初步阶段，因此系统地研究该菌致病相关基因的功能是非常有必要的。本研究从广西分离株LT4分离到具有利福平抗性的野生型菌株XocGX01作为建库出发菌株。首先对其进行了分子鉴定，致病力检测和表型分析，证明其确实为水稻细条病菌。采用EZ:TN转座子签法构建了XocGX01菌株的Tn5随机插入突变体库，共获得52，392个突变体，转化效率较高。利用改良后的针刺接种法在水稻日本晴品种上进行致病性试验，从572个Tn5转座子插入突变体中筛选到致病性明显下降或完全丧失的突变体48株，并对它们进行致病力评价分析，发现它们的致病力的降低程度不同，其中下降大于70%的有7株。为了了解这48个致病力下降突变体其表型的变化，对它们进行了表型分析。结果显示，其中大部分致病缺陷的突变体其表型都有不同的变化。利用TAIL-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)的方法分离出突变体基因组中的Tn5转座子侧翼片段，经测序分析和序列比对，将这48个突变体的Tn5转座子插入位点进行了定位，定位到39个基因。结果表明，这些突变体的表型和致病力与定位出来的基因的功能对应程度较高。这48个突变体涉及到39个不同的基因，包括：已知的致病相关基因，分别是与分泌系统、胞外多糖和脂多糖合成有关的基因；一部分与细菌基础代谢、基因调节相关的基因；6个编码产物都注释为假设蛋白的基因，未见与致病性相关的报道，可能参与DNA甲基化、RNA结构形成以及其它未知生物学功能。为了确定这6个基因是致病相关基因从而证明该突变体库的正确性，对其中一个基因的突变体进行功能互补，结果表明其互补菌株的表型及致病力都能恢复到野生型的水平，说明该突变体是正确可信的。进而说明采用EZ:TN转座子标签法构建的Tn5突变体库作为筛选以及研究致病相关基因的平台是可靠的，且为进一步研究水稻细菌性条斑病菌的致病相关基因的功能、阐明该病菌的致病机理奠定基础。

关键词：水稻细菌性条斑病水稻细菌性条斑病菌突变体库致病相关基因

来源：评论

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水稻细菌性条斑病菌III型分泌系统抑制剂的鉴定

水稻细菌性条斑病菌III型分泌系统抑制剂的鉴定

引用

作者：柳杰广西大学

学位级别：硕士

植物病害可造成重大的农业经济损失，现阶段的防治主要依靠抗性品种的选育栽培或者是使用化学农药杀死细菌。但病原菌生长周期短，变异速度快，抗性品种或化学农药很容易失去作用。所以亟需一种植物病害防治的新策略。以细菌某一毒性因... 详细信息

