检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：吴文浩南京农业大学

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus, IBRV),又名牛Ⅰ型疱疹病毒,坏死性鼻炎病毒,能够侵袭牛的多种组织器官,具有广泛的嗜性,可以引起多种临床疾病如牛传染性鼻气管炎、子宫炎、外阴阴道炎等,有些引起肺部... 详细信息

牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus, IBRV),又名牛Ⅰ型疱疹病毒,坏死性鼻炎病毒,能够侵袭牛的多种组织器官,具有广泛的嗜性,可以引起多种临床疾病如牛传染性鼻气管炎、子宫炎、外阴阴道炎等,有些引起肺部继发性感染会造成致死。病毒感染成年牛后,造成母牛的产奶量下降和流产,肉用牛的成长减缓；对于感染后痊愈的牛,仍有继续排毒的可能,对易感牛群有着潜在的威胁。近年来,该病在我国已逐渐呈现流行蔓延趋势,对我国养牛业造成极大的损失,因此对本病进行研究有着极为重要的意义。牛传染性鼻气管炎病毒属于双股线性DNA病毒。DNA总长约130Kb,其中包含一个长独特区,一个短独特区和两个反向重复序列。该病毒因短独特区的翻转异构而存在两种异构体,此外,反向重复序列中的基因变异较明显。将本实验室分离得到的牛传染性鼻气管炎病毒GD0109在牛肾细胞(MDBK)中扩增培养,之后,使用酚-氯仿抽提的方法提取得到分离株病毒的基因组,用高通量测序得到有意义的分离群(Contig)20个,将其与参考株Bovine herpesvirus type1.1complete genome (GenBank: AJ004801.1)进行比对分析和拼接,发现分离群间有未测通部分,根据测得序列继续设计引物扩增未测通的区域并测序,对分离群间的gap进行修补,进而得到尽量完整的基因组序列。比对分析发现分离株病毒与已公布的序列均不完全相同,说明分离得到一株新的牛传染性鼻气管炎病毒毒株,对于研究该病毒的变异程度和研制针对不同毒株的新型疫苗打下基础。本研究经过分析发现分离株病毒与参考序列同源性高达90%以上,但仍有部分片段如反向重复序列中变异十分明显,说明这个区域容易发生变异,而本试验中分离得到的牛传染性鼻气管炎病毒是一个新的毒株,很有必要进行研究。目前对于牛传染性鼻气管炎的防制没有十分有效的办法,主要依靠疫苗进行预防,新型疫苗现在发展迅速。第一种DNA疫苗就是针对本病的新型疫苗；随即还有对IBRV病毒进行毒力基因的缺失制作的基因缺失疫苗；还有将本病毒当做载体表达外源基因制成的重组活载体疫苗等。本试验根据测得的分离株牛传染性鼻气管炎病毒(GD0109)序列设计引物,扩增得到gE基因两条同源臂,并根据pIRES-EGFP质粒的序列设计引物,使用融合PCR的方法扩增得到CMV-EGFP筛选标记基因；分别将上述片段连接至pUC19载体,得到转移质粒pUC-gEE。之后将质粒转染入接种了分离株病毒的MDCK细胞,用同源重组的方法获得并纯化出重组病毒gE缺失株,命名为rIBRV-A7。本试验通过对重组病毒TCID50的测定,滴度由重组前的106.7下降到了1056,通过空斑形成单位的测定及空斑大小的测量发现重组病毒的空斑直径小于亲本毒株,差异显著,证实了gE缺失毒株毒力下降。通过对重组病毒生长曲线的绘制、遗传稳定性试验证实了本重组病毒稳定性好,不易发生突变。重组前后的病毒分别免疫小鼠,并采血制备免疫血清进行交叉中和试验,发现重组毒制得的血清对亲本毒的中和效价以及亲本毒制得的血清对重组毒的中和效价都达到了27,说明本研究构建的重组病毒有着良好的免疫原性。综合以上几点确定了本重组病毒具有良好的稳定性和免疫原性,并且病毒毒力有所下降,充分说明本试验构建的重组病毒用于制备疫苗的可能性。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒测序同源重组病毒特性

