检索结果-内蒙古大学图书馆

动物医学进展 2009年第4期30卷 14-16页

作者：唐泰山邓碧华王凯民张常印雷治海江苏出入境检验检疫局动物检疫实验室江苏南京210001 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)保守基因gB和gE序列,分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释的病毒进行扩增以检测其灵敏度,同时对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)进行特异性... 详细信息

根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)保守基因gB和gE序列,分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释的病毒进行扩增以检测其灵敏度,同时对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)进行特异性检测。结果显示,建立的扩增gB和gE基因的荧光PCR可用于检测IBRV,其灵敏度为0.02 TCID50,而与PRV等非IBRV无交叉反应。本研究所建立的荧光PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于IBRV的检测。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR 特异性灵敏度

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牛传染性鼻气管炎病毒恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2019年第6期41卷 601-604,640页

作者：张颖慧岳华汤承黄建德西南民族大学生命科学与技术学院四川成都610041 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室四川成都610041 金瑞鸿捷(厦门)生物科技有限公司福建厦门361000

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)方法,本研究采用文献报道的引物和探针,通过优化反应体系,首次建立了检测IBRV核酸的iiPCR方法。结果显示该方法仅特异性检测出IBRV,而对牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛副... 详细信息

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)方法,本研究采用文献报道的引物和探针,通过优化反应体系,首次建立了检测IBRV核酸的iiPCR方法。结果显示该方法仅特异性检测出IBRV,而对牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛腺病毒3型、牛冠状病毒、牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌等病原则不能检出。该方法的检测下限为2.4拷贝/μL质粒标准品,并具有良好的重复性。对临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR方法的检测结果一致;该方法配合PetNAD核酸萃取试剂盒,从核酸提取到报告检测结果仅需1h,具有操作简便、快速、可现地化的特点。对9个省29份商品化冻精检测结果显示,IBRV阳性率为24%(7/29),表明我国流通的商品化冻精携带IBRV情况普遍。本研究为IBRV的现地检测提供了一个可靠的方法。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒恒温隔绝式荧光PCR方法现地检测精液

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牛传染性鼻气管炎病毒gB基因荧光定量PCR检测方法建立

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中国动物传染病学报 2017年第4期25卷 64-67页

作者：王海军王善辉昌莉丽陈鸿军徐州生物工程职业技术学院徐州221006 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(Bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV)gB基因的荧光定量PCR检测方法,本研究根据gB基因序列,设计1对引物和相应的TaqMan探针。建立和优化反应体系后,以10倍稀释的病毒来检测该方法的灵敏度。同... 详细信息

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(Bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV)gB基因的荧光定量PCR检测方法,本研究根据gB基因序列,设计1对引物和相应的TaqMan探针。建立和优化反应体系后,以10倍稀释的病毒来检测该方法的灵敏度。同时,对伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)和鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)进行特异性检测。结果表明,基于gB基因的荧光PCR检测方法可用于鉴定IBRV,该方法具有较好的灵敏度和特异性,其灵敏度为10 copies/μL,即0.02 TCID_(50),且与其他病毒无交叉反应。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR

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牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定与巢式-PCR诊断方法的建立

牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定与巢式-PCR诊断方法的建立

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作者：张灵君山东农业大学

学位级别：硕士

从济南周边奶牛养殖小区发生呼吸道症状的荷斯坦奶牛中,采集样品,按常规方法处理后,接种MDBK细胞,盲传4代后,分离到一株牛传染性鼻气管炎病毒。分离到的病毒在细胞上培养36h后,可形成直径为1.0～1.5mm的噬斑。将病毒超离心浓缩后,在电... 详细信息

