无浆体病(Anaplasmosis)是由边缘无浆体(***)经蜱传播而引起的一种红细胞内专性寄生的传染性血液传染病。该病主要引起牛、羊等反刍动物发病,严重的可以致死,牛死亡率可达80%,是阻碍养牛业发展的蜱传播疾病中分布最广的一种,因此成为牛病研究的重点对象之一。***主要表面蛋白MSP5是由633bp单拷贝基因编码高度保守的19ku的蛋白,所以它是研制早期诊断试剂盒的首选抗原。本试验应用MSP5重组蛋白制备***单克隆抗体(McAb),用噬菌体展示筛选对应表位,为进一步建立***早期诊断方法及研制新型核酸疫苗奠定了基础。
本研究以原核表达纯化的重组MSP5蛋白(rMSP5)免疫BALB/c鼠,应用常规杂交瘤技术获得两株能稳定分泌特异性单克隆杭体的杂交瘤细胞系(1D8和2F5),western blot鉴定McAb的特异性。间接ELISA方法测定腹水效价分别为106和105,亚类鉴定其重链为分别为IgG2b和lgG2a,轻链均为κ型;ELISA叠加试验表明这2株McAb识别的抗原位点相同或相近;western blot结果显示2株McAb均能与rMSP5发生反应。
为鉴定单抗识别的表位,将抗*** MSP5的单抗1D8纯化后,用噬菌体随机十二肽库试剂盒筛选。将ELISA检测的阳性克隆进行DNA测序,结果显示展示氨基酸顺序为LING。竞争抑制试验表明单抗1D8对rMSP5抗原具有明显的抑制作用,因此在LING基础上合成短肽MYLINGKGRY,通过ELISA鉴定表明该短肽仅与单抗1D8发生反应,从而可以初步确定L I N G是单抗1D8的线性表位。将表位基因分成两条寡核苷酸链进行合成,形成粘性末端的基因片段,然后插入到载体pGEX-6p-1中进行原核表达,western blot结果表明表达的表位蛋白具有很好的免疫原性,可与单抗1D8发生特异性反应。抗原表位的确定为今后进一步研究它们在边缘无浆体诊断及新型疫苗研究中的作用奠定了基础。
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