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牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的克隆与表达

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中国动物检疫 2006年第7期23卷 27-29页

作者：曲光刚单虎张志李晓成郭丽霞山东莱阳农学院动物科技学院青岛265219 中国动物卫生与流行病学中心青岛266032 扬州大学兽医学院扬州225009

构建pET32a重组表达载体,转化到BL21(DE3),诱导表达牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白。用已发表的IBRV的gD基因序列设计一对特异性引物,通过PCR方法扩增一条766bp的目的基因gD,将gD基因克隆到原核表达载体pet32a,得到重组表达载体pet32-... 详细信息

构建pET32a重组表达载体,转化到BL21(DE3),诱导表达牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白。用已发表的IBRV的gD基因序列设计一对特异性引物,通过PCR方法扩增一条766bp的目的基因gD,将gD基因克隆到原核表达载体pet32a,得到重组表达载体pet32-gD,转化到BL21(DE)中,通过IPTG诱导获得融合蛋白。重组表达蛋白经纯化后,免疫印迹分析。结论证明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒牛 gD蛋白原核表达

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牛传染性鼻气管炎病毒gC～-/LacZ～+基因缺失毒株的构建及gD糖蛋白的截短表达与活性检测

牛传染性鼻气管炎病毒gC～-/LacZ～+基因缺失毒株的构建及gD糖蛋...

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作者：王延辉中国农业科学院

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管步（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis virus，IBRV）引起的一种牛的急性、热性、接触性传染病，临床上主要以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼... 详细信息

牛传染性鼻气管步（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis virus，IBRV）引起的一种牛的急性、热性、接触性传染病，临床上主要以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症为特征，还能引起母牛流产和死胎、肠炎和小牛脑炎，有时发生眼结膜炎和角膜炎。该病在世界范围内流行，并且每年都给养牛业造成巨大的经济损失，鉴于传统疫苗存在的弊端及该病毒的特点，近年来对活病毒载体疫苗的研究受到了更大的关注。本研究构建了一株牛传染性鼻气管炎病毒gC基因缺失的重组病毒，为构建表达外源基因的IBRV重组病毒及研制牛病活载体疫苗奠定了基础。同时截短表达了IBRV的gD糖蛋白，所表达的蛋白具有良好的反应性，可用于IBRV诊断试剂与亚单位疫苗的研究。本实验根据牛传染性鼻气管炎病毒全基因组序列（基因登陆号为NC 001847）设计引物，用PCR扩增gC基因上游和下游各1.4kb的片段作为同源重组臂，分别连入pMD18-T载体，并命名为pUgC和pDgC。限制性酶切和测序鉴定正确后，用XbaⅠ和NsiⅠ消化pUgC，将得到的的上游重组臂定向克隆于pdTK质粒，pdTK质粒中含有LacZ基因表达盒，可以通过蓝白斑筛选及酶切鉴定得到阳性克隆质粒，再用AsuⅡ和KpnⅠ消化此质粒，回收带有上游重组臂的大片段后与用AsuⅡ和KpnⅠ消化pDgC得到的下游重组臂连接得到pdgC-／LacZ+重组质粒转移载体。其中LacZ基因正好位于gC启动子的下游，LacZ基因编码氨基酸前面有25个由gC起始密码子ATG在内的75个核苷酸编码的氨基酸残基。采用磷酸钙-DNA沉淀法将经AsuⅡ线性化的pdgC-／LacZ+质粒转移载体和IBRV全基因组DNA共转染牛鼻甲细胞（BT），待细胞病变达80％后收获病毒，按1：6倍比稀释病毒，接种MDBK细胞单层，用1％甲基纤维素限定细胞病变。待出现明显的病毒蚀斑后，用加有X-gal的1％低熔点琼脂糖覆盖后挑取病毒蓝斑，经6代篮色蚀斑筛选纯化及PCR鉴定得到稳定增殖的重组病毒rIBRV gC-／LacZ+。 gD糖蛋白位于病毒囊膜及感染细胞的表面，其作为抗原产生的抗体中和病毒效果最好，成为研制亚单位疫苗的首选蛋白。本实验利用生物学软件DNAStar分析，以IBRV（Bartha Nu／67）基因组DNA为模板，PCR扩增出gD基因943bp的片段，然后将此目的片段定向克隆到pET30a表达载体中。经酶切和测序鉴定得到阳性重组质粒pET30a-tgD，然后将其转化BL21表达菌，经IPTG诱导得到部分可溶性表达的重组蛋白（tgD）。采用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下成功地纯化了重组蛋白（tgD），纯化的重组蛋白浓度为0.852mg／ml，纯度为85.2％。Western blot和ELIsA检测证明纯化后的重组蛋白（tgD）可以被牛传染性鼻气管炎病毒抗血清所识别，具有良好的反应性，可以进一步开发研制牛传染性鼻气管炎诊断试剂及亚单位疫苗。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒重组病毒 LacZ基因 gD糖蛋白原核表达

