检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：王俊吉林大学

学位级别：博士

细菌性肺炎属于常见病多发病,给养殖业造成持续性严重经济损失。由于细菌耐药性的增强、商业广谱交叉保护性疫苗的缺乏、细菌性肺炎病原谱的变迁及多病原混合感染普遍存在,致使抗生素与疫苗的防治效果并不理想,亟待寻找新的防治策略。... 详细信息

细菌性肺炎属于常见病多发病,给养殖业造成持续性严重经济损失。由于细菌耐药性的增强、商业广谱交叉保护性疫苗的缺乏、细菌性肺炎病原谱的变迁及多病原混合感染普遍存在,致使抗生素与疫苗的防治效果并不理想,亟待寻找新的防治策略。近年来研究发现结构细胞可以充当免疫细胞的调节器,以维持组织内环境的稳定。在肺脏区域微环境中,关于肺泡巨噬细胞抗病原微生物免疫的研究很多,但与其临近的结构细胞共筑免疫防线的研究仍然缺乏。胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)可引起猪传染性胸膜肺炎,呈现典型的出血性、纤维素性、坏死性胸膜炎和肺炎等肺脏感染病理变化,是猪细菌性肺炎的典型病原菌。因此,本研究以APP为模式菌株,解析猪气管上皮细胞(porcine trachea epithelial cell,PTEC)调控猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)抗APP的作用及机制,并基于此探究细菌性肺炎的防治的候选制剂。主要研究如下: 1、明确PTEC外泌体在APP诱导PAM死亡中的作用 APP能够诱导PAM死亡,研究发现受APP感染的PTEC上清(PTEC-CS)能够显著抑制APP诱导PAM死亡,降低胞内菌载量以及促炎性细胞因子IL-18、IFN-γ和TNF-α的过度表达。进一步发现PTEC-CS中外泌体是发挥该保护作用的有效成分。另外,小鼠感染实验证实PTEC来源的外泌体能够显著降低小鼠的临床症状、肺组织菌载量、肺指数、肺组织病理变化和损伤程度,提高小鼠存活率。以上结果表明,PETC来源外泌体保护PAM免受APP的损害。 2、确定PETC外泌体抵抗APP诱导PAM损伤的有效成分为了确定外泌体中发挥抗感染作用的有效成分,本研究对APP感染下PETC来源的外泌体进行Small RNA组学测序。表达量居前25的miRNAs KEEG和GO分析发现miRNA显著富集在抵抗病原感染、自噬、TNF-α炎症反应、吞噬作用和PI3K/AKT/m TOR信号通路等方面。其中miRNA-21-5p在外泌体中含量最高,其GO和KEEG分析主要聚集于调节抗菌、NADPH性损伤、炎症反应、自噬、PI3K/AKT/m TOR、焦亡、TNF-α和细胞端粒寿命等相关通路,提示miRNA-21-5p可能参与APP感染过程。进一步体外实验发现miRNA-21-5p能够显著降低APP造成的PAM损伤、细胞毒性,并提高PAM杀菌能力。小鼠APP感染实验发现miRNA-21-5p给药显著降低小鼠的临床症状、肺组织菌载量和肺组织病理损伤,提高小鼠存活率,表明miRNA-21-5p是外泌体抗感染作用的有效成分。 3、揭示miRNA-21-5p促进PAM抵抗肺部细菌的分子机制通过RT-qPCR和Western blot技术等检测了APP感染时,miRNA-21-5p对细胞死亡类型的影响,结果发现miRNA-21-5p能够显著促进PAM自噬,抑制过度ROS分泌,从而抑制细胞焦亡,提高PAM杀菌能力。利用miRanda和Target Scan数据库预测miRNA-21-5p靶基因,再进行双荧光素酶报告实验验证,证明miRNA-21-5p通过靶向结合PIK3CD的3'UTR,抑制其基因表达进而发挥其对PAM的保护作用。另外,体外和体内实验验证发现miRNA-21-5p的保护作用及机制同样适用于methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA),Klebsiella pneumoniae(***)诱导的细菌性肺炎。 4、阐明以PIK3CD为靶标的碳点能够与miRNA-21-5p联合抵抗肺细菌性感染的作用机制碳点(Carbon dots,CDots)纳米材料具有广泛的生物学作用,在抗菌应用中具有良好的前景。本研究通过水热法聚乙烯亚胺(PEI)和抗坏血酸(VC)合成了CDots,其具有良好的生物相容性和生物安全性。体外研究发现该CDots能够通过促进巨噬细胞M1极化而显著降低APP、MRSA、***感染巨噬细胞的死亡,提高巨噬细胞的吞噬及杀菌能力。分子空间动力学模拟发现CDots与miRNA-21-5p都能靶向PIK3CD,采用si RNA干扰技术证实CDots可以结合PIK3CD内部,抑制PIK3/AKT/m TOR信号通路的激活,进而促进巨噬细胞M1极化。CDots这种保护作用在APP、MRSA、***感染的小鼠模型上得到了验证,而且miRNA-21-5p与CDots联合应用抵抗肺部细菌感染的效果更好。综上,本研究明确了结构细胞PTEC外泌体调控肺泡巨噬细胞抵抗肺部细菌感染的作用和主要成分,揭示了miRNA-21-5p和