植物病害可造成重大的农业经济损失，现阶段的防治主要依靠抗性品种的选育栽培或者是使用化学农药杀死细菌。但病原菌生长周期短，变异速度快，抗性品种或化学农药很容易失去作用。所以亟需一种植物病害防治的新策略。以细菌某一毒性因子为靶标，通过筛选或设计合成相关的毒性抑制剂是一种很好的新策略。此策略不以杀死细菌为目标，只针对特异的毒性机制，对病原菌造成的生存选择压力小，同时不对环境中的有益微生物群体造成伤害。植物病原细菌的III型分泌系统（TypeIIISecretionSystem,T3SS）可将III型效应物（T3SSeffectors,T3SEs）转运至寄主植物中，从而使寄主植物产生病害，是病原菌重要的致病因子，因此T3SS可以作为新型抗病策略的靶标。　　实验室前期鉴定了一批十字花科黑腐病菌（***,Xcc）T3SS的抑制剂，T3SS同样是水稻细菌性条斑病菌（***,Xoc）的主要致病因子，这些抑制剂对XocT3SS是否同样具有作用，值得探究。　　本研究在Xoc中分别将xopN、hrpB1、hrpX、hrpG基因的启动子区与荧光素酶（Luciferase,Lux）或β-葡糖醛酸酶（β-Glucuronidase,GUS）报告基因相融合构建报告系统，共得到8个报告菌株。使用其中带xopN基因启动子区的Lux报告菌对实验室现有的十字花科黑腐病菌T3SS抑制剂进行筛选，得到Carmofur、5-Fluorocytosine、A-3和Dealkalinelignin对xopN启动子活性有显著的抑制作用。接着用其他报告菌及实时荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR,qPCR)检测这4种化合物对XocT3SS的作用。结果表明这4种化合物可显著抑制XocT3SS，其中Dealkalinelignin可能特异抑制XocT3SS，但4种化合物均不影响Xoc在寄主植物水稻日本晴（***）上的致病力。　　为精确检测Xoc的过敏反应（Hypersensitiveresponse,HR）及小分子抑制剂的生防作用，本研究利用融合PCR及同源双交换原理构建能在含抗性基因Bs1的非寄主植物辣椒（***-10R）上激发特异HR的报告菌株GX01/avrBs1。结果显示，GX01/avrBs1可在辣椒ECW-10R上快速激发HR，Dealkalinelignin可显著延迟Xoc在辣椒ECW-10R上的HR。　　为进一步研究Xoc感受T3SS抑制剂的分子机制，本研究构建了hpaS(XOC_3909)、trh(XOC_3790)、hrpG(XOC_3441)、hrpX(XOC_3439)、xrvA(XOC_2077)和zur(XOC_1607)6个XocT3SS调控基因的缺失突变体，研究了4种化合物在各突变体中对T3SS基因表达的影响。结果表明，四种化合物的作用在突变体和野生型中没有显著差异。　　综上所述，本研究在Xoc中建立了筛选T3SS小分子抑制剂的系统，并在对十字花科黑腐病菌T3SS有抑制作用的小分子中筛选到了Carmofur、5-Fluorocytosine、A-3和Dealkalinelignin这4个化合物，它们对XocT3SS同样有抑制作用，并就抑制剂的作用机制进行了初探。另外，本研究还构建了报告菌株GX01/avrBs1，该菌株可以在辣椒ECW-10R上检测由III型分泌系统介导的过敏反应。这些工作为后续对XocT3SS抑制剂的鉴定和研究，以及进一步研发抗水稻细菌性条斑病的新型植物源生物安全农药，提供了一定的理论依据与技术支撑。

关键词：水稻细菌性条斑病菌 Ⅲ型分泌系统抑制剂过敏反应致病力

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水稻细菌性条斑病菌Ⅲ型分泌系统抑制剂的鉴定

水稻细菌性条斑病菌Ⅲ型分泌系统抑制剂的鉴定

引用

作者：柳杰广西大学

学位级别：硕士

植物病害可造成重大的农业经济损失,现阶段的防治主要依靠抗性品种的选育栽培或者是使用化学农药杀死细菌。但病原菌生长周期短,变异速度快,抗性品种或化学农药很容易失去作用。所以亟需一种植物病害防治的新策略。以细菌某一毒性因子... 详细信息

