检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2019年第3期50卷 602-610页

作者：杨振兴孟锦昕肖雷朱建波廖德芳高林李占鸿杨恒李华春云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

流行性出血病(EHD)是由流行性出血病病毒(EHDV)感染反刍动物引起的一种虫媒病毒病,为了解中国云南EHDV的感染情况和病毒遗传特征,笔者课题组在云南省师宗县以EHDV血清学和核酸阴性的牛、羊为哨兵动物,拟对流行于云南省的EHDV进行分离与... 详细信息

流行性出血病(EHD)是由流行性出血病病毒(EHDV)感染反刍动物引起的一种虫媒病毒病,为了解中国云南EHDV的感染情况和病毒遗传特征,笔者课题组在云南省师宗县以EHDV血清学和核酸阴性的牛、羊为哨兵动物,拟对流行于云南省的EHDV进行分离与鉴定。将采集于哨兵动物的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;通过血清中和试验与病毒Seg-2、Seg-3 ORF区的序列分析,确定病毒的血清型与遗传特征;采用C-ELISA和qRT-PCR方法对EHDV感染动物血液中的抗体水平与病毒核酸进行监测。结果如下:从2013年8月采集自云南师宗县哨兵牛的血样中分离出一株EHDV(毒株号YNSZ/V269/2013),血清中和试验结果表明分离的病毒为血清型7型(EHDV-7);Seg-2、Seg-3序列分析表明分离的病毒属EHDV-7 Eastern型,与日本毒株和澳大利亚EHDV-7型毒株具有最近的亲缘关系。哨兵动物病毒核酸转阳后,血清抗体迅速上升,3周后达最高点并能在该水平持续较长时间,而病毒核酸含量却迅速下降,7周后已经检测不到。本研究首次报道了EHDV-7型毒株在中国的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性。研究结果可为进一步开展中国EHDV-7型病毒的全基因组测序、流行病学调查、诊断方法的建立和致病性等相关研究提供基础。

关键词：流行性出血病病毒病毒分离鉴定血清型序列分析

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流行性出血病病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2019年第3期49卷 280-286页

作者：杨振兴朱建波廖德芳李占鸿肖雷高林李楠杨恒李华春云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

为建立流行性出血病病毒(EHDV)群特异性核酸检测方法,本研究根据GenBank中登录的EHDV毒株内衣壳结构蛋白VP7基因的保守区,设计并合成1对特异性引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性、敏感度和临床样品的检测试验。结果表... 详细信息

为建立流行性出血病病毒(EHDV)群特异性核酸检测方法,本研究根据GenBank中登录的EHDV毒株内衣壳结构蛋白VP7基因的保守区,设计并合成1对特异性引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性、敏感度和临床样品的检测试验。结果表明,该方法能特异性地检出不同地区分离的不同血清型EHDV,而对蓝舌病病毒(BTV)、中山病病毒(CHUV)和赤羽病病毒(AKAV)无交叉反应,具有较好的特异性;不同血清型的EHDV最低检出量级为1×10~2copies/uL。同时,该方法能有效地从临床抗凝血样品中检测出EHDV核酸,与病毒分离试验结果进行比较,符合率为100%。说明所建立的方法特异性强、敏感性高、可靠性好,可用于EHDV的快速检测、流行病学调查和试验研究。

关键词：流行性出血病病毒一步RT-PCR 分子诊断

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流行性出血病病毒抗原捕获ELISA方法的建立

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中国兽医学报 2019年第1期39卷 1-7页

作者：杨振兴朱建波肖雷高林苗海生何于雯孟锦昕杨恒李华春云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

为建立流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,本试验用纯化处理的4种血清型病毒(EHDV-2、5、6和8)混合免疫兔和豚鼠,制备高免血清。以兔抗EHDV为捕获抗体,豚鼠抗EHDV为检测抗体,羊抗豚鼠IgG-HRP为酶标抗体,建立了EHDV抗原捕获ELISA(ant... 详细信息