关键词：猪气管上皮细胞肺泡巨噬细胞外泌体 miRNA-21-5p 碳点 PIK3CD

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猪气管上皮细胞ALI体外分化培养模型建立与标准化

猪气管上皮细胞ALI体外分化培养模型建立与标准化

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作者：何丽娜山西农业大学

学位级别：硕士

呼吸道上皮细胞是许多呼吸道病原感染的靶细胞,而对于猪呼吸道病原的研究一直以来都缺乏良好的体外模型,应用ALI培养气管上皮细胞可以获得分化的纤毛细胞、紧密连接和具有黏液分泌功能的体外细胞模型,因此备受科研工作者的偏爱。本研究... 详细信息

呼吸道上皮细胞是许多呼吸道病原感染的靶细胞,而对于猪呼吸道病原的研究一直以来都缺乏良好的体外模型,应用ALI培养气管上皮细胞可以获得分化的纤毛细胞、紧密连接和具有黏液分泌功能的体外细胞模型,因此备受科研工作者的偏爱。本研究的目的通过对培养条件的筛选和优化建立可在体外分化的原代PTEC模型培养方法并使之标准化。从猪健康状态、日龄和品种筛选供体猪,采取气管组织,低温条件下用链酶蛋白酶分离气管上皮细胞。对收集PTEC贴壁能力和建立ALI的时间观察,最终选择呼吸道疾病病原Mhp、PRRSV、PCV-2、SIV、CSFV、PRV-gE、Mhr检测结果均为阴性的二元猪。分别从原代PTEC细胞来源、蛋白酶分离时间、细胞接种密度、生长培养基的成分、培养体系对PTEC贴壁率、增殖和分化的的影响,筛选出适合建立猪气管上皮细胞ALI分化培养模型的条件。通过间接免疫荧光法、上皮细胞电生理特征和扫描电子显微镜评价建立PTEC体外分化模型可靠性。将细胞密度为2.67-3.917×106cells/cm2的PTEC接种在人胎盘胶原蛋白IV包被的0.4μm多孔支持膜上,细胞贴壁率高可建立ALI。当建立ALI时细胞为多边形,呈鹅卵石状铺满膜底部;培养基中添加EGF和FBS可促进细胞贴壁,但它们对细胞增殖有影响,从而影响建立ALI的时间。本实验筛选出的生长培养基是在BEGM中额外添加15ng/mLEGF,分化培养基是在BEGM中额外添加15ng/mLRA和2%USG。最后通过TEER和SEM进行观察,发现有纤毛细胞和紧密连接形成,TEER值最高为1838±226fΩcm2。用优化的培养条件培养复苏的冻存PTEC,同样也有紧密连接和纤毛细胞生成。本研究成功建立猪气管上皮细胞ALI体外分化培养模型并使之标准化。

关键词：猪气管上皮细胞气-液界面(ALI) 视黄酸(RA) 表皮生长因子(EGF)

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猪圆环病毒2型在猪气管上皮细胞中的增殖研究

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黑龙江畜牧兽医 2018年第11期 26-29,250,251页

作者：汤智慧王翠华郭抗抗汉中职业技术学院陕西汉中723000 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

