检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：冯会强吉林大学

学位级别：硕士

灰葡萄孢菌是一种全球重要的植物病原真菌,属于典型的死体营养型,寄主范围十分广泛,能够侵染多达1400种植物。该菌不仅能在植物生长期侵染,也能在果蔬储藏期侵染发病,危害广泛,损失严重。目前灰葡萄孢菌作为一种模式植物病原备受关注,... 详细信息

灰葡萄孢菌是一种全球重要的植物病原真菌,属于典型的死体营养型,寄主范围十分广泛,能够侵染多达1400种植物。该菌不仅能在植物生长期侵染,也能在果蔬储藏期侵染发病,危害广泛,损失严重。目前灰葡萄孢菌作为一种模式植物病原备受关注,但关于其寄主侵染过程的分子机理仍不清楚。在过往的研究中发现,灰葡萄孢菌需要形成特定的侵染结构:附着胞或侵染垫,才能正常侵入寄主,进一步分泌多种致病因子杀死寄主从而获取营养。此外,隔膜蛋白septin作为真核生物中一类高度保守的蛋白家族,参与细胞骨架,细胞周期,细胞分泌等多项生命过程并发挥重要功能。在真菌中septin蛋白家族具有四个核心成员:Sep3、Sep4、Sep5、Sep6,其中Sep4是最小的蛋白。本研究重点解析新型细胞骨架隔膜蛋白septin如何在灰葡萄孢菌生长发育发挥功能,并参与寄主侵染过程,主要研究结果如下:(1)通过生物信息学分析,检索到灰葡萄孢菌中四个核心septins组分:BcSep3、BcSep4、BcSep5、BcSep6;(2)利用农杆菌介导转化,同源重组基因替换的方法,筛选获得灰葡萄孢菌四个核心septin基因敲除突变体ΔBcsep3,ΔBcsep4,ΔBcsep5,ΔBcsep6菌株。通过致病性分析,结果表明核心septins组分是灰葡萄孢菌致病所必需的;(3)通过野生型与突变体表型差异分析,发现BcSep4是灰葡萄孢菌侵染结构发育所必需的;另外,BcSep4还在灰葡萄孢菌无性繁殖、芽管发育、柔性生长、逆境响应、胞内物质运输等过程中发挥重要功能;(4)通过GFP融合亚细胞定位,证明BcSep4可能通过参与脂膜微曲面形成,调控灰葡萄孢菌生长发育和侵染结构形成过程;(5)利用二亚苯基碘(diphenylene iodonium,DPI)和环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)处理,发现灰葡萄孢菌BcSep4在侵染结构形成过程中受活性氧ROS信号传导调控,并与cAMP信号传导有关;(6)通过对四个核心septin基因缺失突变体菌株ΔBcsep3、ΔBcsep4、ΔBcsep5、ΔBcsep6生物表型分析,发现四个核心septin组分都是灰葡萄孢菌侵染结构形成所必需的;(7)对四个核心septin组分分别进行亚细胞定位,结果表明BcSep3、BcSep4、BcSep5、BcSep6在胞内能够以不同的自我组装分配模式,影响细胞极性,共同调控灰葡萄孢菌生长发育和侵染结构形成。本研究首次解析灰葡萄孢菌septin的生物学功能,让我们对灰葡萄孢菌的生长发育和分子致病机理有了更深入的认识。由于植物中没有septin存在,因此未来可能作为潜在的防治靶标应用于农业防治中。

关键词：灰葡萄孢菌隔膜蛋白septin 侵染结构致病性亚细胞定位活性氧ROS

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灰葡萄孢菌菌株CanBC-3致病力衰退及其机制研究

灰葡萄孢菌菌株CanBC-3致病力衰退及其机制研究

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作者：周宇华中农业大学

学位级别：硕士

灰葡萄孢菌菌株CanBC-3刚分离时为一强毒菌株,在实验室培养一段时间之后,表型发生明显改变,包括致病力衰退、生长缓慢和菌落形态异常等现象。这些变化可能是灰葡萄孢菌致病因子发生变化引起的,对这些因子的研究,有助于深入理解灰葡萄孢... 详细信息

灰葡萄孢菌菌株CanBC-3刚分离时为一强毒菌株,在实验室培养一段时间之后,表型发生明显改变,包括致病力衰退、生长缓慢和菌落形态异常等现象。这些变化可能是灰葡萄孢菌致病因子发生变化引起的,对这些因子的研究,有助于深入理解灰葡萄孢菌的致病机制。本研究主要以弱致病性菌株CanBC-3为材料进行了以下研究: 首先,对源于菌株CanBC-3的两类灰葡萄孢菌衍生后代进行了致病性测定、培养特性观察和生物量测定。结果表明:以CanBC-3V为代表的衍生菌株为强致病性菌株,菌丝生长较快,菌落扩展均匀,生物量高。而以CanBC-3HV为代表的另一类菌株为弱致病性菌株,菌丝生长慢,菌落扩展不均匀,生物量低。其次,分析了灰葡萄孢菌菌株CanBC-3HV的垂直传染规律和水平传染规律。结果表明:菌株CanBC-3HV可以通过菌核、分生孢子和原生质体再生将它的弱毒特性传染给后代,但是传染频率较低,这种传染称为垂直传染。菌株CanBC-3HV也可以把它的弱毒特性传给其它强毒灰葡萄孢菌菌株,这种传染属于水平传染。结果表明:CanBC-3HV的水平传染具有菌株特异性,即只能传染给CanBC-3来源的强毒菌株,而不能传染给非CanBC-3来源的强毒菌株。再次,比较了灰葡萄孢菌菌株CanBC-3HV(弱致病型)和CanBC-3V(强致病型)在产生酸、毒素、蛋白酶、淀粉酶和果胶酶,以及在形成侵染垫结构等方面的差异。结果表明:致病力弱的菌株CanBC-3HV在产生酸、毒素、蛋白酶和淀粉酶等方面并未受到明显抑制,果胶酶产量稍微受到抑制。但是,菌株CanBC-3HV侵染结构形成率较低,36h仅为3%,低于强毒菌株CanBC-3V,36h可以达到98%。因此初步估计菌株CanBC-3HV是由于菌丝生长受阻而引起的侵袭力衰退。最后,分析了灰葡萄孢菌菌株CanBC-3HV致病力衰退的原因。结果表明:灰葡萄孢菌菌株CanBC-3HV的致病力衰退与dsRNA、内生细菌和转座子无关。此外,本研究观察到一种现象:在灰葡萄孢菌菌株CanBC-3HV菌丝细胞内出现了细胞结构。

