检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物制品学杂志 2020年第5期33卷 507-509,515页

作者：张帆刘行波倪宏波黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

目的真核表达及纯化牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gE蛋白,并制备其多克隆抗体。方法合成IBRV gE基因全长,并加入KpnⅠ和BSTBⅠ酶切位点,连接至真核表达载体pCDNA4-MycHis,构建重组质粒pCDNA4-gE-... 详细信息

目的真核表达及纯化牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gE蛋白,并制备其多克隆抗体。方法合成IBRV gE基因全长,并加入KpnⅠ和BSTBⅠ酶切位点,连接至真核表达载体pCDNA4-MycHis,构建重组质粒pCDNA4-gE-His,经双酶切鉴定正确后转染MDBK细胞系,镍柱纯化带有His标签的重组gE蛋白。将纯化后的重组gE蛋白皮下多点注射新西兰白兔,制备多克隆抗体并纯化,利用Dot blot和间接ELISA方法分析其抗原性。结果重组质粒pCDNA4-gE-His经双酶切鉴定证明构建正确,转染MDBK细胞系后,表达的重组gE蛋白相对分子质量约为61000,纯化后浓度为50μg/mL。制备的多克隆抗体纯化后浓度为1 mg/mL,经Dot blot和ELISA方法鉴定,重组gE蛋白具有良好的抗原性。结论真核表达了IBRV重组gE蛋白,成功制备了抗gE多克隆抗体,表达产物具有良好的抗原性,为诊断方法的建立以及疫苗和IBRV致病机制等相关研究奠定基础。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gE基因真核表达多克隆抗体

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牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白在杆状病毒中的表达及抗原性鉴定

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中国预防兽医学报 2022年第1期44卷 34-40页

作者：杨木娇林俊张娟王婉向文杰薛飞朱远茂中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了获得具有良好抗原性的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gE蛋白,本研究采用PCR方法扩增全长gE基因,并在其5’端引入蜂素信号肽(HBM)以增加表达蛋白的分泌,将其克隆至pFastBac1供体质粒中,构建重组质粒pFB-gE。将测序正确的p FB-gE转化... 详细信息

为了获得具有良好抗原性的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gE蛋白,本研究采用PCR方法扩增全长gE基因,并在其5’端引入蜂素信号肽(HBM)以增加表达蛋白的分泌,将其克隆至pFastBac1供体质粒中,构建重组质粒pFB-gE。将测序正确的p FB-gE转化至DH10Bac感受态细胞中获得重组杆粒(rBacmid-gE),经PCR鉴定后将阳性r Bacmid-gE转染Sf21细胞,获得重组杆状病毒(rBV)。对不同代次的rBV进行PCR鉴定,结果表明获得了整合gE基因的r BV,且能稳定传代。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,接种rBV的Sf21细胞与gE抗体阳性牛血清反应后出现绿色荧光,而与阴性牛血清不反应,表明g E基因在rBV中获得正确表达。大量培养rBV,收获培养上清液,对重组gE蛋白(rgE)纯化,纯化后的rgE浓度为0.78 mg/mL。对纯化后的rgE进行western blot检测,结果显示,rgE能与g E抗体阳性兔血清和羊血清反应,与IBRV-56(g E基因缺失株)免疫兔血清和健康羊血清均不反应,表明rgE具有较强的反应原性。采用rgE对4只小鼠进行两次免疫,通过间接ELISA方法检测小鼠血清抗体,结果显示,rgE可诱导小鼠产生特异性抗体,表明rgE具有良好免疫原性。本研究为IBRV gE蛋白结构和功能的研究奠定了一定基础,为gE基因缺失疫苗免疫牛与自然感染牛的鉴别诊断提供了物质基础。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gE基因糖蛋白E 重组杆状病毒表达

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牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

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中国动物传染病学报 2023年第6期31卷 140-145页

作者：王倩颖杨森刘可欣王超孙飞雁张淑琴中国农业科学院特产研究所长春130112 黑龙江省农业科学院黑龙江农业科技杂志社哈尔滨150086

为了建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的快速定量检测方法,本研究针对IBRV基因组gD序列保守区域设计特异性扩增引物,扩增的目的片段大小为105 bp,将其克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒标准品pMD-gD-IBRV,优化反应体系后,建立了快速检测IBR... 详细信息

为了建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的快速定量检测方法,本研究针对IBRV基因组gD序列保守区域设计特异性扩增引物,扩增的目的片段大小为105 bp,将其克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒标准品pMD-gD-IBRV,优化反应体系后,建立了快速检测IBRV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。该方法特异性较强,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法敏感性高,对重组质粒标准品的最低检出限达4.8×10^(0)copies/μL,高于常规PCR方法;批内、批间重复性试验的变异系数均小于2%,表明该方法重复性良好;该方法检测的样本阳性率高于常规PCR方法,利用该方法检测牛场送检的106份临床样品,结果显示IBRV的阳性率为36.7%,常规PCR检测方法检测显示阳性率为33.0%,二者符合率为96.2%,表明该方法更适用于临床样品检测。本研究建立的IBRV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、快速高效,对于IBRV的检测和流行病学调查具有重要意义。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒检测方法 gD基因实时荧光定量PCR