为了研究猪圆环病毒2型（PCV-2）在猪气管上皮细胞（STECs）中的增殖情况,试验先分离原代猪气管上皮细胞,鉴定纯化后感染PCV-2并传至第3代,显微镜下观察未发现细胞病毒效应。培养24-48 h后收集接毒的猪气管上皮细胞,裂解细胞后进行PCR... 详细信息

为了研究猪圆环病毒2型（PCV-2）在猪气管上皮细胞（STECs）中的增殖情况,试验先分离原代猪气管上皮细胞,鉴定纯化后感染PCV-2并传至第3代,显微镜下观察未发现细胞病毒效应。培养24-48 h后收集接毒的猪气管上皮细胞,裂解细胞后进行PCR鉴定、测序及IPMA检测。结果表明：PCR扩增获得的病毒全基组片段大小为1 767 bp;全基因序列同源性比对发现,分离株与加拿大毒株（DQ200735）同源性达99.9%;IPMA测定病毒的TCID50为1×10^-4.75/mL。说明PCV-2可以在猪气管上皮细胞中稳定增殖,且效价达到一定水平。

关键词：猪气管上皮细胞猪圆环病毒2型 PCR 测序 IPMA

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猪肺炎支原体对猪气管上皮细胞的黏附作用

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中国兽医学报 2015年第3期35卷 388-393页

作者：车巧林余姗姗刘茂军甘源孔猛邵国青江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

采用气管结扎、链霉蛋白酶灌注冷消化法分离猪气管上皮细胞,并以对数生长期的猪肺炎支原体(Mhp)感染猪气管上皮细胞,通过间接免疫荧光技术定性定量研究不同滴度的猪肺炎支原体对猪气管上皮细胞的黏附及相同滴度的猪肺炎支原体随时间变... 详细信息

采用气管结扎、链霉蛋白酶灌注冷消化法分离猪气管上皮细胞,并以对数生长期的猪肺炎支原体(Mhp)感染猪气管上皮细胞,通过间接免疫荧光技术定性定量研究不同滴度的猪肺炎支原体对猪气管上皮细胞的黏附及相同滴度的猪肺炎支原体随时间变化对猪气管上皮细胞的黏附。结果表明,分离的猪气管上皮细胞存活率为95%以上,广谱角蛋白染色阳性;Mhp野毒株XLW-1与猪气管上皮细胞37℃作用30min就能看到少量的支原体黏附,作用4h以上时黏附更明显,并且,二者作用1、2、4、6、10h,XLW-1对猪气管上皮细胞的黏附与阴性对照相比差异极显著(P<0.01);1×107、2.5×106 CCU/mL的XLW-1与猪气管上皮细胞37℃作用6h,能看到支原体黏附于细胞表面,并且与阴性对照相比差异极显著(P<0.01),而其他低滴度的XLW-1则看不到黏附。

关键词：猪肺炎支原体猪气管上皮细胞黏附

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猪肺炎支原体强、弱毒株诱导猪气管上皮细胞线粒体通路凋亡差异的研究

猪肺炎支原体强、弱毒株诱导猪气管上皮细胞线粒体通路凋亡差异的...

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作者：蒋瑛辉山西农业大学

学位级别：硕士

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)是引起猪支原体肺炎的一种病原,它以慢性、接触性、高发病率为特点在猪群存在,与其他病原共同威胁着猪群的健康。猪肺炎支原体致病机理研究不清是当前影响该病有效控制的核心因素。目的：... 详细信息

