检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：潘力中国农业科学院

学位级别：博士

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是一种由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的急性传染病,可感染猪、牛、羊等多种哺乳动物。家猪和野猪是PRV的天然宿主,PRV感染可导致各年龄段猪发病,对仔猪致死率可达100%。PRV是一种嗜神经性α疱... 详细信息

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是一种由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的急性传染病,可感染猪、牛、羊等多种哺乳动物。家猪和野猪是PRV的天然宿主,PRV感染可导致各年龄段猪发病,对仔猪致死率可达100%。PRV是一种嗜神经性α疱疹病毒,通常经口、鼻黏膜入侵宿主,其复制所产生的子代病毒可以在宿主的外周神经系统中建立潜伏感染。潜伏感染的PRV可以在宿主体内持续存在,而应激等因素可诱导潜伏的病毒再激活并成为传染源。目前,尚无有效的抗病毒药物或疫苗免疫能够彻底清除潜伏在宿主体内的PRV,并且出现野毒和疫苗毒共存的现象。因此,建立简便、稳定的体内外潜伏感染模型以及筛选与潜伏感染相关的病毒蛋白或宿主分子,研究PRV在神经源性细胞中的感染过程,可为PRV潜伏感染机制研究提供理论依据和技术平台。为了建立易于操作的PRV体外潜伏感染模型,本研究经不断优化试验条件,最终确定了PRV(MOI=0.01)感染N2a细胞并在37℃孵育2 h后,转移到42℃高温培养,可使病毒建立稳定的潜伏感染。恢复正常培养温度(37℃)后,潜伏的病毒可以再激活。为了建立稳定的PRV体内潜伏感染模型,本研究通过饮水给予小鼠黄芪多糖以提高其免疫力,并通过眼部感染10 TCID的PRV,在小鼠体内建立了稳定的潜伏感染模型。经免疫抑制剂地塞米松处理后,潜伏在小鼠体内的PRV可再激活,再激活率高达80%。由于技术的局限性,目前,仍不完全清楚PRV在神经源性细胞中的裂解性感染和潜伏感染过程。为了填补这一空白,本研究采用了新型ANCHOR DNA标记系统来标记PRV的基因组,该系统具有操作简单、兼容性好且不影响病毒生物学特性等优点。本研究在ANCHOR DNA标记系统的基础上,结合基因融合技术构建了病毒基因组和囊膜双荧光标记的重组PRV(r PRV-Anchor3-m Cherry),该重组病毒的复制效率和毒力与亲本PRV相同。本研究以r PRV-Anchor3-m Cherry为报告病毒,利用单病毒活细胞成像和三维重构技术,首次对PRV的完整复制周期进行了实时可视化和定量分析。研究发现,PRV可通过内吞和膜融合两种途径入侵小鼠脑神经瘤细胞(N2a),病毒基因组在感染后1-1.5 h进入细胞核,病毒晚期蛋白g M在感染后8±0.25 h组装到子代病毒颗粒上,病毒的完整复制周期为12.5±0.25 h。此外,建立了通过荧光测量法实时获取病毒滴度的标准曲线,明确了病毒基因组复制可引发细胞核耗竭,并对潜伏期的PRV基因组进行了精确的定位和量化,证实了潜伏期的病毒基因组在细胞核内随机分布。本研究发现PRV的UL54蛋白在潜伏感染过程中具有关键作用。UL54蛋白是一种早期蛋白,与人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的ICP27蛋白同源。ICP27具有感知环境变化的功能,可以调节病毒的潜伏感染与再激活。本研究利用已建立的PRV体外温控潜伏感染模型,发现缺失早期基因UL54不影响PRV潜伏感染,但极大降低了病毒再激活效率。随后,通过PRV潜伏感染模型筛选出了6个差异表达的宿主分子,其中宿主减数分裂调节蛋白(XMR)与PRV基因组在细胞核内共定位,过表达XMR蛋白可以显著抑制PRV复制。进一步研究发现,UL54蛋白通过抑制XMR m RNA延伸抑制XMR蛋白表达,从而促进PRV潜伏感染再激活。综上,本研究为解析PRV的潜伏感染机制,在小鼠神经瘤N2a细胞和小鼠体内建立了PRV的潜伏感染与再激活模型;基于新型ANCHOR DNA标记系统构建了基因组和囊膜双荧光标记重组病毒。利用该重组病毒示踪了PRV在N2a细胞中的复制周期,发现PRV可经内吞和膜融合两种途径侵入N2a细胞,病毒基因组复制可引发细胞核耗竭,定位并量化了潜伏期的病毒基因组;发现PRV的UL54基因促进PRV的再激活效率;PRV潜伏相关的宿主分子XMR可显著抑制PRV复制,UL54蛋白通过抑制XMR m RNA延伸抑制XMR蛋白表达,从而促进PRV潜伏感染再激活。该研究可为PRV潜伏感染的分子机制研究提供借鉴,并为研发阻断PRV潜伏感染再激活的疫苗和药物提供新的靶标分子。