从济南周边奶牛养殖小区发生呼吸道症状的荷斯坦奶牛中,采集样品,按常规方法处理后,接种MDBK细胞,盲传4代后,分离到一株牛传染性鼻气管炎病毒。分离到的病毒在细胞上培养36h后,可形成直径为1.0～1.5mm的噬斑。将病毒超离心浓缩后,在电镜下可以观察到具有牛传染性鼻气管炎病毒典型特征的病毒粒子;病毒可被牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清中和;用IBRV特异性引物经PCR扩增出了其gB基因的高保守区,测序结果与GeneBank登陆号AF258347的序列完全吻合。通过以上试验均证实本次所分离到的病毒为牛传染性鼻气管炎病毒,命名为SD-IBRV。另外本试验还从该地区采集了217份牛血清样品,进行了血清流行病学调查,结果表明该地区牛传染性鼻气管炎病毒血清阳性率为28.6%(62/217)。以上研究为该病的诊断和防治提供了一定的依据。目前牛传染性鼻气管炎病毒的诊断方法主要有:病毒的分离培养、中和试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验( ELISA)以及核酸探针等,但这些方法都存在着不同程度的缺点,或检测灵敏度不高,或费时、费力,或有假阳性出现。PCR方法是目前检测IBRV的快速、灵敏、简单的方法之一。本研究根据IBRV gB基因序列设计了两对PCR引物,建立了巢式-PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒的方法,试验表明其敏感性和特异性均较好,可重复性强,经初步的临床应用证实:它与病毒分离结果一致,可用于临床样品的检测,可替代目前常规的传统检测方法,具有快速、灵敏、特异的优点。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒分离鉴定巢式-PCR

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牛传染性鼻气管炎病毒部分gB蛋白的原核表达及应用

牛传染性鼻气管炎病毒部分gB蛋白的原核表达及应用

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作者：何小丽宁夏大学

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎(IBR)又名“红鼻病”,是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起的接触性传染病。该病广泛分布于世界各地,且具有广泛的组织嗜性,临床上主要以呼吸道症状和繁殖障碍为特征。近年来,该病的病发率呈现逐年上升的趋势,给养牛业... 详细信息

牛传染性鼻气管炎(IBR)又名“红鼻病”,是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起的接触性传染病。该病广泛分布于世界各地,且具有广泛的组织嗜性,临床上主要以呼吸道症状和繁殖障碍为特征。近年来,该病的病发率呈现逐年上升的趋势,给养牛业带来了不可估量的经济损失。gB蛋白为IBRV中最保守且是免疫反应最主要的蛋白之一,是进行IBRV诊断首选的特异性抗原之一。基于以上的研究,本试验做了以下三方面的工作:1..IBRV部分gB蛋白的原核表达及纯化为了获得大量的gB蛋白用于后续IBRV检测方法的建立,本试验对实验室保存的构建好的gB重组阳性质粒利用IPTG进行诱导表达,并对诱导条件(诱导时间及IPTG浓度)实施了优化,利用SDS-PAGE分析了表达蛋白的可溶性,最后使用His标签亲和镍柱层析对表达的蛋白进行了纯化和免疫印迹检测。结果表明,重组蛋白得以表达,大小为32.4KDa,与预期一致,且在IPTG浓度为0.5mM诱导4h时gB蛋白获得高效表达,存在形式主要为包涵体。纯化的gB蛋白经测定其浓度为1.84mg/mL,Western blot结果验证,表达的蛋白能够特异性识别IBR标准阳性血清。本研究成功获得了高效表达的gB蛋白,且证实了表达纯化的gB蛋白可以作为检测IBRV的特异性抗原。*** gB蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法的建立为了建立IBRV gB间接ELISA检测方法,本研究将已构建好的gB阳性重组菌落在最佳的诱导条件下进行大量表达纯化,以纯化的gB蛋白作为包被抗原包被96孔酶标板,分别对包被浓度、包被时间、作用的时间等条件进行优化,确定了判断标准,建立了关于IBR抗体检测的间接ELISA诊断方法。特异性试验和重复性试验表明,该方法不与其他常见病原发生交叉反应且具有良好的重复性。用该方法检测了 200份来自宁夏各地的血清样品,与IDEXX公司试剂盒检测结果相比较,符合率为90.5%,证明本研究建立的ELISA方法较敏感,特异性好,可以作为IBRV抗体检测的一种方法应用于临床实践。3.基于IBRV gB蛋白的免疫胶体金检测方法的建立为了建立一种适用于兽医临床现场检测IBRV的方法,本试验以兔抗牛IgG为金标抗体,以表达的IBRV gB蛋白为检测蛋白,包被T线,以羊抗兔IgG为质控蛋白,包被C线,确定了最佳包被条件,建立了 IBR免疫胶体金抗体检测方法,结果显示该方法具有良好的特异性和敏感性,为IBR的临床诊断奠定了基础。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gB蛋白原核表达 ELISA 免疫胶体金

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牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gD单抗制备及其抗原表位鉴定与双抗夹心ELISA的建立

牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gD单抗制备及其抗原表位鉴定与双抗夹...

