检索结果-内蒙古大学图书馆

黑龙江畜牧兽医 2011年第11期 124-125页

作者：兰海楠赵小丽孔金超李维郭风赵雪郑鑫吉林农业大学动物科技学院长春130118 延边大学农学院吉林延吉133400

为了研究制备抗猪繁殖和呼吸系统综合征病毒重组核衣壳蛋白(N蛋白)单克隆抗体,试验用N蛋白免疫Balb/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选等技术制备单克隆抗体。结果表明:所制备的单克隆抗体3B... 详细信息

为了研究制备抗猪繁殖和呼吸系统综合征病毒重组核衣壳蛋白(N蛋白)单克隆抗体,试验用N蛋白免疫Balb/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选等技术制备单克隆抗体。结果表明:所制备的单克隆抗体3B5为IgG2a亚类,杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水单克隆抗体的ELISA效价分别为1∶800和1∶32 000,连续培养20代后能稳定分泌抗体。

关键词：猪繁殖与呼吸系统综合征病毒单克隆抗体核衣壳蛋白(N蛋白)

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分泌抗猪繁殖与呼吸系统综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与鉴定

分泌抗猪繁殖与呼吸系统综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备...

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作者：王莉娟河南农业大学

学位级别：硕士

用纯化的猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（PRRSV）免疫Balb/c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术，取脾细胞与NS0骨髓瘤细胞融合，经间接ELISA筛选，三次有限稀释法克隆，得到一株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸系统综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细... 详细信息

用纯化的猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（PRRSV）免疫Balb/c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术，取脾细胞与NS0骨髓瘤细胞融合，经间接ELISA筛选，三次有限稀释法克隆，得到一株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸系统综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株：6PR。经鉴定，该单抗为IgG1亚类，杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条，杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水单克隆抗体的ELISA效价分别为1：256和 1：20480。经Western-blot鉴定为针对 N蛋白的单抗。6PR株单克隆抗体与伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒均不发生交叉反应，显示出良好的特异性。连续培养20代后能稳定分泌抗体。此单克隆抗体的获得为PRRS病毒的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸系统综合征病毒单克隆抗体间接ELISA 杂交瘤

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猪繁殖与呼吸综合征病毒E＋M＋N基因重组腺病毒的构建

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中国人兽共患病学报 2011年第5期27卷 394-397,402页

作者：徐娜李宝玉柳纪省中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室兰州730046

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称猪蓝耳病,是由病毒引起的一种高度接触性传染病,可导致母猪晚期流产、早产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪严重的呼吸道症状及高死亡率。该病毒已在全世... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称猪蓝耳病,是由病毒引起的一种高度接触性传染病,可导致母猪晚期流产、早产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪严重的呼吸道症状及高死亡率。该病毒已在全世界范围内广泛流行,给养殖业造成了重大的经济损失。目前,传统的疫苗无法提供完全的保护作用,开发研制新型疫苗已迫在眉睫。PRRSV基因组长约15kb,有8个不同程度的开放阅读框(ORFS),即ORF1-ORF7。该病毒具有3个重要的结构蛋白,即E蛋白,M蛋白和N蛋白,这三种蛋白分别由病毒基因ORF5,ORF6和ORF7编码。本试验构建了含猪繁殖与呼吸综合征病毒E+M+N基因的重组腺病毒。首先用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法分别扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因、M基因和N基因,将三者用口蹄疫病毒2A序列串联起来,将连接好的E+M+N基因插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV。将获得的重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,获得了插有外源基因的重组腺病毒质粒pAd/E+M+N;最后,经PacⅠ酶切线性化后转染HEK-293细胞,成功地得到含有E+M+N基因的重组腺病毒,为重组腺病毒活载体疫苗的研究奠定基础。

关键词：猪繁殖与呼吸系统综合征病毒 E+M+N基因重组腺病毒

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线粒体分裂及线粒体自噬关键蛋白在抗PRRSV感染中的作用及机制研究