关键词：灰葡萄孢菌弱毒株CanBC-3HV 果胶酶侵染结构致病力

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灰葡萄孢菌泛素化相关因子BcUBI4的生物学及致病功能研究

灰葡萄孢菌泛素化相关因子BcUBI4的生物学及致病功能研究

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作者：陈雪婷吉林大学

学位级别：硕士

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea),又称灰霉菌,是一种寄主范围十分广泛的死体营养型植物病原真菌,可侵染超过1000种寄主植物,在农业生产过程中造成巨大的经济损失。灰葡萄孢菌可侵染植物的不同器官,在各生长阶段造成危害。灰葡萄孢菌主要... 详细信息

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea),又称灰霉菌,是一种寄主范围十分广泛的死体营养型植物病原真菌,可侵染超过1000种寄主植物,在农业生产过程中造成巨大的经济损失。灰葡萄孢菌可侵染植物的不同器官,在各生长阶段造成危害。灰葡萄孢菌主要以分生孢子侵染寄主,分生孢子接触寄主后,受到一系列信号调控,诱导分生孢子萌发生成芽管、附着胞、侵染垫侵入宿主细胞,灰葡萄孢菌还通过分泌各类细胞壁降解酶降解寄主细胞壁、小分子毒素杀死寄主并获取营养以满足自身生长发育。尽管如此,我们对灰葡萄孢菌的致病相关因子及其如何调控该菌的致病力的认识仍有待完善。泛素是一种高度保守的由76个氨基酸组成的蛋白质,泛素化过程是指一类分子质量较小的蛋白质通过激活酶、结合酶、连接酶和降解酶等这些特殊酶的作用,进行特异性修饰的过程。同时,在参与细胞的分化、基因表达、转录调节、信号传递和发病机制等近乎所有生命活动的调控。在灰葡萄孢的致病过程中,有许多致病相关基因参与,但目前仍有许多基因功能未知,关于泛素化蛋白UBI4在调控植物病原真菌,尤其是灰葡萄孢菌的致病发育、致病力及致病机制方面尚缺乏相关研究。本研究重点阐析编码泛素化蛋白的BcUBI4基因在灰葡萄孢菌致病过程中发挥的作用。通过筛选本实验室构建的约含5万个T-DNA插入转化子群体,获得一株致病力致弱的突变体株M22017,通过TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)即热不对称交错PCR分析发现T-DNA插入到灰霉菌基因组中编码泛素蛋白基因BcUBI4上游。为研究BcUBI4功能,本研究利用同源重组和农杆菌介导的遗传转化方法获得了灰葡萄孢菌BcUBI4基因缺失突变体ΔBcubi4-1、ΔBcubi4-2,以及回补转化子ΔBcubi4-C,致病性检测发现BcUBI4基因影响灰葡萄孢菌致病过程。通过对比分析野生型B05.10与BcUBI4基因缺失突变体菌株的生长,侵染寄主能力及逆境胁迫应答,我们发现BcUBI4基因缺失突变体在生长过程中和侵染初期表现出明显差异,具体结果如下:1.对灰葡萄孢菌野生型、BcUBI4缺失突变体和回补菌株进行表型分析发现相较于灰葡萄孢菌的野生型菌株和回补菌株,突变体株生长显著迟缓。同时,BcUBI4能够调控灰葡萄孢菌的致病力,参与调控分生孢子产生、侵染垫形成、菌核形成等过程。BcUBI4的缺失严重影响突变体在菌丝伸长、菌落形态等正常生长过程。UBI4缺失突变体不产生分生孢子,无法形成完整侵染结构以侵入寄主植物细胞,几乎完全丧失致病力。这表明BcUBI4可能通过调控病原菌的致病相关发育过程,进而调控灰葡萄孢菌的致病力。2.在对BcUBI4可能参与调控灰葡萄孢菌对逆境胁迫的应答探究中,我们在CM培养基中添加几种不同外源化合物以模拟灰葡萄孢菌受到不同的环境胁迫,其中通过添加0.005%SDS,0.01%SDS和600μg/m L的刚果红来培养B05.10、ΔBcubi4-1、ΔBcubi4-2及ΔBcubi4-C的结果显示,BcUBI4基因缺失突变体株的生长抑制率显著高于野生型菌株和回补菌株的生长抑制率。预示BcUBI4很可能参与了灰葡萄孢细胞壁合成过程。使用外源26S蛋白酶体抑制剂硼替佐米抑制泛素介导的蛋白水解,显著抑制了灰葡萄孢菌的分生孢子萌发,结果与UBI4缺失突变体的实验表型较为一致。此外,将野生型菌株B05.10培养在含硼替佐米的平板培养基上,UBI4基因的表达受到了明显的抑制,进一步印证了UBI4通过参与泛素化过程调控灰葡萄孢菌的致病相关发育,进而调控其致病力。因此,本研究推断灰葡萄孢菌泛素相关调控因子BcUBI4对纤维素的合成及降解相关调控可能是其参与病原菌侵入过程的重要途径。本研究系统解析了灰葡萄孢菌BcUBI4基因的生物学及致病力功能,研究结果有助于我们对BcUBI4致病相关因子在植物病原真菌中所发挥的作用的认识,同时能够靶向研究在泛素通路上BcUBI4可能发挥的作用,为防治重要植物病原真菌新药物的研发提供的潜在的新作用分子靶点,同时也为制定灰霉病防控新策略提供科学依据。