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作者：周跃辉中国农业科学院

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起牛的一种急性、热性、接触性传染病。牛是主要宿主及传染源。IBRV组织嗜性广,可引起包括牛的鼻气管炎、脓性阴道炎、包皮龟头炎、流产、不... 详细信息

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起牛的一种急性、热性、接触性传染病。牛是主要宿主及传染源。IBRV组织嗜性广,可引起包括牛的鼻气管炎、脓性阴道炎、包皮龟头炎、流产、不孕不育症、结膜炎、脑炎等多种临床症状。病毒易于三叉神经节建立潜伏感染,造成病毒的持续存在并大量排毒,使得IBRV感染难以清除。急性IBRV呼吸道感染引起的牛继发性细菌性肺炎,是造成养牛业经济损失的重要原因之一。该病于上世纪50年代在美国首次发现,现呈世界范围分布。血清学调查表明,我国大部分地区存在IBRV感染。g D蛋白是IBRV主要囊膜糖蛋白之一,在病毒的吸附及入侵过程中具有重要作用,能够诱导中和抗体的产生。目前,国内尚无标准化的IBRV检测方法,国外的检测试剂盒价格昂贵,因此,有必要开展相关检测技术方面的研究。本研究利用大肠杆菌表达系统对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的g D蛋白进行了原核表达,免疫印迹试验表明其免疫原性良好。用超离纯化的IBRV免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,重组g D蛋白进行加强免疫,经常规细胞融合,获得了13株单克隆抗体(MAb),其中4株(2D8、3F9、1G3、5B7)可与重组g D蛋白和IBRV全病毒反应,其余9株(2E4、3C2、4E8、1F5、4H5、6B6、3F3、2A9、4D11)仅与IBRV全病毒反应,不与重组g D蛋白反应。单抗1G3具有病毒中和活性,中和效价为1:32。免疫印迹及间接免疫荧光试验表明这13株单抗具有良好的反应性。特异性试验表明这13株单抗只与IBRV反应,不与牛腺病毒3型(BAV-3)及牛副流感病毒3型(BPIV3)反应。应用肽扫描技术对g D蛋白进行GST融合短肽截短表达,对MAb 1G3识别的抗原表位进行了鉴定,结果表明MAb 1G3识别的最小反应活性单元是6肽260ESKGYE265,识别的最大反应活性的最小单元是7肽259EESKGYE265。抗原表位保守性分析表明,该抗原表位在IBRV各分离株中完全保守,而在其他与IBRV相关的反刍动物疱疹病毒如山羊疱疹病毒1型(Cp HV-1)、鹿疱疹病毒1型(Cv HV-1)及驼鹿疱疹病毒1型(Elk HV-1)等差异较大。同时,本研究利用MAb 3C2作为捕获抗体、1F5作为检测抗体建立了可用于检测IBRV抗原的双抗夹心ELISA。特异性实验表明该方法只针对IBRV,不与BAV-3、BPIV3及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等其他引起牛呼吸道疾病的病原反应。通过24份阴性样品的检测,确定该方法的Cut-off值为0.24,当样品OD450值大于0.24时,判定为阳性;等于或低于0.24时判定为阴性。敏感性试验表明,该方法可以检测102.9TCID50/0.1 ml的IBRV,与PCR方法检测临床样品的符合率为90.5%。重复性试验表明该方法具有良好的稳定性。综上所述,本研究制备了13株IBRV单抗,这些单抗与IBRV具有良好的反应性。对针对g D蛋白的一株中和性单抗1G3进行了表位鉴定,结果鉴定出了一个抗原表位。同时,利用单抗3C2和1F5初步建立了检测IBRV抗原的双抗夹心EISA,可试用于IBRV的病原检测。本研究为IBRV的糖蛋白g D的生物学结构和功能及IBRV致病性的深入研究奠定了基础,同时为IBRV的病原学诊断提供了技术支撑。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gD 单克隆抗体表位鉴定双抗夹心ELISA

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牛传染性鼻气管炎病毒多表位嵌合蛋白表达及免疫原性评价

牛传染性鼻气管炎病毒多表位嵌合蛋白表达及免疫原性评价

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作者：仝晓丹黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎是危害全球养牛业发展的一种急性传染病,病原为牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)。IBRV感染牛体后,主要引起严重的呼吸道疾病、母牛的流产及其他神经性系统疾病。潜伏感染的特性给... 详细信息