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牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备和间接免疫荧光方法的建立

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备和间接免疫荧光方法...

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作者：杨飞中国兽医药品监察所

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)引起的牛的一种急性接触性传染病。临床上以高热、鼻炎和上呼吸道炎症为主要特征,并可引起脓疱性外... 详细信息

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)引起的牛的一种急性接触性传染病。临床上以高热、鼻炎和上呼吸道炎症为主要特征,并可引起脓疱性外阴阴道炎、龟头炎、母牛的乳汁减少和流产等症状。IBRV感染后可在神经系统建立潜伏感染,形成持续性感染,病牛长期乃至终身带毒,使本病难以根除。我国1980年从新西兰进口奶牛中首次分离到该病毒,此后各地区均相继检测出抗体阳性牛,且从无临床表现的进口牛中也分离到了该病毒。流行病学调查表明,我国除香港、澳门、台湾和江西省外,其他的行政省市或自治区的牛群均感染了IBRV,说明IBR在我国各地已广泛传播,给我国养牛业带来了巨大的经济损失。gD蛋白是IBRV与细胞结合所必须的蛋白,可诱导产生体液免疫和细胞免疫,且抗gD蛋白的单克隆抗体具有中和病毒的能力。因此,gD蛋白是开发诊断试剂或抗病毒研究的重要蛋白。本研究利用CHO细胞表达的IBRV gD蛋白作为免疫原免疫8周龄BALB/c小鼠,无菌取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,经亚克隆筛选,获得了3株杂交瘤细胞株,分别命名为4G3D4、6E8B7、9D7A7,选取其中一株抗体效价最高的单克隆抗体4G3D4进行后续试验。单克隆抗体4G3D4纯化后的浓度为2.6 mg/mL;抗体亚类为IgG1;且能与IBRV全病毒发生反应,与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光;亲和常数测定试验、间接ELISA和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)测定均表明分泌单抗4G3D4的杂交瘤细胞具有较好的遗传稳定性。利用大肠杆菌pET-28a原核表达系统,对IBRV gD蛋白进行截短表达,对单抗4G3D4识别的抗原表位进行鉴定,经Western Blot检测结果表明单抗4G3D4针对的抗原表位是线性表位,识别的抗原表位位于gD蛋白的315aa-348aa的氨基酸区域。抗原表位保守性分析表明,该抗原表位在IBRV各分离株中为相对保守。同时利用本研究制备的IBRV gD蛋白单克隆抗体4G3D4作为一抗,以FITC标记的山羊抗鼠IgG作为二抗,通过优化各个反应条件,建立间接免疫荧光方法(IFA)。通过与美国VMRD公司进口的IBRV gD蛋白单克隆抗体进行比较,检测IBRV不同的分离株、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3),检测结果均一致,符合率为100%。批内重复性试验与批间重复性试验结果表明,该方法具有良好的重复性。敏感性试验、特异性试验结果表明该间接免疫荧光方法敏感性高、特异性强,适用于临床检测IBRV抗原。综上,本研究获得了3株杂交瘤细胞株,选取了其中一株抗体效价最高的单克隆抗体4G3D4进行后续试验研究。该单抗稳定性强,与IBRV具有良好的反应性,对其抗原表位进行分析,结果鉴定出了一个抗原表位。同时以制备的单抗4G3D4作为一抗,初步建立了检测IBRV的IFA方法,以期用于牛及牛源性生物材料中IBRV抗原的检测。本研究为IBRV gD蛋白的生物学结构和IBRV的致病性的深入研究奠定了基础,也为IBRV的诊断和防控提供了新的技术支持。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gD蛋白单克隆抗体抗原表位鉴定间接免疫荧光方法