线粒体分裂及线粒体自噬关键蛋白在抗PRRSV感染中的作用及机制研究

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作者：李帅峰华中农业大学

学位级别：博士

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS,Porcine Reproductive and Respiration Syndrome)的病原体是单股正链RNA病毒—猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV,PRRS Virus),能够引起母猪繁殖障碍及仔猪呼吸道疾病。PRRS因其具有高致病性、高传染率、高死亡率... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS,Porcine Reproductive and Respiration Syndrome)的病原体是单股正链RNA病毒—猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV,PRRS Virus),能够引起母猪繁殖障碍及仔猪呼吸道疾病。PRRS因其具有高致病性、高传染率、高死亡率的特点,对我国及至世界的养猪业造成巨大的经济损失;又由于PRRSV感染后导致宿主免疫抑制进而出现的伴随感染以及亚临床症状,对防治猪繁殖与呼吸综合征工作带来了很多不利因素;PRRSV还具有高变异、抗体依赖性等特征,目前疫苗及药物还不能有效地控制该病。此外,由于大量死亡猪、药物残留造成的生态环境破坏及家畜肉类产品安全隐患。因此,研究和阐明PRRSV与宿主的相互作用、免疫抗病等机制,将为培育抗病新品种(系)提供基因或分子靶点资源。线粒体不仅是细胞内重要的能量器官,线粒体还是重要的天然免疫场所,对获得性免疫存在不可忽视的调控作用。为维持线粒体网络的稳态,细胞内的线粒体既不断发生分裂与融合,同时还通过线粒体自噬来清除功能受损的线粒体。近年来的研究发现线粒体动态(融合与分裂)在线粒体介导的天然免疫过程中发挥至关重要的作用,线粒体融合能够促进天然免疫反应而线粒体分裂能够抑制天然免疫反应。因此许多病毒以线粒体为靶标进化出不同的策略来逃避天然免疫反应。然而,线粒体动态与线粒体自噬关键蛋白对PRRSV感染的作用及机理还不甚清楚。故本研究对线粒体动态与线粒体自噬关键蛋白在抵抗PRRSV的感染中的作用及机制进行了研究。主要研究结果如下:1、Drp1蛋白在PRRSV感染后在Ser616位点发生磷酸化并转位到线粒体介导线粒体分裂的发生。以Marc145细胞为模式细胞研究PRRSV感染引起的细胞反应。通过透射电镜和共聚焦显微镜分析在PRRSV感染前后细胞内线粒体的形态变化。PRRSV感染能够引起细胞内线粒体形态由长线状转变为小而圆的颗粒状,并且线粒体嵴出现明显肿胀。表明PRRSV感染能够引起细胞内线粒体形态发生较大的改变,即引起线粒体分裂。为了进一步揭示PRRSV感染引起线粒体形态改变(分裂)的分子机制,对线粒体分裂因子Drp1的表达与定位进行了检测。通过利用Western Bloting、共聚焦显微镜技术以及亚细胞分离技术,检测结果发现线粒体分裂因子Drp1在PRRSV感染后其Ser616位点发生磷酸化,且Ser616磷酸化的Drp1能够从胞质转移到线粒体表面,从而介导线粒体分裂的发生。这些结果表明PRRSV感染能够引起宿主细胞Drp1依赖的线粒体分裂过程。2、抑制线粒体分裂关键蛋白Drp1通过促进细胞凋亡抑制PRRSV感染。线粒体与细胞凋亡、天然和获得性免疫以及病毒感染之间存在密切的联系。本研究发现干扰Drp1介导的线粒体分裂抑制PRRSV病毒的感染,而这种抑制作用是通过促进被感染细胞凋亡实现的。si RNA干扰Drp1表达抑制Drp1介导的线粒体分裂后PRRSV在细胞内的感染也受到显著的抑制;进一步的研究发现干扰Drp1表达显著地提高细胞内的cleaved-Caspase3和cleaved-PARP表达,且Caspase3的活性也显著高于对照组。因此推测PRRSV感染引起的Drp1依赖的线粒体分裂是通过抑制细胞凋亡而为PRRSV赢得更长时间在宿主细胞中感染。***感染引起宿主细胞线粒体自噬而降低线粒体DNA拷贝数及线粒体质量。线粒体动态与线粒体质量存在密切联系。PRRSV感染改变线粒体动态,是否能够改变线粒体质量?采用q PCR和Western Blotting技术分别对线粒体质量进行检测。结果发现PRRSV感染后线粒体DNA拷贝数随着病毒感染时间的延长而降低;对线粒体标志蛋白Tom20的检测表明线粒体质量在PRRSV感染后也显著降低,并且随着感染时间的延长而加深。通过干扰线粒体自噬相关蛋白Parkin抑制线粒体自噬的情况下,PRRSV引起的线粒体DNA拷贝数降低被挽救,表明PRRSV引起的线粒体DNA拷贝数降低是由于病毒感染引起的线粒体自噬导致的。4、Parkin在PRRSV感染后发生线粒体转位并介导线粒体自噬。细胞内多余或功能缺失的线粒体主要通过线粒体自噬的方式被清除。此前包括本实验室在内已经发表多篇论文表明PRRSV感染能够引起细胞自噬的发生。本研究电镜分析显示PRRSV感染能够引起宿主细胞线粒体肿胀,嵴受损。那么这种异常的线粒体是否能够通过线粒体自噬的方式被降解并未见报道。因此利用q PCR、Western Blotting技术以及共聚焦等技术对PRRSV感染不同时间线粒体自噬分子的表达及定位情况进行分析。结果发现线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin在PRRSV感染后大量表达。此外从分离出的线粒体中也检测到Parkin的聚集。而在干扰Par