为建立流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,本试验用纯化处理的4种血清型病毒(EHDV-2、5、6和8)混合免疫兔和豚鼠,制备高免血清。以兔抗EHDV为捕获抗体,豚鼠抗EHDV为检测抗体,羊抗豚鼠IgG-HRP为酶标抗体,建立了EHDV抗原捕获ELISA(antigen capture ELISA,AC-ELISA)方法。通过反应条件优化,获得最佳工作条件:5%马血清为稀释液,包被抗体1∶15 000稀释,检测抗体1∶20 000稀释,酶标抗体1∶15 000稀释。通过检测60份阴性样品确定临界值,P/N值≥2为阳性、P/N值<1.5为阴性;特异性试验表明该方法仅能检测出各血清型EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、赤羽病病毒(AKAV)及中山病毒(CHUV)无交叉反应;敏感性试验表明该方法可以检出102.47±0.07 TCID50的病毒;批内和批间变异系数均<10%;用RT-PCR与该方法同时对70份参考样品进行检测,符合率为92.86%。表明本试验建立的AC-ELISA方法为EHDV抗原检测提供了一种可靠实用的技术手段。

关键词：流行性出血病病毒抗原捕获ELISA 多克隆抗体

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蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及应用

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华南农业大学学报 2021年第3期42卷 17-25页

作者：杨振兴李占鸿肖雷谢佳芮廖德芳李卓然李华春朱建波杨恒云南省畜牧兽医科学院/云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

【目的】建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。【方法】选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。【结果】三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10μL-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。【结论】本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。

关键词：三重RT-qPCR 蓝舌病病毒流行性出血病病毒帕利亚姆血清群病毒病毒检测

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云南和广东省流行性出血病病毒血清6型毒株(EHDV-6)的分离与遗传特性

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华南农业大学学报 2020年第4期41卷 8-15页

作者：李占鸿杨振兴林栩慧吕敏娜肖雷寇美玲廖德芳朱建波杨恒李华春云南省畜牧兽医科学院/云南热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224 广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室广东广州510640

【目的】分离流行于我国南方地区的流行性出血病病毒血清6型毒株(EHDV-6),掌握分离毒株的遗传特征。【方法】对设立于我国云南和广东省的哨兵动物定期采血,进行EHDV感染情况监测与病毒分离培养。通过血清中和试验确定分离EHDV的血清型,... 详细信息

【目的】分离流行于我国南方地区的流行性出血病病毒血清6型毒株(EHDV-6),掌握分离毒株的遗传特征。【方法】对设立于我国云南和广东省的哨兵动物定期采血,进行EHDV感染情况监测与病毒分离培养。通过血清中和试验确定分离EHDV的血清型,采用一步法RT-PCR对分离的EHDV-6毒株基因节段2、3、6(Seg-2、-3、-6)进行扩增与序列分析。【结果】2012-2016年,从云南省和广东省的哨兵动物中分离出25株EHDV毒株,其中,11株为EHDV-6型。中国EHDV-6型毒株的Seg-2、-3与-6均属Eastern型,核酸序列相似性分别为99.1%、98.9%和98.8%,在系统发生树上分别聚为1个独立的中国支系。在日本引起疫病暴发的EHDV-6型毒株与中国EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系。日本EHDV-6型毒株在系统发生树上处于中国支系内部,Seg-2、Seg-3与中国毒株的核酸序列相似性分别为98.5%和93.9%。【结论】云南和广东省流行的EHDV-6型毒株核酸与氨基酸序列高度相似;日本和中国的EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系,提示中日之间可能存在EHDV的流动。研究结果为进一步开展我国EHDV-6型毒株流行病学分析、致病性、病原学诊断与疫苗制备等研究提供了基础。

关键词：流行性出血病病毒血清6型分离鉴定序列分析

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广东一株牛源流行性出血病病毒的分离鉴定

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中国预防兽医学报 2017年第1期39卷 67-70页

作者：吕敏娜朱建波李娟杨振兴林栩慧陈琴苓张健騑廖申权戚南山吴彩艳陈志虹李华春孙铭飞广东省农业科学院动物卫生研究所广东省兽医公共卫生公共实验室/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室广东广州510640 云南省畜牧兽医科学院云南昆明650224

为了解广东反刍动物流行性出血病(EHD)的感染情况,本研究对采集的牛血液样品进行EHD病毒(EHDV)的RT-PCR检测,对核酸检测为阳性的样品进行病毒分离鉴定。将阳性样品接种BHK-21细胞连续传3代时出现细胞病变,扩增出了VP7基因,进行BLAST序... 详细信息

为了解广东反刍动物流行性出血病(EHD)的感染情况,本研究对采集的牛血液样品进行EHD病毒(EHDV)的RT-PCR检测,对核酸检测为阳性的样品进行病毒分离鉴定。将阳性样品接种BHK-21细胞连续传3代时出现细胞病变,扩增出了VP7基因,进行BLAST序列比对,结果表明该分离株与国内外EHDV分离株的同源性达98%~100%,TCID_(50)为10^(-6.5)/50μL,不能凝集鸡红细胞,表明该分离株为EHDV,命名为GD-N133。根据VP2基因序列的分析和微量中和试验结果,确定该病毒株为EHDV-1型。