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牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA的建立与应用

牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA的建立与应用

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作者：祖立闯东北农业大学

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR),是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病。IBR被世界动物卫生组织(OIE)列为B类传染病,也是我国进境动物和国际动物贸易中规定的重点检疫对象。因此,加强IBR诊断技术的研究工作对预防和控制本病具有重要的现实意义。目前,国内还没有商品化的检测IBR的诊断试剂,口岸动物IBR的检测处于严重依赖国外试剂盒的状况。为此,本研究用大肠杆菌表达了牛传染性鼻气管炎病毒gD基因,将重组蛋白纯化后作为包被抗原建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA诊断方法。 gD糖蛋白位于病毒囊膜及感染细胞的表面,是刺激机体产生中和抗体的主要结构蛋白,是IBR诊断试剂中特异性抗原的首选蛋白。本实验将IBRV gD基因的重组质粒pET30a-gD转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导得到了大量可溶性表达的重组蛋白,采用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下成功地纯化了重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.128 mg/ml,纯度为96 %。Western blot和间接ELISA检测证明纯化后的重组蛋白可以被牛传染性鼻气管炎病毒抗血清所识别,具有良好的反应原性。将大肠杆菌表达的牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白,纯化后作为包被抗原建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA诊断方法,将其命名为gD-ELISA。通过一系列试验,确定了底物液中TMB最佳使用浓度(0.4mg/ml);DMSO最佳使用浓度(15%);0.75 %过氧化氢尿素最佳使用浓度(25.6μl/ml);重组抗原最佳包被浓度(6.4μg/ml);最佳封闭液(含10%马血清的PBST)和最佳封闭时间(1h);血清样本最佳稀释度(1:80)和最佳作用时间(1.5 h);酶标二抗最佳工作浓度(1:5000)和最佳作用时间(1h);底物最佳显色时间(15min)和终止液最佳作用时间(5min);判定临界值(PR≥38.0为阳性,PR<30.8为阴性)。交叉反应试验表明,该重组抗原与其它常见5种牛病的阳性血清不发生交叉反应。阻断试验表明,IBRV细胞培养液能在很大程度上阻断重组抗原与阳性血清的反应,而对阴性血清没有明显的影响。重复性试验表明,批内重复的变异系数小于5%,批间重复的变异系数小于15%。与病毒中和试验相比,符合率、敏感性和特异性分别为84.1 %、85.0 %和83.4 %。与本实验室已建立的IBRV全病毒ELISA诊断方法相比,符合率、敏感性和特异性分别为91.9 %、94.2 %和90.2 %。应用IBRV gD-ELISA检测了国内11个省份的2012份血清样本,得出国内平均血清抗体阳性率为46.0 %(926/2012)。上述结果表明,IBRV gD-ELISA诊断方法具有良好的敏感性和特异性,显示出了良好的应用前景。本研究成功诱导表达了gD基因,获得了以可溶性表达的目的蛋白,为研究gD基因的功能奠定了良好的基础。利用纯化的重组蛋白成功建立了快速简便的IBRV gD-ELISA诊断方法,为IBR的检疫、诊断、抗体监测、预防及控制措施提供了坚强的技术支持,为开发IBR商品化诊断试剂盒奠定了基础。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gD蛋白表达间接ELISA 诊断

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牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株gE、gI、gG及gN基因的克隆和序列分析

牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株gE、gI、gG及gN基因的克隆和序...