关键词：灰葡萄孢菌 UBI4 泛素化致病性抑制孢子萌发

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灰葡萄孢菌的诱变及其致病性研究

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新疆农业科学 2011年第5期48卷 877-881页

作者：林慧珍苟萍新疆大学生命科学与技术学院乌鲁木齐830046

【目的】研究灰葡萄孢菌抗AbA(短梗霉素A)突变体的诱变方法与AbA对灰葡萄孢菌及其突变体细胞形态和致病力。【方法】以野生型灰葡萄孢菌为出发菌株,用不同浓度的EMS诱变和AbA筛选,获得抗AbA的突变菌株。【结果】AbA显著影响灰葡萄孢菌... 详细信息

【目的】研究灰葡萄孢菌抗AbA(短梗霉素A)突变体的诱变方法与AbA对灰葡萄孢菌及其突变体细胞形态和致病力。【方法】以野生型灰葡萄孢菌为出发菌株,用不同浓度的EMS诱变和AbA筛选,获得抗AbA的突变菌株。【结果】AbA显著影响灰葡萄孢菌细胞形态,如孢子萌发延迟、芽管粗短、顶端分支增多、抑制菌丝生长,并且降低致病力。AbA对突变菌株细胞形态无影响,而对其致病力有一定的增强作用。【结论】确定了灰葡萄孢菌抗AbA突变体的诱变条件,证明了突变体能抵抗AbA对细胞形态和致病力的影响。

关键词：灰葡萄孢菌诱变突变体形态致病力

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灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）对苯噻菌酯和咯菌腈的抗药性风险研究

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）对苯噻菌酯和咯菌腈的抗药性风险...

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作者：武东霞南京农业大学

学位级别：硕士

由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是一种世界性病害,在蔬菜、果树、花卉等200多种植物中均能发生。该病的防控主要以化学防治为主。但由于灰葡萄孢菌是一种高抗药性风险的病原菌,对生产中常用的杀菌剂如多菌灵、乙霉威、... 详细信息