关键词：流行性出血病病毒牛血清型分离鉴定

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流行性出血病病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒的研制

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中国动物检疫 2021年第10期38卷 92-97页

作者：董仙兰王琼韩佃刚董俊杨云庆祝贺叶玲玲张冲尹尚莲李瑶瑶何昌霖罗倩敏艾军云南农业大学动物医学院云南昆明650201 中国科学院昆明动物研究所云南昆明650223 昆明海关技术中心云南昆明650200

为研制流行性出血病病毒(epidemic hemorrhagic disease virus,EHDV)ELISA抗体检测试剂盒,用饱和硫酸铵浓缩EHDV灭活病毒作为包被抗原,以EHDV鼠源单克隆抗体作为阻断抗体,商品化的IgG-HRP羊抗鼠二抗作为检测抗体,通过优化检测试剂中各... 详细信息

为研制流行性出血病病毒(epidemic hemorrhagic disease virus,EHDV)ELISA抗体检测试剂盒,用饱和硫酸铵浓缩EHDV灭活病毒作为包被抗原,以EHDV鼠源单克隆抗体作为阻断抗体,商品化的IgG-HRP羊抗鼠二抗作为检测抗体,通过优化检测试剂中各组分含量和反应程序,建立了一种EHDV阻断ELISA抗体检测方法。用研制的试剂盒与ID Screen参考试剂盒分别检测实验室保存的血清样本,结果发现该方法的特异性、敏感性与ID Screen参考试剂盒一致,二者符合率为97.00%。结果表明,研制的EHDV阻断ELISA抗体检测试剂盒可作为EHDV抗体检测的候选试剂盒,代替国外试剂盒使用,从而降低EHDV检测成本,这对该病防控具有重要意义。

关键词：流行性出血病病毒单克隆抗体阻断ELISA

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血清6型流行性出血病病毒在我国云南的首次分离与鉴定

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中国预防兽医学报 2019年第11期41卷 1113-1119页

作者：杨振兴寇美玲李占鸿廖德芳肖雷朱建波高林李华春杨恒云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室

为对流行于我国云南省的流行性出血病病毒(EHDV)进行分离与鉴定,以掌握我国流行EHDV的遗传特征与感染特性,本研究将2012年8月采集于哨兵牛的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞以分离病毒;通过血清中和试验与分离病毒的Seg-2、Seg-3基因测... 详细信息

为对流行于我国云南省的流行性出血病病毒(EHDV)进行分离与鉴定,以掌握我国流行EHDV的遗传特征与感染特性,本研究将2012年8月采集于哨兵牛的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞以分离病毒;通过血清中和试验与分离病毒的Seg-2、Seg-3基因测序分析,确定病毒的血清型与遗传特征;采用C-ELISA和荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法对EHDV感染哨兵牛血清中的抗体水平与血液中病毒核酸进行动态监测。结果显示,经BHK-21细胞分离出一株EHDV(YNSZ/V003/2012),血清中和试验显示分离病毒属于EHDV-6型。病毒Seg-2、Seg-3基因序列分析显示YNSZ/V003/2012血清型为EHDV-6型,地域型为东方型,与日本EHDV-6亲缘关系最近。哨兵牛感染该病毒后,血清中的特异性抗体迅速上升,感染3周后抗体达最高点并能够在该水平维持较长时间,而血液中病毒核酸含量则呈迅速下降趋势,感染7周后已经检测不到病毒核酸。本研究首次报道了EHDV-6型病毒株在我国云南的分离、序列特征以及在动物中的感染特性,为进一步开展EHDV-6型的流行病学调查和致病性等相关研究奠定了基础。

关键词：流行性出血病病毒病毒分离鉴定血清型序列分析

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一株新型牛源流行性出血病病毒的分离与鉴定

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中国预防兽医学报 2021年第4期43卷 363-369页

作者：李卓然王金萍杨振兴李占鸿廖德芳李华春杨恒云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

为分析云南省动物流行性出血病病毒(EHDV)的流行情况,本研究将2018年采集的280份牛EDTA抗凝血液样品通过EHDV群特异性qRT-PCR和血清型特异性qRT-PCR方法进行病毒核酸检测,利用竞争性ELISA(C-ELISA)检测牛常规血液样品中的抗体水平,将EHD... 详细信息