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作者：白春艳内蒙古农业大学

学位级别：硕士

本试验参考牛疱疹病毒Ⅰ型全基因序列NC001847（GenBank）分别设计5对特异性引物,以牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株NM06株提取的总DNA为模板,运用PCR的方法分别扩增5个基因的cDNA,将获得的cDNA连接到PMD19-T质粒载体中,并进行克隆,经... 详细信息

本试验参考牛疱疹病毒Ⅰ型全基因序列NC001847（GenBank）分别设计5对特异性引物,以牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株NM06株提取的总DNA为模板,运用PCR的方法分别扩增5个基因的cDNA,将获得的cDNA连接到PMD19-T质粒载体中,并进行克隆,经PCR鉴定后的阳性重组质粒送宝生物工程（大连）有限公司进行测序。结果表明,内蒙古分离株NM06的gE基因长2086bp,包含1个1728bp的完整开放阅读框,编码576个氨基酸;gI基因长1280bp,包含1个1149bp的完整开放阅读框,编码383个氨基酸;gG基因长1599bp,包含1个1335bp的完整开放阅读框,编码445个氨基酸;gN基因长为1459bp,包含2个完整开放阅读框,第1个由291bp组成的完整开放阅读框,编码的是gN基因,编码区共编码97个氨基酸;第2个由777bp组成的完整开放阅读框,编码的是VP22基因,编码区共编码259个氨基酸。将NM06株gE、gI、gG、gN及VP22基因序列分别与参考毒株相应的基因序列进行同源性比较结果发现,NM06 gE基因与其它毒株的核苷酸同源性在93.4%～99.9%,推导氨基酸同源性在83.8%～99.8%;NM06 gI基因与其它毒株的核苷酸同源性在96.2%～99.8%,推导氨基酸同源性在89.2%～99.5%;NM06 gG基因与其它毒株的核苷酸同源性在97.4%～99.8%,推导氨基酸同源性在95.9%～99.5%;NM06 gN基因与其它毒株的核苷酸同源性均为99.3%,推导的氨基酸同源性均为97.9%;NM06 VP22基因与其它毒株的核苷酸同源性均为100%,推导氨基酸同源性在99.6%～100%。NM06株5个基因的基因序列与BHV-5各毒株相应的基因序列核苷酸同源性在71.7%～82.9%,推导氨基酸同源性在69.5%～82.6%。构建的遗传进化树分析结果显示,NM06株与分离自瑞典的can kao株和cooper株位于1个进化分支,与BHV-5和CvHV-2不在1个进化分支上,以上结果表明IBRV NM06株与瑞典株亲缘关系较近。根据同源性比较分析和遗传进化树分析结果,确定IBRV NM06株为BHV-1（1.1）型。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gE基因 gI基因 gG基因 gN基因克隆与序列分析

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牛传染性鼻气管炎病毒gB和gE基因蛋白原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

牛传染性鼻气管炎病毒gB和gE基因蛋白原核表达及其间接ELISA检测...

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作者：郭良帅塔里木大学

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎会影响牛群的正常生长,一定程度上阻碍了养牛业的蓬勃发展,也对我国动物和动物产品的国际贸易带来不利的影响。我国的牛传染鼻气管炎的检测标准推荐的血清学方法是病毒中和试验和ELISA方法。病毒中和试验耗时耗力,不适... 详细信息