由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是一种世界性病害,在蔬菜、果树、花卉等200多种植物中均能发生。该病的防控主要以化学防治为主。但由于灰葡萄孢菌是一种高抗药性风险的病原菌,对生产中常用的杀菌剂如多菌灵、乙霉威、嘧霉胺、腐霉利和啶酰菌胺等已经产生了抗药性,造成严重的经济损失。苯噻菌醋（benzothiostrobin）是由华中师范大学创制的一种新型甲氧基丙烯酸醋类杀菌剂（Qols）,具有高效、广谱的抗菌活性,已经进入我国的农药登记程序。本文通过研究灰葡萄孢菌对苯噻菌酯的生物学特性、建立敏感性基线,评估其抗性发生的风险,并初步探讨其抗性机制,为灰霉病的可持续防控提供理论基础。研究结果表明:1.苯噻菌酯对灰葡萄孢菌的菌丝生长和孢子萌发具有强烈的抑制作用,且抑菌活性高于同类杀菌剂嘧菌酯;2.苯噻菌酯具有较好的跨层运输能力,但向上和向下的输导活性差,对灰霉病具有很好的保护作用,25 μg/mL时防效高达95%以上;3.采用菌丝生长速率法建立了灰葡萄孢菌对苯噻菌酯的敏感性基线,EC50值变化范围是0.0033～0.3921 μg/mL,平均EC50值为0.0859±0.0788 μg/mL,敏感性频率分布呈单峰曲线;4.苯噻菌酯与其它Qols如嘧菌酯、醚菌酯和吡唑醚菌酯存在正交互抗性,但与不同作用机制的杀菌剂无交互抗性;5.苯噻菌酯抗性菌株的生物适合度（菌丝生长、产孢能力和致病力）与敏感菌株相比无显著性差异;6.抗性菌株的细胞色素b（Cytb）143位发生点突变,基因型为G143A。综上所述,评估灰葡萄孢菌对苯噻菌酯存在较高的抗药性风险,建议苯噻菌酯与其它作用机制的杀菌剂混合使用来有效控制灰霉病,以降低抗药性发生的风险。由瑞士先正达公司开发的咯菌腈（fludioxonil）是目前防治灰霉病的有效药剂之一,2012年在我国获得登记。但国外已有灰葡萄孢菌对咯菌腈低水平抗性的报道。本文于2012-2014年检测了江苏和山东部分地区灰葡萄孢菌对咯菌腈的抗药性情况,并从生理生化和分子水平上研究了田间、室内抗药性突变体的特性,对咯菌腈的科学使用和抗性机理研究具有重要意义。结果表明:1.江苏地区未发现抗性菌株,但是从2013年分离自山东寿光的黄瓜灰葡萄孢菌和2014年分离自山东潍坊的番茄灰葡萄孢菌株中,发现了抗性菌株,低抗频率分别为10.67%和17.21%,高抗频率分别为2.67%和1.30%,这是在国际上首次发现田间高抗咯菌腈菌株;2.药剂离体驯化获得了 6株咯菌腈抗性突变体,抗性稳定,抗性倍数30～>10000;3.与敏感菌株相比,田间高抗菌株和药剂驯化抗性突变体的生物适合度（菌丝生长速率、产孢能力、致病力）均显著下降,并且对渗透胁迫（如0.8 M葡萄糖、0.5 M山梨醇、0.5 MNaCl、0.5 MKC1、0.2MCaCl2和0.3MMgCl2）高度敏感;4.用1μg/mL咯菌腈处理4h后,敏感菌株菌丝体内甘油含量及Bchog1表达量显著上升,上升幅度显著高于田间、室内咯菌腈抗性突变体;5.田间、室内高抗突变体的Bos1基因均发生突变,但二者有显著差异:田间高抗菌株的突变位点均位于该基因近N末端的HAMPs结构域,而药剂驯化高抗突变体的突变类型分为两种,位于HAMPs结构域,或者位于近C末端的HATPasec结构域。因此推测:灰葡萄孢菌对咯菌腈高水平抗药性的产生是由菌体Ⅲ型双组份组氨酸激酶Bos1的突变引起的,该突变降低了菌体在药剂胁迫下HOG-MAPK途径的激活水平,使菌体内部甘油含量保持相对稳定,进而使其在药剂作用下存活下来。田间咯菌腈抗性群体的形成应引起人们密切关注,需改变该药剂的使用技术,降低药剂的选择压力,采用与其它杀菌剂轮换或混配使用技术,延缓抗药性的形成、发展和流行。频繁使用单作用位点的现代杀菌剂容易产生抗药性,为了延长现有防治灰霉病药剂的使用寿命,本文通过复配技术,旨在筛选出有效成分相容性好、生物活性高、增效作用显著的杀菌剂配方,这对灰霉病的防治及抗药性治理具有重要的现实意义。结果表明:1.苯噻菌酯与A、苯噻菌酯与B分别以1:1、1:4混配时增效作用最显著,SR值分别为3.2和2.5;2.这2种复配剂对灰霉病的温室防效优异,在25 μg/mL时防效达到100%,而且复配剂对灰霉病的防效要优于相同剂量各个单剂的防效;3.筛选出的这2个配方对灰葡萄孢菌多抗菌株也具有优异的抑菌活性,EC50均小于0.06 μg/mL,且MIC<0.5 μg/mL。因此,本文研发的2个杀菌剂配方对灰霉病的抗药性治理具有重要价值,但仍需要进一步通过田间药效试验进行评价。

关键词：灰葡萄孢菌苯噻菌酯咯菌腈抗药性风险抗性机制复配

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灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）突变体库的构建及致病相关基因克隆和鉴定

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）突变体库的构建及致病相关基因克...

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作者：刘佳浙江工业大学

学位级别：硕士

灰葡萄孢菌(Botrytis cineea)既是一种重要的植物病原真菌,也是研究植物与微生物相互作用的重要模式生物之一,从全基因组水平分析研究该真菌关键基因的功能,可以加速对灰葡萄孢生物学及其致病分子机制的认识。本实验利用根癌农杆菌(Agro... 详细信息

灰葡萄孢菌(Botrytis cineea)既是一种重要的植物病原真菌,也是研究植物与微生物相互作用的重要模式生物之一,从全基因组水平分析研究该真菌关键基因的功能,可以加速对灰葡萄孢生物学及其致病分子机制的认识。本实验利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的T-DNA插入技术对灰葡萄孢菌进行了遗传转化,转化效率达每106个分生孢子>80个转化子,得到了 465多个转化子,并对转化子进行了遗传选择标记潮霉素抗性稳定性检测以及单胞分离纯化和单核鉴定后,进行了番茄叶片侵染测定,筛选出了几个抗性稳定遗传且致病力降低的转化子,通过PCR扩增选择标记基因潮霉素基因对转化子进行了分子鉴定。利用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术扩增了 11个转化子的T-DNA插入位点旁侧序列,共扩增出43个侧翼片段,经过载体克隆成功完成了 27个片段的序列测定,并对序列进行了分析,获得了 9个T-DNA插入到基因内部的突变体。对插入的T-DNA边界序列进行分析后发现,左边界(left border,LB)整合到真菌基因组的概率较高,碱基缺失较少,有的保持完整,缺失后的序列和完整的LB序列相比相似度在59-90%范围内。而右边界(right border,RB)及其近邻的T-DNA区域缺失碱基较多,大部分片段的RB序列全部丢失。RB的碱基切除位置则有一定的保守性,发生在5'-TTTG-和其后的碱基-A-3'之间。除了碱基丢失,还发现有额外的序列的插入,不同插入位置的T-DNA中额外插入的碱基序列和长度不同。选取其中致病性减弱的转化子进行Southern blot分析,发现3个为T-DNA单拷贝插入,这三个转化子分别是7、H-96和H-79。根据T-DNA旁侧序列分析,其中7号突变体中T-DNA插入基因编码功能未知蛋白。H-96中T-DNA插入位点的预测基因编码一种与含未知功能的结构域DUF221家族蛋白相似的蛋白。H-79中T-DNA插入的预测基因编码一种与真菌蛋白磷酸酶2A调控B亚基(protein phosphatase 2A regulatory B subunit)相似的蛋白,H-79 突变体表现为生长速率减缓、产孢能力减弱、菌丝稀疏、对番茄的致病能力减弱,该基因命名为BcPP2A。利用RT-PCR分析表明该基因表达丧失,从而基因表达水平上确认基因功能的插入失活。克隆了 BcPP2A的基因组序列(启动子-编码区-终止序列),构建双元表达载体并转入农杆菌进行该基因遗传互补和功能验证。利用RACE技术对BcPP2A全长cDNA进行了初步克隆试验。另外,对7号突变体进行了遗传互补及表型鉴定。