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牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国生物制品学杂志 2017年第10期30卷 1050-1054页

作者：毕莹闻晓波倪宏波黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gD基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒gD-pET-28a,转化至感受态*** BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白gD,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀时抽取腹水,用Hi Trap Protein G HP试剂盒纯化单抗,进行Western blot及间接免疫荧光检测。结果重组蛋白gD相对分子质量为48 000,纯化后浓度为4.19 mg/ml。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后筛选出1株阳性杂交瘤细胞株,获得相应单克隆抗体的蛋白含量为1.81 mg/ml,且可与IBRV发生特异性反应,可与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光。结论本研究利用原核表达系统表达纯化了IBRV gD蛋白,成功制备了IBRV gD单克隆抗体,为下一步表位鉴定及致病机理的研究奠定了基础。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gD蛋白单克隆抗体

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牛传染性鼻气管炎病毒抗体胶体金检测试纸条的制备

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中国兽医杂志 2019年第1期55卷 39-43,I0004页

作者：梅力李永清宋彦军高晓龙李佳杨春江韦海涛于在江王林冯小宇北京市动物疫病预防控制中心北京大兴102629 北京市农林科学院畜牧兽医研究所北京海淀100097 北京纳百生物科技有限公司北京大兴100176

采用SF 9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原,经纯化鉴定后将gD蛋白用胶体金标记作为示踪抗原,未标记的gD抗原作为捕获抗原,并以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体,建立了牛传染性鼻气管炎病毒双抗原夹心法胶体金检... 详细信息

采用SF 9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原,经纯化鉴定后将gD蛋白用胶体金标记作为示踪抗原,未标记的gD抗原作为捕获抗原,并以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体,建立了牛传染性鼻气管炎病毒双抗原夹心法胶体金检测试纸条。试验结果表明,该试纸条检测灵敏度高,特异性良好,与牛口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒等阳性血清无交叉反应。使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒抗体ELISA检测试剂盒同时检测112份牛血清,阳性符合率为93.5%,阴性符合率为96.0%,总符合率为94.6%。说明该试纸条可以应用于临床牛传染性鼻气管炎病毒抗体的诊断和检测。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gD蛋白抗体胶体金试纸条

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牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国生物制品学杂志 2018年第2期31卷 155-159页

作者：赵微毕莹闻晓波倪宏波黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus,IBRV)g E蛋白的单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gE基因插入至载体p ET-32a(+),转化感受态*** BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白IBRV gE,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,间接免疫荧光法筛选阳性杂交瘤细胞。经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,3×10~6个/只,待小鼠腹腔膨大后,采集腹水,硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,并进行亚类、浓度、染色体数目、Western blot及间接免疫荧光检测。结果重组蛋白IBRV gE相对分子质量约35 000,纯化后浓度为1.2 mg/mL。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后,筛选出1株稳定分泌IBRV单抗的杂交瘤细胞(命名为3G9),获得相应抗体浓度为1.46 mg/m L;为IgG1亚类,轻链为kappa链;染色体数目为95~105;可与IBRV发生特异性反应;可与接种IBRV毒株的MDBK细胞发生特异性结合,产生特异性荧光。结论采用原核表达系统表达并纯化了IBRV gE蛋白,成功制备了抗IBRV gE的单克隆抗体,为建立特异性的IBRV诊断方法及致病机理的研究奠定了基础。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gE蛋白单克隆抗体

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牛传染性鼻气管炎病毒gD基因真核表达载体的构建及其在MDBK细胞中的表达

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中国生物制品学杂志 2020年第8期33卷 894-897页

作者：贾晓雪刘慧珍张帆武文博马君艳倪宏波黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163119

目的构建牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD基因的真核表达质粒,并在MDBK细胞中表达。方法参照GenBank中BHV-1-gD基因序列,于上下游分别加入KpnⅠ、BSTBⅠ双酶切位点,连接至真核表达载体pcDNA4-myc... 详细信息

目的构建牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD基因的真核表达质粒,并在MDBK细胞中表达。方法参照GenBank中BHV-1-gD基因序列,于上下游分别加入KpnⅠ、BSTBⅠ双酶切位点,连接至真核表达载体pcDNA4-myc-His中,全基因合成重组质粒pcDNA4-gD-His,经双酶切及测序鉴定正确后,转染MDBK细胞,收集上清,镍柱纯化带有His标签的重组gD蛋白,对表达及纯化的蛋白进行间接免疫荧光及Dot blot鉴定。结果质粒pcDNA4-gD-His经双酶切及测序鉴定证明构建正确。表达及纯化的重组gD蛋白相对分子质量约为61000,纯化后的重组gD蛋白浓度为0.85 mg/mL。表达及纯化的重组gD蛋白均可与IBRV-gD单克隆抗体发生反应,具有良好反应原性。结论已成功构建了pcDNA4-gD-His真核表达质粒,并在MDBK细胞系中成功表达,经验证重组蛋白具有良好的反应原性。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gD基因 MDBK细胞真核表达