牛传染性鼻气管炎会影响牛群的正常生长,一定程度上阻碍了养牛业的蓬勃发展,也对我国动物和动物产品的国际贸易带来不利的影响。我国的牛传染鼻气管炎的检测标准推荐的血清学方法是病毒中和试验和ELISA方法。病毒中和试验耗时耗力,不适用于流行病学调查,且我国暂且没有IBR的ELISA商品试剂盒。虽然在国外有许多国家已经研制成功,但是价格昂贵,不适用于我国的临床应用。因此研制出成功的ELISA试剂盒就显得极其重要。本论文对牛传染性鼻气管炎gB、gE主要抗原区域进行原核表达及用纯化的重组蛋白建立间接ELISA检测方法,为研制面向社会需求、具有良好应用前景的IBR诊断方法提供辅助性技术手段,并且gE-ELISA方法的建立,可用于区分自然感染和野毒株感染。研究取得结果如下:成功克隆出牛传染性鼻气管病毒的gB(312～529 aa,661 bp)和gE基因(188～420 aa,667 bp)的表达片段,构建重组原核表达质粒p ET-32a-gB和p ET-28a-gE,且两种蛋白的表达形式都是包涵体,经镍柱亲和层析纯化得到分别为60 ku的gB蛋白和30 ku的gE蛋白,Western blot分析,两种重组蛋白能够与IBRV阳性血清特异性结合,证明有一定的生物学活性。建立的IBRV gB间接ELISA最佳包被量为8μg,用5%脱脂牛奶封闭,待检血清以1:200稀释,酶标二抗以1:2 500稀释,作用时间均为1 h,TMB显色时间为15 min,S/P≥0.396判定为阳性。与IDvet公司的IBR gB-ELISA商品化试剂盒进行比较,阳性符合率为86.5%,并且特异性较强,灵敏度较高,重复性较好。建立的IBRV gE间接ELISA最佳包被量为5μg,用5%脱脂牛奶封闭,待检血清以1:25稀释,酶标二抗以1:2 500稀用时间均为1 h,TMB显色时间为15 min,S/P≥0.373判定为阳性。与IDvet公司的IBR gE-ELISA商品化试剂盒进行比较,阳性符合率为92%,并且特异性较强,灵敏度较高,重复性较好。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gB糖蛋白 gE糖蛋白间接ELISA

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牛传染性鼻气管炎病毒分离鉴定及其单克隆抗体制备

牛传染性鼻气管炎病毒分离鉴定及其单克隆抗体制备

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作者：王延涛黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

2006年4月中旬,黑龙江省大庆市某养牛小区牛群大规模爆发了疑似牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)症状的传染性疾病。我们采集发病牛的阴道分泌物,按常规方法处理后,接种MDBK细胞,盲传3代后,细胞出现了明显的细... 详细信息

2006年4月中旬,黑龙江省大庆市某养牛小区牛群大规模爆发了疑似牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)症状的传染性疾病。我们采集发病牛的阴道分泌物,按常规方法处理后,接种MDBK细胞,盲传3代后,细胞出现了明显的细胞病变(CPE)。将该病毒液浓缩320倍,对小鼠红细胞做凝集试验,凝集效价为1:1280。该病毒可被牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清中和,其中和效价为l:27。用特异性引物经PCR扩增出IBRV gB基因的高保守区的398 bp片段,测序结果与GenBank中序列(登陆号U14106)符合率为99.3 %;另外本试验还对该病毒gD全基因进行了克隆、序列分析,与GenBank中(登陆号:AJ004801、M59846、Z23068、Z98199)毒株进行比较,其氨基酸及核甘酸的同源性分别为97.6%～98.2%,97.1%～97.6%,并构建出gD基因进化树。理化性质鉴定结果表明,该病毒对乙醚、氯仿、胰酶、酸敏感,在50℃水浴中1h可被完全灭活,Mg2+对该病毒不具有保护作用。综上实验结果表明:所分离的病毒特性与牛传染性鼻气管炎病毒相符,确定该分离病毒为牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV),并命名为DQ01株。将增殖的病毒经蔗糖密度梯度离心纯化后,4次腹腔免疫6周龄(体重为18～22 g) BALB/c雌性小鼠。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA方法检测筛选阳性杂交瘤,经3次有限稀释克隆培养,共筛选得到3株能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:3A1、3D1、5D2,其免疫球蛋白亚类均为IgG1,k链。3株杂交瘤细胞培养上清效价依次为:1:3200、1:3200、1:6400,杂交瘤腹水效价依次为1:128000、1:16000、1:256000。Western-blot实验结果表明,制备的单克隆抗体能够与IBRV发生特异性结合。特异性实验结果表明,3种单克隆抗体与牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCV)、牛轮状病毒(Bovine Rotavirus, BRV)、牛腺病毒(Bovine adenovirus,BAV)以及牛呼吸道核胞体(Bovine Respiratory Syncytial Virus,BRSV)不发生交叉反应。综上证明获得的细胞株是分泌抗IBRV特异性抗体的杂交瘤细胞株。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒分离鉴定单克隆抗体间接ELISA

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牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白的分段表达与间接ELISA诊断方法的建立及应用

牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白的分段表达与间接ELISA诊断方法的建...