关键词：灰葡萄孢菌根癌农杆菌介导转化 T-DNA插入突变 TAIL-PCR RACE 克隆互补基因

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灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）中与咯菌腈作用机理相关基因BcSln1和BcSho1的生物学功能研究

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）中与咯菌腈作用机理相关基因BcSl...

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作者：杨亚兰南京农业大学

学位级别：硕士

由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是世界十大病害之一,可引起以番茄、葡萄、草莓等为主的至少200多种植物发病。由于灰葡萄孢菌繁殖速度快,变异性强,转座子活跃,目前该病仍以化学防治为主。但用于防治灰霉病的大多数药剂都... 详细信息

由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是世界十大病害之一,可引起以番茄、葡萄、草莓等为主的至少200多种植物发病。由于灰葡萄孢菌繁殖速度快,变异性强,转座子活跃,目前该病仍以化学防治为主。但用于防治灰霉病的大多数药剂都已产生抗药性,甚至失效。咯菌腈作为一种新型杀菌剂,作用机制独特,对防治灰霉病有特效,在许多国家均已登记使用,但在我国尚处于早期阶段,近几年逐渐开始用于灰霉病的防治。已有报道咯菌腈作用位点为Ⅲ型组氨酸激酶,作用机制与HOG途径相关,但其毒理学研究尚不透彻。本文通过构建灰葡萄孢菌HOG途径两个分支上游元件组氨酸激酶Sln1和细胞膜感应蛋白Sho1的敲除突变体、回复突变体及双敲突变体,研究它们生物学功能、二者之间互作关系。具体研究结果如下:本文构建了BcSho1 敲除突变体、完全回复突变体及不含跨膜结构域的部分回复突变体,发现该蛋白定位于菌体细胞膜和隔膜上;若去掉该基因跨膜结构域,则游离于细胞质中。BcSho1基因敲除导致菌体较出发菌株对咯菌腈敏感性略有下降,但与其回复突变体之间差异不显著;该基因参与调控灰葡萄孢菌对氧化胁迫、细胞壁胁迫因子敏感性,但与致病性无关;该基因在菌体对菌丝生长、温度敏感性、甘油合成、不同氮源利用能力及对碱性环境适应性方面具有重要作用,且其跨膜结构域参与调节菌体对碱性环境的适应性。构建了BcSln1和BcSho1的单基因敲除突变体及二者的双敲突变体,研究发现BcSln1基因与灰葡萄孢菌对腐霉利的敏感性无关,BcSln1敲除突变体对咯菌腈敏感性没有变化,但在咯菌腈处理条件下菌体甘油合成量上升;而双敲除突变体ΔBcSln1-Sho1对咯菌腈敏感性增加,但甘油产生能力相对于出发菌株B05.10没有明显变化,推测可能存在其它补偿途径或相关机制。BcSln1基因与灰葡萄孢菌致病性和对温度的调控无关,与不同类型化合物产生的渗透、氧化压和细胞壁胁迫因子敏感性变化相关,但存在差异性反应。BcSln1影响菌体对碱性环境的耐受力,但与BcSho1基因没有相互作用。同时发现BcSln1和BcSho1都参与调控灰葡萄孢菌对不同氮源的利用能力,且二者之间存在相互作用。

关键词：灰葡萄孢菌咯菌腈生物学功能 BcSho1 BcSln1

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灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）对两种呼吸抑制剂烯肟菌胺和氟吡菌酰胺的抗性风险评估

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）对两种呼吸抑制剂烯肟菌胺和氟吡...