关键词：伪狂犬病病毒潜伏感染与再激活实时示踪潜伏感染模型 UL54蛋白

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一种新的HIV-1潜伏感染模型的建立方法

引用

医药前沿 2012年第3期2卷 41-42页

作者：李亮助李琳上海市公共卫生临床中心上海201508

本研究在原有工作基础上进一步优化HIV-1潜伏感染细胞模型的建立方法.利用表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,EGFP)的HIV-1假病毒感染人Jurkat T细胞,采用流式细胞术分选出GFP阳性细胞群,经20天培养后,获得静息的GFP阴性的细... 详细信息

本研究在原有工作基础上进一步优化HIV-1潜伏感染细胞模型的建立方法.利用表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,EGFP)的HIV-1假病毒感染人Jurkat T细胞,采用流式细胞术分选出GFP阳性细胞群,经20天培养后,获得静息的GFP阴性的细胞群,之后通过激活剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)刺激,检测GFP以及p24抗原的表达情况,筛选出HIV-1潜伏感染的单克隆细胞群.该新方法较传统方法更为有效,所建立的HIV-1潜伏感染模型可用于各种药物或激活剂的筛选和检测,也为进一步研究HIV-1潜伏感染机制奠定了工作基础.

关键词： HIV-1 Jurkat T细胞系绿色荧光蛋白潜伏感染模型

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应用CRISPR/Cas9技术抑制伪狂犬病病毒的再激活

应用CRISPR/Cas9技术抑制伪狂犬病病毒的再激活

引用

作者：向广韬中国农业科学院

学位级别：硕士

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒、脑脊髓炎、呼吸和神经系统障碍为主要特征的急性传染病。PRV是一种嗜神经性病毒,感染猪只后,可在其体内建立潜伏感染... 详细信息