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作者：李兆利中国农业科学院

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis,IBR）,是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV）引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病。病毒基因组编码11种糖蛋白,其中gB蛋白是病毒的囊... 详细信息

牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis,IBR）,是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV）引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病。病毒基因组编码11种糖蛋白,其中gB蛋白是病毒的囊膜表面展示的主要蛋白之一,也是主要的免疫原蛋白。本试验根据GenBank公布的IBRV基因序列,以IBRV Bartha Nu/67株DNA为模板,分两段PCR扩增gB基因,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,分别可见约1776 bp（命名为gBⅠ）和1551 bp（命名为gBⅡ）的特异带,将目的基因克隆到pGEM-T载体,XholⅠ和NsiⅠ双酶切,回收带粘末端的T-gBⅠ和gBⅡ,连接转化,得到gB基因的完整克隆T-gB。用生物学软件DNAstar分析gB蛋白氨基酸序列,对抗原性高、水溶性强和表面展示概率高的3个区域(分别命名为gBB,Ala192-Leu268;gBC,Met308-Leu402;gBD,Ala494-Leu598)进行了原核表达。设计三对引物以构建的重组质粒为模板扩增3个目的区域,如前所述方法得到T-gBB、T-gBC和T-gBD,BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切,回收目的片段,定向克隆到同样处理的pET32a表达载体。PCR鉴定并测序确定序列正确后,三个重组表达质粒分别命名为rpET32a-gBB,rpET32a-gBC,rpET32a-gBD。将三个阳性重组质粒分别转入表达宿主菌BL21（DE3）中,经终浓度为0.6 mmol/L IPTG诱导,成功表达了目的蛋白,分别命名为r32a-gBB,r32a-gBC,r32a-gBD。三个重组蛋白均以部分可溶形式表达,重组蛋白大小与预期相符,分别为29.2 KD,31.2 KD和32.4 KD,表达效率分别为40.9%,41.2%和61.4%。表达蛋白在非变性条件下纯化后,重组蛋白的浓度分别为2.000 mg/mL,2.400 mg/mL和2.000 mg/mL,纯度分别为79.2%、88.2%和76.4%。经ELISA检测表明,三个纯化的重组蛋白均与牛传染性鼻气管炎阳性血清样品发生反应,与牛传染性鼻气管炎阴性血清无任何反应,纯化的载体蛋白部分对阴阳性血清没有反应。r32a-gBB对牛流热（BEV）、牛肺疫（CBPP）、牛病毒性腹泻（BVD）、牛结核（BTB）、牛副结核（PBB）以及牛赤羽病（BAD）六种其它牛病种抗体阳性血清没有交叉反应,显示表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。把表达的r32a-gaB重组蛋白经初步纯化后用作包被抗原,建立了检测IBRV血清抗体的间接ELISA方法,并确定了最适抗原包被浓度（50μg/mL）、最适血清稀释度（1∶40）、血清最适作用时间（90min）、最适封闭液（3%明胶）、最适封闭时间（90min）、酶标抗体最适稀释度（1∶5000）、酶标二抗最适作用时间（120 min）、底物最适显色时间（9 min）和判定界值（0.395）。包被的重组抗原不与上述六中牛疫病阳性血清发生交叉反应,表明建立的ELISA诊断方法具有良好的特异性。批内重复试验和批间重复试验变异系数均小于10%,说明该方法具有很好的重复性。该诊断方法与中和试验相比较,特异性、敏感性和符合率分别为83.3%、90.9%和88.9%;与进口法国IBRV全病毒ELISA抗体诊断试剂盒比较,特异性、敏感性和符合率分别为92%、92.7%和92.5%。应用该诊断方法检测保存的我国部分地区牛血清样品,阳性率为71.81%。上述结果表明该诊断方法具有良好的特异性和敏感性,显示了良好的应用前景。本研究成功克隆了IBRV gB基因,对其中的三个区域进行了表达,获得了以可溶性表达的目的蛋白,为研究gB基因的功能奠定了良好的基础。利用表达的32a-gBB蛋白成功建立了快速简便的ELISA诊断方法,为开发商品化试剂盒、IBR的流行病学调查及其控制消灭提供了坚强的技术支持。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gB蛋白克隆表达间接ELISA 诊断