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作者：张晓柯南京农业大学

学位级别：硕士

由子囊菌亚门的灰葡萄抱菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病,是一种重要的世界性病害。该病原菌寄主十分广泛,能够侵染200余种植物,包括水果、蔬菜、花卉等植物,可造成重要的经济损失。目前,由于缺少有效的抗病品种,且该病原菌具有产孢量... 详细信息

由子囊菌亚门的灰葡萄抱菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病,是一种重要的世界性病害。该病原菌寄主十分广泛,能够侵染200余种植物,包括水果、蔬菜、花卉等植物,可造成重要的经济损失。目前,由于缺少有效的抗病品种,且该病原菌具有产孢量大,繁殖速度快、易产生遗传变异等特点,因此,在生产上灰霉病的防控主要以化学防治为主。烯肟菌胺(SYP-1620)和氟吡菌酰胺(Fluopyram)是两种新型的线粒体呼吸抑制剂。前者是由沈阳化工研究院研发、于2009年在我国完成登记的一种新型、广谱杀菌剂,其作用于菌体线粒体复合物Ⅲ(细胞色素bcl复合体Qo位点)的泛醌,抑制其呼吸作用。然而目前,烯肟菌胺对灰葡萄孢菌的生物学研究尚未涉及。氟吡菌酰胺是由拜耳研发的,于2012年在我国完成登记,是一种作用于菌体线粒体复合物Ⅱ[琥珀酸脱氢酶(SDH)]的新型杀菌剂,可用于防治70多种作物病害,其中对灰葡萄孢菌、白粉病菌、核盘菌和丛梗孢属引起的病害有特效。然而,氟吡菌酰胺在灰霉病的防治方面研究较少。因此,本文研究了灰葡萄孢菌对两种新型呼吸抑制剂烯肟菌胺和氟吡菌酰胺的生物学特性,旨在揭示这两种抑制剂与同类药剂之间的差异与相似,从而为灰霉病的防治提供合理的科学指导。本研究主要获得的结果如下:首先,研究了灰葡萄孢菌对烯肟菌胺的敏感性基线及潜在抗性风险。结果表明:在离体条件下,烯肟菌胺对灰葡萄孢菌菌丝生长及孢子萌发均表现出很强的抑菌活性,采用菌丝生长速率法建立的108株灰葡萄孢菌对烯肟菌胺的敏感性基线平均EC50为 0.0130 ±0.0109 μg/mL,孢子萌发法的平均 EC50 为 0.01147 ±0.0062 μg/mL;无论是在草莓还是黄瓜幼苗上,烯肟菌胺均表现出良好的保护与治疗作用,且保护作用优于治疗作用;与敏感菌株相比,烯肟菌胺抗性突变体适合度略有降低;该杀菌剂与同类杀菌剂嘧菌酯有正交互抗性,与其它类型的杀菌剂无交互抗性;所测定的抗药性突变体均在cyt b基因发生单点突变(G143A)。因此,研究结果表明,灰葡萄孢菌对烯肟菌胺具有高水平抗药性风险;烯肟菌胺具有与其他QoIs相类似的毒理学机制。其次,研究了灰葡萄孢菌对氟吡菌醜胺的抗性风险及抗性检测技术。结果表明:100株灰葡萄孢菌菌丝生长平均EC50为1.94 ± 1.55 μg/mL,所建敏感性基线接近正态分布;氟吡菌酰胺的田间抗性菌株适合度显著低于敏感菌株,均在琥珀酸脱氢酶B亚基发生单点突变(H272R);但田间抗性菌株与同类杀菌剂啶酰菌胺及其它类型的杀菌剂之间不存在正交互抗性;因此,研究结果表明,灰葡萄孢菌对氟吡菌醜胺的抗性风险属于低至中等水平;利用反向引物3'端加入错配碱基,建立了 ASO-PCR快速检测抗性基因型(H272R)的分子检测技术,该技术能够快速、有效的检测田间特定抗性基因型菌株。最后,研究了灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶C亚基氨基酸多态性与SDHIs药敏性之间的关系。在前面研究中,我们发现部分氟吡菌酰胺抗、感菌株C亚基均发生了变化,且对药剂的敏感性差异很大,我们推测,敏感性的差异可能与SDHIs的靶标SDH有关。为此,本文分析了来自我国不同区域的52株田间灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶B、C和D亚基的全序列,与测序菌株B05.10相比,发现仅C亚基氨基酸序列存在多态性,共分为5种类型(C0-C4)。这5种类型的菌株对SDHIs药敏性及生物适合度存在显著性差异。通过基因替换技术,构建了无遗传背景差异的5种氨基酸序列多态性的载体,经过PCR验证和Southern杂交验证,获得了相应的突变体(R-CO—R-C4),测定了这5种突变体对啶酰菌胺和氟吡菌醜胺的敏感性,结果表明:R-C0突变体对SDHIs的敏感性明显的高于其余4种多态性突变体。在菌丝生长、产孢量、对碳源利用能力、番茄和草莓叶片上致病力测定中,5种多态性突变体之间存在显著性差异;但在苹果及洋葱上的致病力差异不显著。此外,在一定浓度百草枯作用下,R-C0突变体对百草枯诱导的氧化胁迫的耐受性要低于其余4种多态性突变体。综上所述,烯肟菌胺和氟吡菌酰胺对灰葡萄孢菌均具有很强的抑菌活性,可以用来防治田间的灰霉病,但在实际生产中应注意采用药剂交替使用或混用从而延长杀菌剂的使用寿命。在交互抗性测定中,烯肟菌胺与同类嘧菌酯有正交互抗性,它们之间存在相同的作用机制,而氟吡菌酰胺与啶酰菌胺不存在正交互抗性,作用机制可能存在一定的差异。C亚基多态性与SDHIs类药剂的敏感性有关。

关键词：烯肟菌胺氟吡菌酰胺灰葡萄孢菌生物活性抗性研究 SdhC亚基氨基酸多态性

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灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶基因内含子的结构与调控功能研究

灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶基因内含子的结构与调控功能...