牛传染性鼻气管炎是危害全球养牛业发展的一种急性传染病,病原为牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)。IBRV感染牛体后,主要引起严重的呼吸道疾病、母牛的流产及其他神经性系统疾病。潜伏感染的特性给该病的防治及净化造成了极大困难。目前主要通过疫苗接种来防控此病。IBRV疫苗主要有灭活疫苗、弱毒疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗、基因缺失疫苗及活载体疫苗,但在一些方面仍存在诸多缺陷。因此,研发更有效的疫苗是防控IBR中最重要的问题。与传统的基因工程亚单位疫苗相比,多表位疫苗可克服MHC类分子的限制使其得到高效提呈,且能有效应对病原微生物的变异等,具有很好的应用前景。本研究首先将已鉴定出的IBRV的gB、gC和gD相关抗原表位及破伤风毒素通用T细胞表位P2以GGGGS或AAYAAY为接头进行串联连接,用DNASTAR Protean软件分析其抗原性以选择最佳连接组合,化学合成嵌合蛋白基因序列。构建pET-28a-P2-gB/gC/gD重组质粒,转化至*** BL21(DE3)感受态细胞表达重组蛋白。纯化后的重组蛋白与ISA206佐剂等体积乳化后经后腿肌肉注射免疫中国白兔,共免疫3次,每次间隔3周。间接ELISA方法检测血清中的抗体水平。结果显示pET-28a-P2-gB/gC/gD重组质粒在大肠杆菌中均以包涵体形式大量表达,且以AAYAAY为接头连接的重组蛋白诱导的抗体水平显著高于以GGGGS为接头连接的重组蛋白(21天时P=0.0113;42和63天时P<0.0001)。以AAYAAY接头连接的P2-gB/gC/gD序列为基础,构建pET-28a-P2-gB/gC/gD-BoIL-6、pET-28a-P2-gD-BoIL-6和pET-28a-BoIL-6重组质粒。同时提取中国白兔脾脏中的RNA,扩增兔IL-6基因,构建pET-28a-P2-gB/gC/gD-RaIL-6重组质粒。将鉴定正确的重组质粒转化至*** BL21(DE3)感受态细胞中表达重组蛋白并纯化,进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果显示pET-28a-P2-gB/gC/gD-BoIL-6、pET-28a-P2-gD-BoIL-6、pET-28a-BoIL-6和pET-28a-P2-gB/gC/gD-RaIL-6质粒在*** BL21(DE3)中均以包涵体的形式表达,纯化后的产物能与抗His标签单抗发生特异性反应。将纯化后的重组蛋白与ISA206佐剂乳化后免疫中国白兔,同时设置IBRV-BVDV二联灭活苗组和ISA206佐剂对照组。每隔3周免疫1次,共3次,在首免前及每次免疫后3周采血,分离血清,测定抗体水平、中和抗体效价及细胞因子IL-4和IFN-γ水平。3免后3周用IBRV鼻腔攻毒,在0、1、3、5及第7 d时采集鼻拭子并测定体温,建立实时定量方法检测鼻拭子中病毒的拷贝数。7 d后安乐死1只家兔,取肺脏和气管制作病理学组织切片并测定肺脏中病毒拷贝数。在攻毒后30 d,注射地塞米松(0.1 mg/kg),连续注射5 d,在0、1、3、5及第7 d时采集鼻拭子并测定体温,7 d后安乐死实验兔,取肺脏和气管制作病理切片,观察病理学变化,并测定鼻拭子和肺脏中病毒的拷贝数。在免疫后21 d、42d和63 d时,P2-gB/gC/gD-BoIL-6诱导产生的抗体水平显著高于其他重组蛋白组(P<0.05),而低于IBRV-BVDV二联灭活苗组(P<0.001)。在42 d和63 d时P2-gB/gC/gD-BoIL-6诱导的中和抗体效价显著高于其他重组蛋白组(P<0.05),与IBRV-BVDV二联灭活苗组无明显差异。与其他组相比,P2-gB/gC/gD-BoIL-6可有效诱导IL-4和IFN-γ的产生,表明其可同时诱导Th1和Th2型免疫应答。在1、3和5 d时均可在鼻拭子中检测到病毒,其中P2-gB/gC/gD-BoIL-6鼻拭子中的病毒拷贝数均低于其他重组蛋白组,攻毒后第1 d与P2-gB/gC/gD-RaIL-6组无显著差异,在第3 d和第5 d差异显著;但是与其他组在第1、3和5 d差异均显著(P<0.05),与IBRV-BVDV二联灭活苗组排毒滴度差异不显著。此外,在攻毒后7 d,P2-gB/gC/gD-BoIL-6免疫组,肺脏中的病毒拷贝数显著低于其他重组蛋白免疫组(P<0.05),但与IBRV-BVDV二联灭活苗组差异不显著。病理切片结果显示,P2-gB/gC/gD-BoIL-6组肺脏有少量炎性细胞浸润,气管未见明显病理变化,IBRV-BVDV二联灭活苗组肺脏和气管未见明显病理变化。注射地塞米松再激活IBRV后,实验组体温之间无明显差异;P2-gB/gC/gD