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牛传染性鼻气管炎病毒微滴数字PCR检测方法的建立与初步应用

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中国兽医科学 2024年第2期54卷 151-156页

作者：吴顺商金源闫曼平王春霞冯二凯易立王振军赵艳郭利程悦宁罗国良中国农业科学院特产研究所吉林长春130112 吉林农业科技学院吉林长春132109

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)微滴式数字PCR(ddPCR)方法,本研究在实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法基础上,设计IBRV的特异性引物和探针,同时对其特异性、敏感性、重复性进行评估,最后进行临床样品的检测。结果显示,特异性检测只检测... 详细信息

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)微滴式数字PCR(ddPCR)方法,本研究在实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法基础上,设计IBRV的特异性引物和探针,同时对其特异性、敏感性、重复性进行评估,最后进行临床样品的检测。结果显示,特异性检测只检测出IBRV,没有检测出其他对照的牛病病原;最低检测下限为4 copies/μL;变异系数为0.70%,重复性好。采用ddPCR方法对本单位收集保存的37份牛血清、肝、肺、脾、肠道、气管、粪拭子等样品进行检测,检测结果与临床检验结果相符。上述结果表明,本研究建立的微滴式数字PCR方法为牛传染性鼻气管炎的早期检测,以及牛血清、牛肉食品安全的定性与定量检测提供了技术支持。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒微滴式数字PCR 定性定量检测

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牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gB和gD的研究进展

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福建农业学报 2023年第3期38卷 376-386页

作者：戴莎莎王健霖田兴苗李继东宁夏大学农学院宁夏银川750021

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是牛的重要传染病,临床以呼吸道症状为主,伴有结膜炎、乳腺炎、流产等症状。其病原是牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV),又称牛疱疹病毒1型... 详细信息

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是牛的重要传染病,临床以呼吸道症状为主,伴有结膜炎、乳腺炎、流产等症状。其病原是牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV),又称牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus 1,BHV-1),共编码30~40种结构蛋白,其中11种为囊膜糖蛋白。糖蛋白在病毒吸附、侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。糖蛋白gB对病毒侵入宿主细胞、在细胞间扩散及复制至关重要;糖蛋白gD在病毒复制、传播和感染机制方面作用重大,具有良好的免疫原性,是诱导产生中和抗体的主要糖蛋白。对gB、gD的研究不仅可从蛋白层面解析病毒侵染机制,还能够为牛传染性鼻气管炎的临床诊断和预防提供理论依据。本文针对牛传染性鼻气管炎病毒的主要糖蛋白gB、gD的研究结果进行综述,分析其生物学功能以及在疫苗和诊断方面的应用,以期为牛传染性鼻气管炎侵染机制和防控提供参考。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gB糖蛋白 gD糖蛋白生物学功能诊断疫苗

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牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重Nano-PCR检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2019年第12期49卷 1499-1504页

作者：刘占悝刘泽余李智杰孙飞雁郭利中国农业科学院特产研究所农业部经济动物疫病重点实验室吉林长春130122 吉林农业大学吉林长春130118

为了对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)同时进行检测,提高检测效率,根据IBRV gE基因序列(GenBank登录号:L27212.1)和BVDV 5′端非编码区序列(GenBank登录号:AY-278459.1)的保守区域,分别设计1对IBRV的特异性引物和1... 详细信息

为了对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)同时进行检测,提高检测效率,根据IBRV gE基因序列(GenBank登录号:L27212.1)和BVDV 5′端非编码区序列(GenBank登录号:AY-278459.1)的保守区域,分别设计1对IBRV的特异性引物和1对BVDV的特异性引物,建立用于IBRV和BVDV的双重纳米PCR(Nano-PCR)检测方法。特异性试验结果显示,该方法对牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒均无交叉反应,表明该方法的特异性良好。敏感性试验结果显示,该方法的最低检测量为10 fg/μL,是普通PCR的10倍,表明该方法的敏感性良好。特异性试验与敏感性试验均进行3次重复,结果一致,重复性良好。用建立的方法对38份临床样品进行检测,IBRV、BVDV及IBRV与BVDV的共感染阳性率分别为5.26%、44.74%和2.63%。综上所述,建立的Nano-PCR方法可用来对临床样品的快速诊断和检测,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒牛病毒性腹泻病毒双重Nano-PCR

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