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)是引起猪支原体肺炎的一种病原,它以慢性、接触性、高发病率为特点在猪群存在,与其他病原共同威胁着猪群的健康。猪肺炎支原体致病机理研究不清是当前影响该病有效控制的核心因素。目的：本试验利用Mhp 168强、弱毒株具有来源于同一亲本,而毒力不同的特点,感染靶细胞——猪气管上皮细胞上,探讨其致病机理。方法与结果：本试验以5×103CCU/cell浓度的猪肺炎支原体强毒株(Mhp 168)、弱毒株(Mhp 168L)分别感染猪气管上皮细胞(Porcine tracheal epithelial cells, PTEC),分别在感染后12h,18h,24h,30h用AO/EB双染法检测细胞凋亡率,发现在感染24h时细胞凋亡率达到最大值,强毒感染组显著高于弱毒感染组(P<0.01)；TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)检测结果显示,Mhp 168强毒感染PTEC后出现的阳性细胞高于弱毒组。同时,感染24h,采用Annexin V-FITC和PI双染,通过流式细胞仪分析,强毒感染组和弱毒感染组细胞凋亡率分别为38.69%和61.26%。以上结果表明Mhp 168和168L均可引起细胞凋亡,且168株引起细胞凋亡作用强于168L株,以5×103CCU/cell浓度感染24h最为显著。Mhp强、弱毒株感染PTEC细胞后,细胞内caspase-8、caspase-12检测结果显示,与对照相比,Mhp强、弱毒株性均不引起caspase-8、12升高。用免疫荧光法检测发现,细胞色素c释放至胞浆增加,Mhp 168感染组荧光强度高于Mhp 168L感染组；JC-1染色法检测线粒体膜电位发现,Mhp 168感染组绿色荧光强度高于Mhp 168L感染组。用N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理细胞后,出现强、弱毒感染组细胞的细胞色素c产生荧光强度降低,线粒体膜电位损失减少等关键的凋亡特征。结论：以上结果提示,Mhp强毒株感染PTEC细胞后,在线粒体途径的凋亡过程中存在差异。

关键词：猪肺炎支原体猪气管上皮细胞线粒体通路凋亡线粒体膜电位 Caspase-3

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基于3D细胞培养技术比较猪肺炎支原体不同毒力菌株感染猪气管上皮细胞的损伤差异

基于3D细胞培养技术比较猪肺炎支原体不同毒力菌株感染猪气管上皮...

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2017年第二届全国特殊病原体学术会议

作者：冯艳艳王海燕张珍珍袁厅吴猛谢星邵国青雷治海冯志新江苏省农业科学院兽医研究所南京210014 南京农业大学江苏南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所南京210014 南京农业大学江苏南京210095

目的为更真实地探究猪肺炎支原体(Mhp)不同毒力菌株对猪气管上皮细胞(STEC)的致病性差异与机制，本研究通过气液界面培养技术(ALI)，建立了传代STEC细胞系3D分化培养模型及Mhp在此细胞上的感染模型。方法将相同剂量的Mhp强毒株NJ株、... 详细信息

目的为更真实地探究猪肺炎支原体(Mhp)不同毒力菌株对猪气管上皮细胞(STEC)的致病性差异与机制，本研究通过气液界面培养技术(ALI)，建立了传代STEC细胞系3D分化培养模型及Mhp在此细胞上的感染模型。方法将相同剂量的Mhp强毒株NJ株、中等毒力菌株AH株和弱毒株168L株分别感染3D培养的猪气管上皮细胞，从细胞生长特性、细胞活性及细胞功能方面比较分析不同毒力Mhp的损伤差异。

关键词：猪肺炎支原体猪气管上皮细胞气液交界面培养损伤机制

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猪肺炎支原体不同毒力菌株对猪气管上皮3D细胞的损伤差异与机制分析

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畜牧兽医学报 2018年第2期49卷 378-387页

作者：冯艳艳王海燕刘蓓蓓韦艳娜张珍珍白昀倪博邵国青雷治海冯志新南京农业大学动物医学院南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所.农业部兽用生物制品工程技术重点实验室南京210014

为更真实地探究猪肺炎支原体(Mhp)不同毒力菌株对猪气管上皮细胞(STEC)的致病性差异与机制,通过气液界面培养技术(ALI),建立了传代STEC细胞系3D分化培养模型及Mhp在此细胞上的感染模型。将相同剂量的Mhp强毒株NJ株、中等毒力菌株AH株和... 详细信息