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒嵌合蛋白原核表达免疫原性

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牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA的建立与应用

牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA的建立与应用

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作者：祖立闯东北农业大学

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR),是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病。IBR被世界动物卫生组织(OIE)列为B类传染病,也是我国进境动物和国际动物贸易中规定的重点检疫对象。因此,加强IBR诊断技术的研究工作对预防和控制本病具有重要的现实意义。目前,国内还没有商品化的检测IBR的诊断试剂,口岸动物IBR的检测处于严重依赖国外试剂盒的状况。为此,本研究用大肠杆菌表达了牛传染性鼻气管炎病毒gD基因,将重组蛋白纯化后作为包被抗原建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA诊断方法。 gD糖蛋白位于病毒囊膜及感染细胞的表面,是刺激机体产生中和抗体的主要结构蛋白,是IBR诊断试剂中特异性抗原的首选蛋白。本实验将IBRV gD基因的重组质粒pET30a-gD转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导得到了大量可溶性表达的重组蛋白,采用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下成功地纯化了重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.128 mg/ml,纯度为96 %。Western blot和间接ELISA检测证明纯化后的重组蛋白可以被牛传染性鼻气管炎病毒抗血清所识别,具有良好的反应原性。将大肠杆菌表达的牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白,纯化后作为包被抗原建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA诊断方法,将其命名为gD-ELISA。通过一系列试验,确定了底物液中TMB最佳使用浓度(0.4mg/ml);DMSO最佳使用浓度(15%);0.75 %过氧化氢尿素最佳使用浓度(25.6μl/ml);重组抗原最佳包被浓度(6.4μg/ml);最佳封闭液(含10%马血清的PBST)和最佳封闭时间(1h);血清样本最佳稀释度(1:80)和最佳作用时间(1.5 h);酶标二抗最佳工作浓度(1:5000)和最佳作用时间(1h);底物最佳显色时间(15min)和终止液最佳作用时间(5min);判定临界值(PR≥38.0为阳性,PR<30.8为阴性)。交叉反应试验表明,该重组抗原与其它常见5种牛病的阳性血清不发生交叉反应。阻断试验表明,IBRV细胞培养液能在很大程度上阻断重组抗原与阳性血清的反应,而对阴性血清没有明显的影响。重复性试验表明,批内重复的变异系数小于5%,批间重复的变异系数小于15%。与病毒中和试验相比,符合率、敏感性和特异性分别为84.1 %、85.0 %和83.4 %。与本实验室已建立的IBRV全病毒ELISA诊断方法相比,符合率、敏感性和特异性分别为91.9 %、94.2 %和90.2 %。应用IBRV gD-ELISA检测了国内11个省份的2012份血清样本,得出国内平均血清抗体阳性率为46.0 %(926/2012)。上述结果表明,IBRV gD-ELISA诊断方法具有良好的敏感性和特异性,显示出了良好的应用前景。本研究成功诱导表达了gD基因,获得了以可溶性表达的目的蛋白,为研究gD基因的功能奠定了良好的基础。利用纯化的重组蛋白成功建立了快速简便的IBRV gD-ELISA诊断方法,为IBR的检疫、诊断、抗体监测、预防及控制措施提供了坚强的技术支持,为开发IBR商品化诊断试剂盒奠定了基础。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gD蛋白表达间接ELISA 诊断

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牛传染性鼻气管炎病毒eE基因表达与针对gB基因shRNA抑制IBRV的体外增殖研究

牛传染性鼻气管炎病毒eE基因表达与针对gB基因shRNA抑制IBRV的体...