为分析云南省动物流行性出血病病毒(EHDV)的流行情况,本研究将2018年采集的280份牛EDTA抗凝血液样品通过EHDV群特异性qRT-PCR和血清型特异性qRT-PCR方法进行病毒核酸检测,利用竞争性ELISA(C-ELISA)检测牛常规血液样品中的抗体水平,将EHDV核酸阳性牛血液样品先接种白纹伊蚊(C6/36)细胞再接种BHK-21细胞进行病毒分离;利用血清型特异性qRT-PCR和血清中和试验分别鉴定分离病毒的血清型;通过蚀斑特征和增殖曲线分析分离病毒的增殖特性;经全长cDNA扩增技术(FLAC)获得分离病毒的Seg-2和Seg-3基因序列,并分析其同源性及遗传进化关系;采用C-ELISA和qRT-PCR对感染牛体内的抗体和病毒核酸进行回溯检测。结果显示,280份牛EDTA抗凝血样品中共有35份样品呈EHDV核酸阳性,其中13份为EHDV-1型,11份为EHDV-5型,另外11份均未有已知血清型的特异性扩增曲线。共分离到3株病毒,经EHDV血清型特异性qRT-PCR鉴定其中两株分别为EHDV-1和EHDV-5型,但无法判定其中一株病毒(YNDH/V079/2018株)的血清型。蚀斑特征和增殖曲线结果显示,该株病毒的蚀斑明显小于EHDV-1、EHDV-5和EHDV-6型,而与EHDV-7和EHDV-10型接近,但其增殖特性则与上述血清型EHDV均相似。序列分析结果显示,YNDH/V079/2018株Seg-3/VP3与GenBank中EHDV参考株相应基因节段的核苷酸/氨基酸序列的同源性分别为78.5%~80.0%/94.6%~96.5%,表明其为一株EHDV;但其Seg-2/VP2与GenBank中各血清型EHDV参考株相应基因节段的核苷酸/氨基酸序列同源性分别为44.3%~50.9%/31.0%~40.6%,表明该株病毒不属于已知血清型的EHDV。系统进化树结果显示,YNDH/V079/2018株Seg-3基因形成一个单独的进化分支,不属于已报道的东方和西方两种地域型;且其Seg-2基因也不属于已知血清型EHDV形成的A~D 4个基因群,而是单独形成了E基因群。感染牛的回溯检测结果显示,牛感染YNDH/V079/2018株后,虽然未出现临床症状,但被感染牛的病毒血症能够持续11周,血液内的抗体则可持续13周且一直保持在较高水平直到采血终止。本研究首次报道在我国云南省分离到一种新型EHDV,并分析了其遗传特征和感染特性,为进一步开展该血清型EHDV的流行病学调查和致病性等研究奠定基础。

关键词：流行性出血病病毒病毒分离血清型地域型序列分析

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新血清型流行性出血病病毒荧光定量qRT-PCR与RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2021年第4期51卷 446-454页

作者：杨振兴李占鸿宋子昂李卓然李华春朱建波廖德芳杨恒云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224 云南农业大学动物科学技术学院云南昆明650201

流行性出血病病毒(EHDV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒。目前世界范围已发现9种血清型的EHDV,2018年笔者在云南芒市新分离到1株新血清型EHDV毒株(YNDH/V079/2018),但尚缺乏该血清型的特异性检测方法。本研究建立了新血清型EHDV核酸... 详细信息

流行性出血病病毒(EHDV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒。目前世界范围已发现9种血清型的EHDV,2018年笔者在云南芒市新分离到1株新血清型EHDV毒株(YNDH/V079/2018),但尚缺乏该血清型的特异性检测方法。本研究建立了新血清型EHDV核酸检测的实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)和RT-PCR方法。试验结果显示,建立的两种方法均具有良好的特异性与灵敏度,与另外7种血清型EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、中山病病毒(CHUV)、阿卡斑病毒(AKAV)和阴性对照均无交叉反应。对病毒核酸的检测下限分别达到10 copies/μL(qRT-PCR)与102copies/μL(RT-PCR)。临床样品检测显示,qRT-PCR能在动物感染EHDV早期检测鉴定出病毒,更适合应用于检测病毒载量较低的血液样品。RT-PCR的扩增产物可以胶回收测序,进一步了解待测病毒的遗传信息,两种方法辅助使用,为新血清型EHDV的早期快速诊断、流行病学调查和试验研究等提供了有效的技术方法。

关键词：流行性出血病病毒新血清型荧光定量qRT-PCR RT-PCR 血清型鉴定

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