为更真实地探究猪肺炎支原体(Mhp)不同毒力菌株对猪气管上皮细胞(STEC)的致病性差异与机制,通过气液界面培养技术(ALI),建立了传代STEC细胞系3D分化培养模型及Mhp在此细胞上的感染模型。将相同剂量的Mhp强毒株NJ株、中等毒力菌株AH株和弱毒株168L株分别感染3D培养的猪气管上皮细胞,分别通过单层细胞跨膜电阻检测、Alamar Blue检测、乳酸脱氢酶(LDH)释放检测等试验测定细胞单层完整性与细胞活性,并通过激光共聚焦和荧光分光光度计测定感染后48h的细胞MUC5B黏液蛋白的分泌量,从细胞生长特性、活性和黏液分泌功能方面比较不同毒力Mhp菌株感染对STEC分化细胞的影响。研究还从细胞氧化系统方面,比较检测各感染组细胞内NO和内源性ROS分泌量,进一步探索Mhp的致病机制。结果表明:强毒株NJ株和中等毒力AH株组纤毛有明显的变粗、破损和脱落现象,而弱毒株168L株组对纤毛的影响较小;Mhp菌株感染后细胞单层跨膜电阻显著下降,且电阻下降程度与菌株毒力呈正相关。Alamar Blue检测试验、乳酸脱氢酶(LDH)释放检测结果均表明,Mhp NJ株与AH株感染后均可以显著降低细胞活性,且在感染后48h最明显。Mhp菌株感染后还可促进分化细胞分泌MUC5B黏蛋白,菌株毒力越强,刺激黏蛋白分泌的量也越多。氧化应激检测结果显示,除Mhp弱毒菌株168L株外,中等毒力菌株AH株和强毒株NJ株感染3D分化的STEC细胞后,可显著刺激细胞分泌NO和内源性ROS,显著引起细胞的氧化应激反应。而经NAC抗氧化处理后,强毒株NJ株、中等毒力AH株和弱毒株168L株组细胞ROS和黏液分泌量均显著降低,细胞活性和电阻值均显著升高。本研究通过更接近体内环境的3D分化细胞感染模型证明,Mhp感染可对宿主细胞的生长特性与活性产生损伤,且损伤的程度与毒力呈正相关;而这种损伤机制与Mhp菌株引起感染细胞氧化应激的能力密切相关。

关键词：猪肺炎支原体猪气管上皮细胞气液交界面培养损伤机制

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猪气管原代上皮细胞的气液培养模型建立

猪气管原代上皮细胞的气液培养模型建立

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作者：张峥嵘南京农业大学

学位级别：硕士

猪的呼吸道粘膜是由不同类型的假复层上皮细胞构成的,他们分别有纤毛柱状上皮细胞,形似酒杯的具有分泌功能的高杯细胞和粘膜底层的基底细胞。这些细胞形成一道天然屏障,保护呼吸道和肺免受感染,构成机体防御的重要组成。为了研究呼吸道... 详细信息

猪的呼吸道粘膜是由不同类型的假复层上皮细胞构成的,他们分别有纤毛柱状上皮细胞,形似酒杯的具有分泌功能的高杯细胞和粘膜底层的基底细胞。这些细胞形成一道天然屏障,保护呼吸道和肺免受感染,构成机体防御的重要组成。为了研究呼吸道上皮细胞的复杂机理和不同功能,研究人员已经研制出人呼吸道上皮细胞分离培养模式,即气管原代黏膜上皮细胞气液界面培养模型。这种体外模型与气管黏膜上皮细胞在体内生长的形态类似,同时又排除了动物活体由于环境因素产生的不确定性,可以作为研究病毒及其他一些呼吸道病原体对猪气管感染机制的模型。然而,由于细胞在体内的生长环境是一个3D环境,通常在体外生长时不会分化为具有一定功能的形态。因此,使原代气管上皮细胞分化为具有一定功能的上皮细胞仍然是体外模型建立的难点。为了建立一个体外猪原代呼吸道上皮细胞气液界面培养模型,我们分别对供体猪的选择标准、原代细胞分离消化时间、培养基配方的种类等方面进行筛选确定。在供体猪健康状态方面发现,供体猪在感染猪肺炎支原体等呼吸道病原时会严重影响原代气管上皮细胞的活性与体外增殖能力;而大龄猪(3月龄)较小龄猪(0.5月龄)细胞总数多,它们活的纤毛细胞比例接近。因此,我们推荐使用2-3月龄,无猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒或猪肺炎支原体等呼吸道病原感染的健康仔猪作为合适的供体猪。2-3月龄猪的气管上皮细胞的最佳消化时间为24-30小时。对于培养基,优化BEGM培养基,即使其表皮生长因子浓度为10ng/ml,视黄酸的浓度为10-7M,然后从优化的BEGM,优化的BEGM/5%FCS,DMEM/F12/2%USG,DMEM/F12/5%FCS 四种培养基中筛选出优化的BEGM/5%FCS配方。利用该培养基培养猪原代呼吸道上皮细胞,发现,细胞接种至插入式细胞培养小室24小时后,细胞贴壁率高,细胞增殖速度最快。一般2-4天可以迅速铺满整个插入式培养小室的膜表面,形成气液界面培养;细胞生长6天后,扫描电镜可见大多数细胞表面覆盖有微绒毛,少数部分有纤毛分化;气液界面培养7天后,细胞结构呈现立体圆形,细胞电阻值达280Ω/cm2;14天后,扫描电镜观察可见有分化成熟的纤毛,细胞脱落并且细胞间空隙增大;但当细胞生长到21天时,大部分细胞开始脱落,存活的细胞可见生长成熟的纤毛。本研究成功建立了猪原代气管黏膜上皮细胞的气液培养模型。下一步的工作将着重于该模型在体外的持续期研究。