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒、脑脊髓炎、呼吸和神经系统障碍为主要特征的急性传染病。PRV是一种嗜神经性病毒,感染猪只后,可在其体内建立潜伏感染。疫苗在该病的防控中发挥了重要的作用,但是现有疫苗不能够阻止潜伏感染的建立与再激活,而且血清学方法不能够检测到处于潜伏感染状态的PRV。在一定条件下,潜伏状态的PRV可以被重新激活,从而导致排毒并引发疫情,这非常不利于PR的防控及根除。因此,研制一种能够清除潜伏感染状态PRV的方法极为必要。本研究首先利用同源重组的方法构建了一株重组报告病毒rPRVTJ-US9-EGFP,经荧光观察、PCR和一步生长曲线鉴定,获得了一株能稳定表达绿色荧光、且生长特性与亲本病毒一致的报告病毒。我们通过分离新生鼠背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)获取感觉神经细胞,并以抗βⅢ-tubulin抗体利用间接免疫荧光试验对神经细胞进行了鉴定。为了获得纯净的感觉神经细胞,我们利用抑制有丝分裂的药物阿糖胞苷(Cytosine arabinoside,Ara-C)对非神经细胞进行处理,并对其浓度进行了筛选。结果表明,5μM Ara-C为最适处理浓度。同时研究了抗病毒药物阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)对神经细胞的毒性,结果表明0.1～0.7mM的ACV对神经细胞生长没有明显影响。我们利用报告病毒在神经细胞上构建潜伏模型,3个感染复数(Multiplicity of infection,MOI)和5个ACV处理浓度以棋盘滴定法进行试验。结果显示,以MOI=0.001感染感觉神经元,0.5 mM ACV处理7 d后,被感染细胞中的荧光消失,说明可能建立潜伏感染。随后,我们收集PRV的潜伏感染样品和裂解样品,对病毒基因组拷贝数、上清中病毒滴度和病毒各时期基因的表达进行了鉴定,结果表明荧光消失时细胞中存在病毒基因组但病毒不能复制、不产生感染性病毒粒子,确实处于潜伏感染状态。当用10μM的在激活药物LY294002刺激时,潜伏感染的PRV可被再激活进入裂解感染状态。然后我们选取了对PRV复制、再激活有影响的病毒基因UL9、UL42、UL54和VP16。构建含有靶基因的真核表达载体,以蛋白表达的方式初步筛选了sgRNA的编辑效果。结果表明,UL9-sgRNA1、UL9-sgRNA3、UL54-sgRNA1、UL54-sgRNA2和UL54-sgRNA3均可明显降低靶基因的蛋白表达水平。并构建了一系列含有Cas9组件和可能影响PRV再激活的sgRNA的重组慢病毒;最后在潜伏感染模型上评价了重组慢病毒对PRV再激活的抑制效果。携带Cas9组件和针对PRV UL9基因的sgRNA的重组慢病毒能够有效抑制PRV的再激活。本研究为研制兼具清除潜伏感染能力的PR疫苗奠定了基础,也可为其他疱疹病毒潜伏感染的研究提供参考。

关键词：伪狂犬病病毒感觉神经元潜伏感染模型 CRISPR/Cas9 再激活

来源：评论

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HIV治愈:潜伏HIV的清除及其策略

引用

遵义医科大学学报 2015年第2期38卷 105-110页

作者：刘叔文潘晓彦赵伟南方医科大学药学院

HIV的感染造成机体免疫系统损害,最终引发艾滋病(AIDS),导致全球每年数百万人死于HIV感染引发的肿瘤及感染。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)应用于早期感染的患者,可有效抑制HIV的感染,从而避免病毒血症的暴发。但HIV初次感染的不可察觉... 详细信息

HIV的感染造成机体免疫系统损害,最终引发艾滋病(AIDS),导致全球每年数百万人死于HIV感染引发的肿瘤及感染。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)应用于早期感染的患者,可有效抑制HIV的感染,从而避免病毒血症的暴发。但HIV初次感染的不可察觉性和潜伏期,给HIV的预防及治疗带来非常大的难度。除此之外,HIV的整合后潜伏目前,被认为是实现HIV治愈最大的障碍。本文就如何将整合后潜伏的病毒从机体彻底清除,从而实现HIV的根本治愈,并对近年来相关研究的进展进行综述。

关键词：潜伏HIV 激活剂治疗策略潜伏感染模型

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潜伏感染期伪狂犬病病毒EPO基因甲基化状态分析

潜伏感染期伪狂犬病病毒EPO基因甲基化状态分析

引用

作者：余秋颖河南农业大学

学位级别：硕士

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一种具有神经嗜性的α型疱疹病毒，能在宿主体内建立持久潜伏感染。猪是PRV的原发感染宿主，阻止PRV建立潜伏感染和清除体内潜伏感染的病毒对于控制和根除伪狂犬病（Pseudorabies，PR）具有... 详细信息