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牛传染性鼻气管炎病毒荧光定量PCR方法建立及其灭活疫苗研究

牛传染性鼻气管炎病毒荧光定量PCR方法建立及其灭活疫苗研究

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作者：乔波黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是一种急性、热性、接触性传染病，由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起。临床主要表现为高热、呼吸困难、上呼吸道炎症和母畜流产等。该病虽然致死率低，但对牛的育肥、产奶量... 详细信息

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是一种急性、热性、接触性传染病，由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起。临床主要表现为高热、呼吸困难、上呼吸道炎症和母畜流产等。该病虽然致死率低，但对牛的育肥、产奶量和国际贸易有严重影响。建立灵敏、快速、可靠的检测方法，净化牛群，免疫接种疫苗，仍是预防和控制该病的重要措施。由于没有合适的实验动物模型，传统疫苗免疫后仍缺乏有效的免疫效力评价方法。因此，本研究在建立牛传染性鼻气管炎病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的基础上，对健康家兔及灭活苗免疫家兔的病毒侵染进行了初步研究，对于疫苗免疫效力的评价及有效防控本病具有重要的现实意义。本研究首先根据GenBank已公布的IBRV Bartha Nu/67株基因序列针对gB基因设计特异性引物和Taqman-MGB探针，建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示，标准曲线相关系数(R2)为0.998，103-108拷贝/μL内具有较好的线性关系。该方法灵敏度是常规PCR灵敏度的100倍，检测下限为1.49×101拷贝/μL。特异性良好，对牛呼吸道其他病毒无交叉反应。适用于临床疑似样品的快速定量检测。从17份疑似IBR症状的奶牛鼻拭子中，经分离培养，PCR、间接免疫荧光试验试验、微量血清中和实验与基因序列同源性分析鉴定，确定获得一株IBRV，命名为IBRV DQ/14株。用TCID50为10-7.33/100μL的分离株鼻腔接种家兔，用鼻拭子采集第1-14d的鼻腔粘液，每隔7d分离血清。无菌采集第3、5、7、11和49d的剖杀兔组织脏器，荧光定量PCR、病理组织学和免疫组化检测。结果表明，接毒后第2-7d家兔出现临床症状并排毒至第7d，7-14d产生大量IgG抗体并维持数周。病理组织学和免疫组化结果显示，肺脏出现炎性反应，鼻甲骨和肺脏上皮细胞均有病毒复制。研究表明该分离株对家兔有致病性。用BEI灭活IBRV DQ/14分离株，以Montanide ISA206佐剂乳化制备灭活疫苗。分别接种断奶仔兔和Balb/c小鼠，进行安全性检验。间隔21d后两次免疫日本大耳家兔，14d后进行攻毒实验。结果表明疫苗安全性良好。攻毒后，免疫组未出现临床症状，免疫组化结果表明该疫苗阻止了分离株对呼吸道粘膜的侵染，免疫保护率为100%。综上所述，本研究成功建立了可用于临床快速检测IBRV的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法；证明了IBRV DQ/14分离株对日本大耳家兔有较强的致病性，制备的灭活疫苗安全，可有效阻止病毒对呼吸系统的侵染。为IBRV的防制提供了有效措施。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒荧光定量PCR 致病性灭活苗

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