植物病害可造成重大的农业经济损失,现阶段的防治主要依靠抗性品种的选育栽培或者是使用化学农药杀死细菌。但病原菌生长周期短,变异速度快,抗性品种或化学农药很容易失去作用。所以亟需一种植物病害防治的新策略。以细菌某一毒性因子为靶标,通过筛选或设计合成相关的毒性抑制剂是一种很好的新策略。此策略不以杀死细菌为目标,只针对特异的毒性机制,对病原菌造成的生存选择压力小,同时不对环境中的有益微生物群体造成伤害。植物病原细菌的III型分泌系统(Type III Secretion System,T3SS)可将III型效应物(T3SS effectors,T3SEs)转运至寄主植物中,从而使寄主植物产生病害,是病原菌重要的致病因子,因此T3SS可以作为新型抗病策略的靶标。实验室前期鉴定了一批十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris ***,Xcc)T3SS的抑制剂,T3SS同样是水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoc)的主要致病因子,这些抑制剂对Xoc T3SS是否同样具有作用,值得探究。本研究在Xoc中分别将xop N、hrp B1、hrp X、hrp G基因的启动子区与荧光素酶(Luciferase,Lux)或β-葡糖醛酸酶(β-Glucuronidase,GUS)报告基因相融合构建报告系统,共得到8个报告菌株。使用其中带xop N基因启动子区的Lux报告菌对实验室现有的十字花科黑腐病菌T3SS抑制剂进行筛选,得到Carmofur、5-Fluorocytosine、A-3和Dealkaline lignin对xop N启动子活性有显著的抑制作用。接着用其他报告菌及实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q PCR)检测这4种化合物对Xoc T3SS的作用。结果表明这4种化合物可显著抑制Xoc T3SS,其中Dealkaline lignin可能特异抑制Xoc T3SS,但4种化合物均不影响Xoc在寄主植物水稻日本晴(Oryza sativa ***)上的致病力。为精确检测Xoc的过敏反应(Hypersensitive response,HR)及小分子抑制剂的生防作用,本研究利用融合PCR及同源双交换原理构建能在含抗性基因Bs1的非寄主植物辣椒(Capsicum annuum ***-10R)上激发特异HR的报告菌株GX01/avr Bs1。结果显示,GX01/avr Bs1可在辣椒ECW-10R上快速激发HR,Dealkaline lignin可显著延迟Xoc在辣椒ECW-10R上的HR。为进一步研究Xoc感受T3SS抑制剂的分子机制,本研究构建了hpa S(XOC＿3909)、trh(XOC＿3790)、hrp G(XOC＿3441)、hrp X(XOC＿3439)、xrv A(XOC＿2077)和zur(XOC＿1607)6个Xoc T3SS调控基因的缺失突变体,研究了4种化合物在各突变体中对T3SS基因表达的影响。结果表明,四种化合物的作用在突变体和野生型中没有显著差异。综上所述,本研究在Xoc中建立了筛选T3SS小分子抑制剂的系统,并在对十字花科黑腐病菌T3SS有抑制作用的小分子中筛选到了Carmofur、5-Fluorocytosine、A-3和Dealkaline lignin这4个化合物,它们对Xoc T3SS同样有抑制作用,并就抑制剂的作用机制进行了初探。另外,本研究还构建了报告菌株GX01/avr Bs1,该菌株可以在辣椒ECW-10R上检测由III型分泌系统介导的过敏反应。这些工作为后续对Xoc T3SS抑制剂的鉴定和研究,以及进一步研发抗水稻细菌性条斑病的新型植物源生物安全农药,提供了一定的理论依据与技术支撑。

关键词：水稻细菌性条斑病菌 III型分泌系统抑制剂过敏反应

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水稻细菌性条斑病菌中预测的双组份调控子基因的突变研究

水稻细菌性条斑病菌中预测的双组份调控子基因的突变研究

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作者：蒋中伟广西大学

学位级别：硕士

水稻细菌性条斑病菌（***,简称Xoc）是水稻的主要病原细菌之一,其引起的水稻细菌性条斑病.（bacterial leaf streak,BLS）能降低水稻产量的5%～30%。该病最早是1918年在菲律宾发现的,目前在亚洲、非洲和大洋洲都出现了这种水稻病害。Xo... 详细信息

水稻细菌性条斑病菌（***,简称Xoc）是水稻的主要病原细菌之一,其引起的水稻细菌性条斑病.（bacterial leaf streak,BLS）能降低水稻产量的5%～30%。该病最早是1918年在菲律宾发现的,目前在亚洲、非洲和大洋洲都出现了这种水稻病害。Xoc能在水稻生长的各个时期引起BLS,但主要发生在水稻生长的早期。Xoc主要利用双组份系统（two-component systems,TCSs）感受外界环境的变化并作出应答。为系统研究XocGXOl中推测的TCS调控子基因的功能,选择其中26个推测的调控子基因作为候选基因,最后成功构建了 18个基因的非极性整合突变体。突变体表型分析和致病力检测的结果表明18个候选基因突变体的致病力与野生型相比都降低显著;四个突变体（NK0553、NK1021、NK1499和NK3260）的胞外多糖产量和游动性显著降低,胞外酶活性显著提高;一个突变体（NK2154）的蛋白酶活性显著降低,胞外多糖产量和游动性显著提高;两个突变体（NK0270和NK3241）的胞外多糖产量和游动性都显著降低;两个突变体（NK0607和NK1979）的胞外多糖产量显著降低,蛋白酶活性显著提高;NK0863的蛋白酶活性显著提高;NK3622的胞外多糖产量显著提高。为研究调控子基因与致病力的确切关系,而且NK1021的胞外多糖产量、游动性和致病力与野生型相比显著降低,胞外蛋白酶活性显著提高,所以选择XOC1021进行进一步的功能研究。XOC1021与XOC1020在Xoc GXO1中是一对推测的TCS基因,分别注释为phoB和phoR,它们相隔58 bp,转录方向一致。RT-PCR结果表明XOC1020与XOC1021为同一转录单元。XOC1021编码的蛋白质含有一个REC结构域和一个Trans_regC结构域。将包含整个XOC1021序列的外源片段克隆到质粒pLAFR3上,导入NK1021中得到互补株CNK1021,将空载体pLAFR3导入NK1021的菌株命名为PNK1021。抗逆性实验结果表明,NK1021对SDS、NaCl、Cu2+和酚敏感。CNK1021能够恢复NK1021在表型和致病力上的变化。通过同源比对,发现phoB在黄单胞菌中广泛存在,推测该基因在黄单胞菌中有相似的功能。本研究通过对XocGXOl推测双组份系统18个调控子基因的突变研究,发现一些调控子基因可能参与调控XocGXOl的胞外多糖产量、蛋白酶活性、游动性和致病力。同时本研究表明phoB与XocGXOl的致病相关,并参与调控胞外多糖的产量、蛋白酶活性、游动性和抗逆性。