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一种具有神经嗜性的α型疱疹病毒，能在宿主体内建立持久潜伏感染。猪是PRV的原发感染宿主，阻止PRV建立潜伏感染和清除体内潜伏感染的病毒对于控制和根除伪狂犬病（Pseudorabies，PR）具有至关重要的作用。目前PRV建立潜伏感染的机理还不清楚。DNA甲基化在调控病毒基因组转录以及逃避宿主对寄生成分的限制和免疫系统监视中起作用，DNA甲基化在PRV建立和维持潜伏感染状态中的作用尚未知。 2012年伊始，PR在河南省部分地区再次暴发。为探寻其中缘由，并为后期研究提供可靠试验材料，对2012年3月至2013年6月间采集的疑似PR病料接种Vero细胞并经gE-PCR扩增，分离鉴定出4株PRV毒株，同时对该4株病毒的gE、TK和gD基因进行克隆、测序及分析。序列分析显示，与参考毒株相比，4株PRV河南分离株的gE、TK、gD基因某些核苷酸及氨基酸发生突变。遗传进化分析显示，4株PRV河南分离株形成一个独立的小亚群，与中国其他地区2013年分离株亲缘关系密切，与2013年前分离株的亲缘关系较近，与欧洲、南美洲分离株的亲缘关系较远，推测此4株河南分离株是国内新型流行株。用分离鉴定的PRV流行毒株感染试验仔猪，复制PRV在宿主体内潜伏感染建立与维持的过程，并在DNA和RNA水平上检测IE180、EP0、LAT和gD基因的转录情况。结果显示，病毒在宿主体内潜伏后，LAT基因持续转录，而IE180、EP0和gD基因的转录停止，证明PRV猪潜伏感染模型建立成功，为进一步研究PRV乃至α-疱疹病毒潜伏感染机理提供可靠的实验材料和数据。为确定DNA甲基化在PRV潜伏感染期EP0基因启动子区的分布情况，在对该基因启动子区CpG岛及相关转录因子预测的基础上，应用硫化测序PCR方法检测潜伏感染期EP0基因启动子区甲基化状态。结果表明，在该基因启动子区存在零星分散的甲基化位点，但这些散在的甲基化位点并不属于对“GC”盒敏感的转录因子结合位点处，初步表明潜伏感染期PRV EP0基因启动子区DNA甲基化可能未对该基因的转录起调控作用，为进一步研究DNA甲基化在PRV潜伏感染建立中的作用奠定基础。

关键词：伪狂犬病病毒潜伏感染期潜伏感染模型 EP0基因启动子甲基化分析

来源：评论

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HIV-1潜伏感染人Jurkat T细胞模型的建立

引用

中国艾滋病性病 2011年第4期17卷 387-390,394页

作者：李琳仇超李亮助刘爱平邱趁丽周明哲张晓燕徐建青朱焕章复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433 复旦大学附属上海市公共卫生临床中心复旦大学生物医学研究院上海201508 复旦大学上海医学院分子病毒学重点实验室上海200032 中国疾病预防控制中心传染病预防控制国家重点实验室北京102206

目的建立Ⅰ型艾滋病病毒(HIV-1)潜伏感染人Jurkat T细胞的模型,为进一步研究HIV-1潜伏感染机制奠定基础。方法利用一种表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的HIV-1假病毒感染人Jurkat T细胞,采用流式细胞术分选出GFP-细胞群,之后经激活剂曲古... 详细信息

目的建立Ⅰ型艾滋病病毒(HIV-1)潜伏感染人Jurkat T细胞的模型,为进一步研究HIV-1潜伏感染机制奠定基础。方法利用一种表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的HIV-1假病毒感染人Jurkat T细胞,采用流式细胞术分选出GFP-细胞群,之后经激活剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)刺激后,再次采用流式细胞术分选出GFP+细胞,并通过有限稀释法制备获得单克隆细胞系。利用流式细胞术及酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测单克隆细胞系在TSA刺激前后的GFP+细胞比例及HIV-1病毒抗原p24;并用Alu-长末端重复序列(LTR)套式聚合酶链反应(Nested PCR)检测单克隆细胞系中HIV-1基因组的整合情况。结果获得了5株HIV-1潜伏感染的Jurkat单克隆细胞系,对这5株单克隆细胞系分别进行激活剂处理,发现无论是GFP表达细胞比例或HIV-1病毒蛋白p24抗原的表达,皆显著高于激活剂处理前的背景表达水平(P<0.05);并能从这5个单克隆细胞系基因组中扩增出针对HIV-1基因组的特异条带。结论已获得的5株单克隆细胞系具有HIV-1潜伏细胞的生物学特点,表明已成功地建立了HIV-1潜伏感染细胞模型。该模型可用于各种药物或激活剂的筛选和检测,也为进一步研究HIV-1潜伏感染机制奠定了工作基础。