关键词：猪气管上皮细胞细胞培养气液界面纤毛细胞分化

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基于3D细胞培养技术评估猪肺炎支原体气溶胶疫苗的安全性

基于3D细胞培养技术评估猪肺炎支原体气溶胶疫苗的安全性

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作者：冯艳艳南京农业大学

学位级别：硕士

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种慢性接触性呼吸道病,并常诱发其它病原的感染引起死亡,给现代养猪业造成巨大损失。临床试验证明,疫苗接种是防治该病的有... 详细信息

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种慢性接触性呼吸道病,并常诱发其它病原的感染引起死亡,给现代养猪业造成巨大损失。临床试验证明,疫苗接种是防治该病的有效手段,目前在我国进行产业化生产并广泛使用的是由江苏省农业科学院兽医研究所于2007年成功研制的猪Mhp168株弱毒疫苗,但Mhp168株活疫苗采用的肺内免疫途径不利于推广利用,目前,气溶胶疫苗已经成为一种不需要打针、接种量大且有效的免疫方式。在2013年,江苏省农科院兽医所报道了猪肺炎支原体气溶胶疫苗的研制,且动物试验证明能成功接种至猪的呼吸道末端,然而,对于其安全性和免疫剂量仍待进一步研究。据文献报道,一种新型的气液交界面暴露系统可评估气溶胶纳米分子的毒性,其优点是一方面真实地模拟了体内气溶胶免疫过程,另一方面保证了纳米分子真正的生物学特性。因此,本课题采用了这种新型的气液交界面(ALI)培养系统,评估猪肺炎支原体气溶胶疫苗的安全性。本研究通过优化猪传代气管上皮细胞系(STEC)的气液交界面(ALI)培养时间及培养基中血清浓度和辅助因子,发现细胞培养基血清浓度维持在10%,且在细胞分化时,添加15ng/mL视黄酸培养至第10 d时,STEC微绒毛分化状态最佳,成功建立了 ALI培养的猪传代气管上皮系3D模型,之后进行猪肺炎支原体气溶胶疫苗的安全性评估试验,主要分为以下两个部分:1 猪肺炎支原体不同毒力菌株对猪气管上皮3D细胞的损伤差异与机制分析本试验将相同剂量的Mhp强毒株NJ株、中等毒力菌株AH株和弱毒株168L株分别感染3D培养的STEC,分别通过单层细胞跨膜电阻检测、Alamar Blue检测、乳酸脱氢酶(LDH)释放检测等试验测定细胞单层完整性与细胞活性,并通过激光共聚焦和荧光分光光度计测定感染后48 h的细胞MUC5B黏液蛋白的分泌量;还从细胞氧化系统方面,比较检测各感染组细胞内NO和内源性ROS分泌量,进一步探索Mhp的致病机制。结果如下:(1)强毒株NJ株和中等毒力AH株组微绒毛有明显的变粗、破损和脱落现象,而弱毒株168L株组对微绒毛的影响较小;Mhp菌株感染后细胞单层跨膜电阻显著下降,且电阻下降程度与菌株毒力呈正相关。(2)Alamar Blue检测试验、乳酸脱氢酶释放检测结果均表明,Mhp NJ株与AH株感染后均可以显著降低细胞活性,且在感染后48 h最明显。