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作者：邱永春新疆大学

学位级别：硕士

真核生物基因非编码序列结构及调控机制的研究是当今生物学研究的新领域，植物病原真菌内含子调控基因表达还鲜为人知。前期获得了抗AbA的灰葡萄孢菌突变株，该突变株的肌糖磷脂酰神经酰胺(IPC)合成酶基因(BcAUR1)缺失内含子，通过测定... 详细信息

真核生物基因非编码序列结构及调控机制的研究是当今生物学研究的新领域，植物病原真菌内含子调控基因表达还鲜为人知。前期获得了抗AbA的灰葡萄孢菌突变株，该突变株的肌糖磷脂酰神经酰胺(IPC)合成酶基因(BcAUR1)缺失内含子，通过测定突变株AUR1的mRNA表达量和IPC合成酶活力，证实了BcAUR1中的内含子对AUR1基因表达具有抑制作用。通过生物信息学分析了酵母和灰葡萄孢菌AUR1基因内含子序列，发现灰葡萄孢菌AUR1基因内含子序列具有与酵母类似的5′剪接位点、3′剪接位点和分支点的保守序列，它们是内含子正确剪接所必需的。以灰葡萄孢菌的cDNA为模板，扩增BcAUR1基因的3′UTR序列，将其构建到pTFCM中。分别将野生型BcAUR1基因和缺失内含子序列1的BcAUR1基因构建到pTFCM-3'UTR中，以3′UTR序列作为同源重组的右臂，AUR1基因的5′序列作为左臂，构建出阳性对照（pTFCM-BcAUR1-HYG-3′UTR）和缺失内含子序列1（pTFCM-BcAUR1-Δ1-HYG-3′UTR）的质粒。将两种质粒通过电击转化根癌农杆菌，获得的根癌农杆菌转化子再转化灰葡萄胞菌，两种质粒的BcAUR1-HYG-3′UTR和BcAUR1-Δ1-HYG-3′UTR与灰葡萄胞菌中的BcAUR1发生同源重组的转化子是具有潮霉素抗性的。通过潮霉素筛选，得到了的灰葡萄胞菌阳性对照转化子、缺失内含子的序列1的转化子。通过实时定量测定灰葡萄胞菌转化子mRNA表达量，高效液相测定IPC合成酶活性。结果表明，阳性对照转化子的mRNA表达量和IPC合成酶活性比野生型灰葡萄孢菌低，说明转化子中的潮霉素基因可能引起了AUR1基因表达下调和IPC合成酶活性下降。缺失内含子序列1的转化子mRNA表达量和IPC合成酶活性比阳性对照低，说明AUR1基因缺失内含子序列1也能下调AUR1基因表达，降低IPC合成酶活力，因此推测内含子序列1可能是对AUR1起正调控作用的元件。在不含AbA的培养条件下，阳性对照转化子的生长稍迟于野生型，缺失内含子序列1的转化子的生长缓慢，孢子萌发和菌丝生长延迟了24h，72h未见分生孢子头的形成。这些结果表明转化子中的潮霉素基因对菌体生长有一定的影响，而且AUR1基因中缺失内含子序列1能抑制菌体的生长。在含AbA的培养条件下，野生型孢子比不加AbA时延迟12h萌发，72h未见孢子形成；阳性对照转化子的孢子萌发延迟到24h，缺失内含子序列1的转化子在72h时未见萌发生长。这些结果表明AbA能抑制孢子萌发、菌体的生长。阳性对照、缺失内含子序列1的转化子菌株的草酸分泌量比野生型分别减少33.7%、63.1%，这说明潮霉素基因和缺失内含子序列1都减少菌株的草酸分泌，因此它们的致病性也比野生型弱。在含有AbA条件下，野生型、阳性对照、缺失内含子序列1的转化子分别与不含AbA时相比，草酸分泌量减少45.5%、46.1%和58.3%，表明AbA能显著减少草酸分泌，潮霉素基因和缺失内含子1序列对AbA导致的草酸分泌减少无抵抗性。阳性对照和缺失内含子的序列1的转化子菌株的纤维素酶和木聚糖酶活力相对于野生型分别减少了15.2%、48%和13.0%、59.7%；含有AbA比缺乏AbA时也分别减少28.3%、36.8%、46.4%和31.4%、31.2%、25.8%。结果表明潮霉素基因和缺失内含子序列1均能降低纤维素酶和木聚糖酶分泌，并且导致致病力下降，AbA能显著抑制纤维素酶和木聚糖酶的分泌，降低致病力。综上所述，潮霉素基因和内含子序列1缺失都引起了IPC合成酶基因表达量及酶活力降低，并降低草酸、纤维素酶和木聚糖酶的分泌，导致菌株的致病力下降，推测内含子序列1可能是BcAUR1顺式作用元件。

关键词：灰葡萄孢菌 AUR1基因同源重组 ATMT mRNA表达 IPC合成酶活力

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灰葡萄孢菌咯菌腈抗性菌株适合度降低的分子机制

灰葡萄孢菌咯菌腈抗性菌株适合度降低的分子机制

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作者：殷学茹西南大学

学位级别：硕士

灰霉病是一种由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的毁灭性真菌病害,造成严重的经济损失。防治灰霉病主要为化学防治,灰葡萄孢菌由于自身特点对多种药剂极易产生抗药性,甚至多重抗药性,而咯菌腈由于其低毒、高效而被广泛用于灰霉病的... 详细信息