关键词：艾滋病病毒Ⅰ型 Jurkat T细胞系绿色荧光蛋白潜伏感染模型

来源：评论

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HIV-1潜伏的人Jurkat T细胞模型的建立及中国流行株HIV-1 B/C重组亚型感染人脐带血造血祖细胞的研究

HIV-1潜伏的人Jurkat T细胞模型的建立及中国流行株HIV-1 B/C重组...

引用

作者：李琳复旦大学

学位级别：硕士

高效抗逆转录病毒疗法有效地抑制了HIV的病毒复制,减缓了疾病进程,但并不能彻底清除HIV。这其中重要的原因在于由HIV潜伏感染细胞构成的病毒储存库的存在。而建立HIV潜伏感染相关的各种体外细胞模型,则有助于阐明HIV潜伏储存库的形成机... 详细信息

高效抗逆转录病毒疗法有效地抑制了HIV的病毒复制,减缓了疾病进程,但并不能彻底清除HIV。这其中重要的原因在于由HIV潜伏感染细胞构成的病毒储存库的存在。而建立HIV潜伏感染相关的各种体外细胞模型,则有助于阐明HIV潜伏储存库的形成机制以及用于清除储藏库的药物筛选。此外,国外对HIV-1能否感染造血祖细胞尚未定论,中国流行株HIV-1 B/C重组亚型能否感染人造血祖细胞也未见报道,对该问题的探讨也将为建立HIV-1在造血祖细胞上的潜伏模型奠定基础。鉴于此,本课题利用分子生物学、细胞生物学及病毒学等方法手段,对上述问题进行了如下研究：在第一部分的研究中,首先,我们制备了一种表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)的HIV-1假病毒。采用离心感染的方式以106TCID50的病毒剂量感染人Jurkat T细胞后,采用流式细胞术分选出GFP-细胞群。然后,经激活剂(200 nM TSA和10ng/ml PMA)刺激,用流式细胞术再次分选出GFP+细胞,并通过有限稀释法制备并筛选获得5个单克隆细胞系。最后,对这5个单克隆细胞系在激活剂刺激前后HIVp24抗原的表达进行了检测,并进一步用巢式Alu-LTR PCR的方法证实了这些单克隆细胞系基因组中整合有HIV-1的基因组。这些结果显示出我们已成功地建立了HIV-1潜伏感染细胞模型。该模型可用于各种药物或激活剂的筛选和检测,为进一步研究HIV-1潜伏感染机制打下了工作基础,也为建立HIV-1其他类型细胞潜伏感染模型奠定了基础。在第二部分的研究中,首先,我们从健康产妇的脐带血中用免疫磁珠法分离获得纯度为95-99%且具备多向分化能力的造血祖细胞(Hematopoietic Progenitor Cells,HPCs)。然后,制备HIV-1 B/C重组亚型的假病毒,采用不同剂量(50 TCID50、200 TCID50、1000 TCID50)的假病毒感染CD34+ HPCs,在多个时相点上用Elisa方法检测细胞上清中p24的表达水平,结果显示出p24的表达水平与其感染病毒剂量高低有关；Alu-LTR PCR检测结果显示出HIV-1病毒基因能够整合在宿主基因组上。这些研究结果提示了中国流行株HIV-1 B/C重组亚型能够感染人脐带血造血祖细胞。最后,我们进一步用流式直标抗体染色及Real-time PCR方法对CD34+ HPCs上受体的表达进行了检测,其结果显示CD34+ HPCs亚群不同程度上有HIV-1感染所需的CD4、CR5和CXCR4等受体的表达,提示了HPCs这些表面受体的存在可能是被HIV-1感染的原因。

关键词： HIV-1 潜伏感染模型 Jurkat细胞 HIV-1 B/C重组亚型造血祖细胞(HPCs)

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