Mhp菌株感染后还可促进细胞分泌MUC5B黏蛋白,菌株毒力越强,刺激黏蛋白分泌的量也越多。(3)氧化应激检测结果显示,除Mhp弱毒菌株168L外,中等毒力菌株AH株和强毒株NJ株感染3D分化的STEC细胞后,可显著刺激细胞分泌NO和内源性ROS,显著引起细胞的氧化应激反应。而经ROS抑制剂(NAC)处理后,强毒株NJ株、中等毒力AH株和弱毒株168L株组细胞ROS和黏液分泌量均显著降低,细胞活性和电阻值均显著升高。(4)以上结果表明,Mhp感染可影响宿主细胞的生长特性、活性与功能,损伤分化的微绒毛,其损伤的能力与菌株毒力呈正相关;而这种损伤机制与Mhp菌株引起感染细胞氧化应激的能力密切相关。2 基于3D细胞培养技术评估气溶胶接种方式的安全性本试验首先建立和优化猪肺炎支原体气溶胶疫苗体外评估的气溶胶喷雾装置,将相同剂量的猪肺炎支原体168弱毒菌株分别通过气溶胶方式和滴加方式接种3D培养的猪气管上皮细胞,分别通过单层细胞跨膜电阻检测、Alamar Blue检测、乳酸脱氢酶释放检测等试验测定接种3 h、48h后细胞单层完整性与细胞活性,并通过激光共聚焦和荧光分光光度计测定感染3 h、48 h的细胞MUC5B黏液蛋白分泌量,从细胞生长特性、活性和黏液分泌功能方面比较不同接种方式的Mhp168弱毒菌株对STEC分化细胞的影响,并从氧化损伤和炎性因子分泌角度,比较不同接种组细胞内源性ROS释放水平和促炎因子(IL-6、TNF-α和IL-1β)分泌量,进一步探究其致病机制。结果如下:(1)扫描电镜观察,滴加疫苗组接种3 h和48 h后STEC微绒毛状态均与对照组无明显差异,而气溶胶稀释剂和疫苗组接种3 h后微绒毛均有轻微的变粗和聚集现象,但随着接种后孵育时间延长至48 h,气溶胶稀释剂和疫苗组微绒毛生长状态逐渐恢复。(2)单层跨膜电阻值和Alamar Blue、乳酸脱氢酶释放检测细胞活性结果均显示,与ALI组相比,滴加疫苗组接种后细胞活性和生长特性均下无明显下降,而气溶胶稀释剂组和疫苗组接种3 h后可显著降低细胞活性和生长特性,但随着接种时间延长至48 h,其细胞活性和生长特性又有一定程度的恢复。黏液蛋白分泌功能检测结果表明,与ALI组相比,滴加疫苗组接种后黏液蛋白分泌量无明显上调,

关键词：猪肺炎支原体猪气管上皮细胞气液交界面培养气溶胶疫苗

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副猪嗜血杆菌4型通过影响紧密连接蛋白突破呼吸道上皮屏障的初步机制

副猪嗜血杆菌4型通过影响紧密连接蛋白突破呼吸道上皮屏障的初步...

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作者：常晓静南京农业大学

学位级别：硕士

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪重要的细菌性病原,作为机会致病菌能够感染猪,引起以脑膜炎、多发性浆膜炎以及关节炎为主要特征的猪革拉泽氏病。该菌至少分为15种血清型,临床仍有约25%分离株无法定型,目前中国的主要流行菌... 详细信息