关键词：水稻细菌性条斑病菌双组份系统调控子致病力 phoB

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水稻细菌性条斑病菌Tn5突变体的表型筛选与突变位点定位

水稻细菌性条斑病菌Tn5突变体的表型筛选与突变位点定位

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作者：卢香浓广西大学

学位级别：硕士

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pathovar oryzicola,Xoc)引起的水稻细条病对广西部分地区水稻产量造成影响。随着水稻与Xoc菲律宾代表菌株BLS256相继测序成功,Xoc—水稻的互作已成为研究病原菌—植物互作的模式之一。广西菌株G... 详细信息

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pathovar oryzicola,Xoc)引起的水稻细条病对广西部分地区水稻产量造成影响。随着水稻与Xoc菲律宾代表菌株BLS256相继测序成功,Xoc—水稻的互作已成为研究病原菌—植物互作的模式之一。广西菌株GX01的测序也基本完成,如此丰富的静态碱基序列信息正等待着我们从中挖掘动态的病原菌生物学功能。突变体库是功能基因组学研究的基础,转座子可移动及可体外驱动转座的特点被广泛应用于介导插入突变体库的构建,逐渐成为一个研究黄单胞菌的强大工具。本研究以广西菌株Xoc GX01作为建库出发菌株,利用EZ-Tn5TM 转座子介导的方法构建了Tn5插入突变体库。第一次电转化共保存2965个单克隆的转化子,并对这一批转化子的胞外多糖、胞外蛋白酶、游动性、生物膜等表型进行检测。目前已完成的2200个突变体表型筛选中,我们筛选到胞外多糖分泌能力增强的突变体26个,胞外多糖分泌能力减弱的突变体31个,胞外蛋白酶活性增强的突变体77个,胞外蛋白酶活性减弱的突变体16个,游动性增强的突变体61个,游动性减弱的突变体507个,并发现出现生物膜现象的突变体67个。为了验证确实有转座子的插入,我们从突变体库中随机选取了17个突变体,提取它们的总DNA,用鉴定引物PCR验证,均能扩增出568bp的目的产物,证明这些转化子均有Tn5插入,假阳性率低。并利用质粒拯救的方法进一步获取其转座子的侧翼序列,与XocGX01全基因组进行本地序列比对(BLAST),相似性百分比在97%以上,侧翼序列的真实性比较高,是一种相对高效的定位方法。同时,我们从筛库过程中选取表型变化相对明显的突变体BH90和BA87进行致病力检测,它们的致病力均有不同程度的下降,其定位信息分别为XOC2200和XOC2216。为进一步研究这两个基因的功能,同时构建了XOC2200和XOC2216的缺失突变体及其互补菌株。XOC2200的编码产物为Transcriptional regulator,flagellar regulatory protein A; XOC2216的编码产物为flagellar biosynthesis hook protein。其中Tn5插入突变体BH90及XOC2200的缺失突变体胞外多糖及游动性显著提高,互补菌株表型基本能够恢复到野生型状态,推测XOC2200可能反向调控胞外多糖的合成及Xoc的游动性。Tn5插入突变体BA87及XOC2216的缺失突变体胞外蛋白酶活性有所增加,游动性下降,推测XOC2216可能影响Xoc的胞外蛋白酶活性及游动性。

关键词：水稻细菌性条斑病菌 EZ-Tn5TM转座子突变体库表型筛选质粒拯救

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