灰霉病是一种由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的毁灭性真菌病害,造成严重的经济损失。防治灰霉病主要为化学防治,灰葡萄孢菌由于自身特点对多种药剂极易产生抗药性,甚至多重抗药性,而咯菌腈由于其低毒、高效而被广泛用于灰霉病的防治。目前极易获得室内诱变的高抗菌株,但田间抗性频率低,抗性菌株的适合度较野生型菌株低。因此探究灰葡萄孢菌咯菌腈抗性菌株适合度降低的分子机理,对延缓病害发生和防治灰霉病具有重要意义。主要研究结果如下: 1、随着咯菌腈在生产上的推广使用,国内外对咯菌腈抗性菌株的报道陆续出现,但田间很少分离到高抗菌株,抗性分子机制尚未探明,抗性菌株适合度低。为明确灰葡萄孢菌咯菌腈抗性菌株的抗性分子机制,通过室内药剂驯化获得咯菌腈抗性菌株,测序确定突变位点,利用分子对接预测咯菌腈和异菌脲与灰葡萄孢菌双组分组氨酸激酶Bos1（Bc Bos1）的结合模式,选取结合能降低的突变位点进行定点突变,获得点突变菌株并进行生物学特性测定。研究结果表明:（1）药剂驯化获得了25株咯菌腈高抗菌株,对Bos1进行比对发现咯菌腈抗性菌株中均存在突变位点,共有26种突变方式,其中大部分突变位点位于HAMP区域,除此之外,His KA、HATPase＿c、REC区域也存在突变位点。（2）分子对接结果表明,Bc Bos1的F127S、I365S、I365N、F127S+I365N、I376M位点的突变使咯菌腈和异菌脲与Bc Bos1的结合能降低。（3）点突变菌株的敏感性测定结果表明,上述5个点突变菌株均对咯菌腈和异菌脲产生抗性。（4）生物学特性测定结果表明,抗性菌株的生长速率、产孢量和致病力与出发菌株相比均显著下降;在不含药剂时敏感菌株甘油含量显著低于抗性菌株,经0.1μg/m L咯菌腈处理后敏感菌株甘油含量显著升高,抗性菌株甘油含量降低;抗性菌株的渗透压敏感性相对于敏感菌株敏感性增加;咯菌腈与异菌脲之间存在正交互抗性。以上结果说明与敏感菌株相比,抗性菌株的适合度降低,为下一步利用转录组测序技术分析抗性菌株适合度降低的分子机制提供材料。 2、为了探究灰葡萄孢菌咯菌腈抗性菌株适合度降低的分子机理,对点突变抗性菌株进行了转录组测序,以出发菌株B05.10为对照组,5个抗性菌株为处理组,进行组间差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）分析。结果表明5个比较组的共同交集中有1,869个DEGs。对该集合中的DEGs进行功能富集分析:GO功能富集分析表明主要参与前体代谢物和能量的产生、电子传递链、催化活性、氧化还原酶、线粒体内膜膜蛋白复合体等途径;KEGG功能富集分析发现主要参与氧化磷酸化、淀粉和蔗糖代谢、丙酮酸代谢等,其中下调基因主要富集在ABC转运蛋白、丙酮酸代谢和苯丙氨酸代谢等通路。对KEGG前20条富集结果进一步分析得到:3个下调基因中Bcin05g07030富集到苯丙氨酸和β-丙氨酸代谢2条途径中;Bcgad1富集到丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,丁酸盐代谢和β-丙氨酸代谢途径3条途径中;Bcin03g05840富集到脂肪酸降解,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解,β-丙氨酸代谢,丁酸盐代谢,脂肪酸延长和丙酸盐代谢6条途径中。根据以上结果推测这3个基因的下调表达可能是导致抗性菌株适合度降低的原因,需要进一步进行功能验证。 3、为了明确上述3个基因的下调表达是否是抗性菌株适合度降低的原因,利用同源重组技术对该基因进行敲除及回补,测定突变体的生物学特性和对不同类杀菌剂的药剂敏感性。研究结果表明,相对于出发菌株和回补突变体,Bcin05g07030、Bcin03g05840基因的敲除突变体Δ07030和Δ05840的菌丝生长速率、致病力、产孢量都显著降低,Δ07030的孢子萌发率降低,Bcgad1基因的敲除突变体ΔBcgad1的菌丝生长速率和产孢量降低。在Na Cl、D-山梨醇和刚果红的存在下,Δ07030、ΔBcgad1和Δ05840相对于出发菌株菌丝生长抑制率降低。在H2O2的存在下Δ07030和Δ05840菌丝生长抑制率降低,甘油处理后Δ07030和ΔBcgad1菌丝生长抑制率降低。H2O2和SDS存在的条件下,ΔBcgad1菌丝生长受到抑制;药剂敏感性测定结果表明,ΔBcgad1仅对啶酰菌胺产生抗性,对剩余杀菌剂均敏感,其余突变体对所有杀菌剂敏感。以上结果表明Bcin05g07030、Bcin03g05840参与菌丝生长发育、致病力和分生孢子产率,负调控渗透胁迫、氧化应激和细胞壁完整性。Bcin05g07030参与孢子萌发,Bcgad1参与菌丝生长发育、分生孢子产率、氧化应激和细胞壁合成,负调控渗透胁迫和细胞壁完整性。3个基因的敲除突变体对咯菌腈和异菌脲均敏感。综上所述,灰葡萄孢菌Bos1的F1

关键词：灰葡萄孢菌咯菌腈点突变适合度转录组测序

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