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪重要的细菌性病原,作为机会致病菌能够感染猪,引起以脑膜炎、多发性浆膜炎以及关节炎为主要特征的猪革拉泽氏病。该菌至少分为15种血清型,临床仍有约25%分离株无法定型,目前中国的主要流行菌株为血清4型和5型,且血清4型的分离率略高于5型。HPS易与其他猪的病原体如猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪链球菌等混合感染,每年对世界范围内的养猪业造成巨大的经济损失,其致病机理和有效防控研究有待进一步探索。HPS可以在健康猪的呼吸道定殖,在应激条件或共感染等情况下,引起猪发病。作为呼吸道病原菌,呼吸道上皮是防御HPS的首道防线。近期研究发现,HPS能在体外侵袭内皮细胞或上皮细胞,但是其通过呼吸道上皮屏障侵入机体的感染机制尚不明确。本研究以HPS能定殖的猪气管上皮细胞(Swine tracheal epithelial cells,STEC)作为该菌感染的细胞模型,同时建立体外呼吸道上皮细胞屏障模型,研究HPS从猪上呼吸道感染的机制,为进一步阐明副猪嗜血杆菌的致病机理提供参考。1.副猪嗜血杆菌4型HPS4-YC株感染猪气管上皮细胞STEC感染模型的建立本研究以HPS能定殖的猪气管上皮细胞STEC作为该菌感染的细胞模型,拟阐明HPS从猪上呼吸道感染的机制。通过Giemsa染色发现,HPS 4型HPS4-YC株可以黏附STEC,且HPS4-YC株对STEC的黏附能力呈现细菌剂量依赖性。研究HPS在不同感作时间和感染复数下的黏附率和侵袭率,发现HPS4-YC对STEC感作时间为2h、MOI=100时黏附和侵袭能力最强。通过测定HPS4-YC株感染的STEC细胞LDH释放量,发现HPS在黏附侵袭STEC过程中,未对感染细胞表现出细胞毒性作用。本研究初步建立了副猪嗜血杆菌感染猪气管上皮细胞STEC的感染模型,为后续的研究打下了基础。2.副猪嗜血杆菌4型感染STEC上皮屏障模型的建立副猪嗜血杆菌通过呼吸道感染机体,高毒力菌株会引起猪的急性全身性炎症反应,且易与其它猪的病原体发生共感染,引起感染猪死亡。本研究用猪气管上皮细胞STEC构建Transwell猪气管上皮屏障模型,以MOI=100细菌感染该模型,检测HPS4-YC株对STEC呼吸道上皮屏障的穿透作用。结果显示在感染的0-7h内,没有细菌穿透过屏障;第8h时,细菌开始穿过呼吸道上皮屏障,约为100CFU,穿透率不到0.001‰,第10h穿透约400CFU;而10h后的细菌的穿透率的急剧加快,12h时穿透屏障数约为2.6×10～4CFU,约为10h的65倍,穿透率约为0.02‰;14h时CFU达到2.6×10～5,约为0.22‰,说明细胞屏障被明显破坏,细菌大量穿透屏障。跨上皮/跨内皮电阻值(TEER)作为用于测量内皮和上皮单层细胞培养模型中紧密连接动力学的完整性的定量技术被广泛接受。对HPS感染屏障后屏障的TEER值进行实时记录,发现TEER在6-8h出现了下降明显。为进一步检测HPS4-YC对屏障完整性的影响,利用FITC-葡聚糖(FD-4)检测细胞旁通透性,发现从第6h开始,与对照组相比HPS4-YC感染后FD-4渗透率升高,通透性增加。对HPS感染后的STEC细胞进行LDH测定,发现HPS感染24h,对STEC没有细胞毒性。以上结果说明HPS可以破坏STEC构建的体外呼吸道上皮屏障的完整性,并穿越屏障,且不对STEC细胞产生细胞毒性。3.副猪嗜血杆菌4型感染STEC对紧密连接蛋白的影响猪气管上皮细胞是副猪嗜血杆菌能定殖的宿主细胞,前期试验已经验证HPS可以穿透猪气管上皮屏障模型,增加细胞旁通透性,破坏屏障完整性。上皮屏障主要由紧密连接和黏附连接维持,这些连接结构在呼吸道上皮中形成根尖连接复合物。本试验将STEC单层细胞与HPS4-YC株共同孵育,检测感染细胞不同感染时相紧密连接蛋白(TJ)的mRNA水平。发现HPS4-YC感染的STEC细胞 ZO-1、occludin、claudin-1转录水平下调且差异显著,而claudin-4的转录水平有所升高;免疫印迹试验发现,ZO-1、occludin和claudin-1的蛋白表达量均发生减少;间接免疫荧光共聚焦结果同样提示紧密连接分布的完整性被破坏。以上研究结果表明,HPS可以通过下调紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的转录和表达,破坏紧密连接结构,突破猪气管上皮细胞屏障。

关键词：副猪嗜血杆菌4型猪气管上皮细胞上皮屏障模型紧密连接蛋白

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