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作者：冯宝海青岛农业大学

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis，IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒（InfectiousBovineRhinotracheitisvirus，IBRV）引起的牛的急性、热性和接触性传染病。该病临床上主要表现为高热、呼吸困难、鼻炎和上呼吸道炎症以... 详细信息

牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis，IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒（InfectiousBovineRhinotracheitisvirus，IBRV）引起的牛的急性、热性和接触性传染病。该病临床上主要表现为高热、呼吸困难、鼻炎和上呼吸道炎症以及母牛流产、死胎等症状。目前，在国内主要依赖价格昂贵的试剂盒检测IBR，尚缺乏能够广泛应用的商品化的诊断试剂，所以需要开发能准确诊断IBR的产品和治疗方法。\n gE编码的糖蛋白属于一种典型的跨膜糖蛋白，gE糖蛋白的胞外区暴露在病毒粒子的表面，是动物机体免疫细胞识别的靶抗原。本研究第一部分构建了牛传染性鼻气管炎病毒IBRVgE基因原核重组载体，并将重组蛋白纯化后作为包被抗原简单检测了抗原的效价，所表达的蛋白具有良好的免疫原性，可用于IBRV诊断试剂和亚单位疫苗的研究。\n 试验依据IBRV全基因组序列设计引物，克隆gE基因，可见约1728bp的特异条带，测序鉴定正确后添加酶切位点，酶切连接构建原核表达载体peET32a-gE，并利用***/cgi-bin/protparam、TMHMM在线服务器、BioEdit、DNAStar等工具对重组蛋白的氨基酸序列、抗原性、水溶性和表面可及兴等基本性质进行分析。经5‰IPTG诱导6h表达。SDS-PAGE电泳结果表明，表达产物以包涵体的形式存在。融合蛋白大小约为87，000，与预测值相符。利用Ni层析柱纯化重组蛋白，并用Western-blot鉴定纯化的重组蛋白浓度为0.4mg/ml(0.123A)。ELISA检测证明纯化后的重组蛋白具有良好的免疫原性，考马斯亮蓝法测抗体效价为1∶3200，为IBRV新鉴定方法的建立奠定了基础。\n gB基因是IBRV保守性最高的基因，一般作为PCR鉴定的主要目的片段。gB是病毒复制的必需因子，也是IBRV刺激宿主免疫应答的主要抗原蛋白。因此作为本研究的靶向基因。RNAi技术是一种新的鉴定基因功能、制造抗病毒药物的方法。能够有效减低目的基因蛋白质表达水平降低，实现基因沉默的目的。\n 本研究第二部分针对IBRVgB基因的shRNA重组H1表达质粒，通过脂质体转染293T细胞，24h后转染pcDNA3.1-gB重组质粒，观察细胞病变情况，并检测荧光情况和gB保守区基因的表达情况。试验结果表明，人工设计的两对shRNA在293T模式细胞可一定程度上沉默IBRV基因的表达，使其表达量明显受到抑制，为今后IBRVRNAi生物制剂的研究奠定基础。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gE蛋白 gB基因基因表达 shRNA抑制体外增殖

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牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白的表达及诊断方法的初步建立

牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白的表达及诊断方法的初步建立

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作者：杨木娇中国农业科学院

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus,IBRV)在世界范围内广泛流行,可引起牛的以呼吸道疾病为主的多种临床病症,包括严重的呼吸道感染、脓疱性外阴阴道炎、乳腺炎、流产和新生小牛神经系统感染等,给养牛业带... 详细信息

牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus,IBRV)在世界范围内广泛流行,可引起牛的以呼吸道疾病为主的多种临床病症,包括严重的呼吸道感染、脓疱性外阴阴道炎、乳腺炎、流产和新生小牛神经系统感染等,给养牛业带来重大的经济损失。IBRV基因缺失疫苗是牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)防控的有效手段,欧洲一些发达国家通过使用gE基因缺失疫苗并对gE抗体进行检测,在接种gE基因缺失疫苗的牛群中鉴别出感染野生型IBRV的牛,实现了控制并清除IBR的目的。目前,国内尚未开发出优质的商品化IBRV检测试剂盒,进行相关诊断技术的研究和开发势在必行。为了获得具有完整功能重组gE蛋白,本研究采用杆状病毒表达系统表达了IBRV gE基因全长,并在其5′端引入蜂素信号肽(Honeybee Melittin Signal Peptide,HBM)以增加表达蛋白的分泌,在3′端引入6×His标签以方便纯化重组蛋白。将PCR扩增的融合gE基因片段(r HBM-gE)克隆至p Fast Bac1供体质粒中,构建重组质粒p FB-gE。将测序正确的p FB-gE转化至DH10Bac感受态细胞中获得重组杆粒(r Bacmid-gE),经PCR鉴定后将r Bacmid-gE转染至Sf21细胞,获得重组杆状病毒(r BV)。对不同代次的r BV进行PCR鉴定,结果显示获得了已整合了gE基因并能稳定传代的r BV。间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence,IFA)结果显示,接种不同代次r BV的Sf21细胞与gE抗体阳性牛血清反应,细胞质和细胞膜均出现绿色荧光信号,而与阴性牛血清不反应,表明gE基因成功在r BV上获得稳定表达。对r BV进行大量培养,收获培养上清液对重组gE蛋白(rgE)进行纯化。Western blot检测结果显示,rgE能与抗6×His标签单抗反应,同时也能与gE抗体阳性兔血清、牛血清和羊血清反应,与阴性兔血清和牛血清均不反应,表明rgE具有较强的反应原性。用rgE对小鼠进行2次免疫,通过间接ELISA方法检测小鼠血清gE抗体,结果发现,rgE可诱导小鼠产生特异性抗体,表明rgE具有良好的免疫原性。本实验采用rgE作为包被抗原,通过对rgE最佳包被量、待检血清和二抗最佳稀释度、最佳封闭条件、待检血清和二抗最佳作用时间等反应条件进行摸索和优化,以求获得较好的敏感性、特异性和重复性,建立了检测IBRV gE抗体的间接ELISA方法。以70份IBRV阴性血清作为标准参考血清进行检测,确定本方法的临界值为0.401。特异性实验结果表明本方法包被的抗原只与IBRV阳性血清反应,而与BTV、BAV、BPV、BVDV、BEV和BPIV3等其他较常见牛的病原的阳性血清不反应,特异性较强。敏感性实验显示,中和抗体滴度为1:8的IBRV阳性牛血清稀释200倍后仍呈现阳性反应,敏感性较高。批内和批间重复试验显示变异系数均小于10%,表明本方法重复性较好。同时用本方法和***牛传染性鼻气管炎病毒gE抗体检测试剂盒对372份现地血清进行检测,结果显示,本方法的检测结果与***试剂盒的检测结果的阳性符合率为97.03%,阴性符合率为80.39%,总符合率为92.47%,可用于现地牛血清gE抗体的初次筛查。本研究还尝试使用环磷酰胺(Cyclophosphamide,CP)减弱小鼠针对IBRV其他蛋白的免疫应答,以制备针对gE的单克隆抗体,即先用纯化后的gE缺失株IBRV-56免疫小鼠,用CP进行免疫抑制后再免疫全病毒IBRV Bartha nu/67株。最后取小鼠的脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer test,IPMA)筛选获得了2株单抗,分别命名为5-E9和6-D7;亚类鉴定结果显示2株单抗的重链均为Ig G1,轻链均为kappa链。所得腹水效价均为10～4。Western blot结果显示,2株单抗能同时与IBRV-56和Bartha nu/67株反应,都有良好的反应性。IFA结果显示,2株单抗只与接种IBRV的MDBK细胞呈阳性反应,与接种BVDV、BPIV3的MDBK细胞和正常MDBK细胞均不反应,表明2株单抗都有良好的特异性。经Western blot和质谱分析,证明2株单抗均针对IBRV的VP8蛋白。综上所述,本研究获得了抗原性良好的rgE,以rgE为包被抗原,建立了检测gE抗体的间接ELISA方法,该方法具有较好的敏感性、特异性、可重复性,可用于现地牛血清gE抗体的初次筛查,为从接种IBRV gE缺失疫苗的牛群中鉴别出野生型

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒重组gE蛋白间接ELISA VP8蛋白单克隆抗体

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