关键词：猪繁殖与呼吸系统综合征病毒线粒体分裂线粒体自噬细胞凋亡

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全基因组CRISPR/Cas9文库筛选的宿主基因及细胞自噬在猪病毒复制中的作用与机理研究

全基因组CRISPR/Cas9文库筛选的宿主基因及细胞自噬在猪病毒复制...

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作者：周傲华中农业大学

学位级别：博士

猪病毒性疾病严重影响猪生产性能和经济效益,然而猪病毒性疾病（如PRRS等）仍然还不能有效地被治愈,其中重要原因之一是对病毒致病机理、病毒与宿主（猪）间相互作用、猪抗病毒等机制及其重要基因功能还不十分清楚。因此,急需要对病毒... 详细信息

猪病毒性疾病严重影响猪生产性能和经济效益,然而猪病毒性疾病（如PRRS等）仍然还不能有效地被治愈,其中重要原因之一是对病毒致病机理、病毒与宿主（猪）间相互作用、猪抗病毒等机制及其重要基因功能还不十分清楚。因此,急需要对病毒复制具有重要调控作用的宿主基因以及细胞自身应答机制等进行研究。研究成果将在抗病育种、抗病毒药物疫苗研制等将具有重要的应用价值,以及对控制病毒传播具有重要的参考价值。CRISPR/Cas9基因编辑系统是细菌用来防御入侵病原的有效工具,CRISPR/Cas9系统是利用向导系列gRNA的识别介导Cas9蛋白的定位,对目标基因DNA进行遗传修饰。细胞自噬作为宿主体内重要的保护机制,在病毒感染过程中发挥着重要的作用。越来越多研究证实了病毒与细胞自噬间存在重要的互作,但细胞自噬对猪繁殖呼吸综合征病毒（PRRSV）复制增殖与机理还不清楚,因此本研究通过利用CRISPR/Cas9系统在猪全基因组范围内筛选与病毒感染相关的宿主基因以及细胞自噬调控猪病毒复制的作用机制方面进行了探讨。主要研究结果如下:1.证实了 CRISPR/Cas9系统在猪细胞系中能高效地诱导猪基因敲除为了确定CRISPR/Cas9基因组编辑技术能成功的敲除猪细胞中基因,首选,在猪细胞系PK15和C△2（+）细胞中分别瞬时转染Cas9表达载体和靶基因DPM1的gRNA载体,利用流式细胞仪检测发现转染的猪细胞中DPM1基因有10%左右的敲除效率,初步表明CRISPR/Cas9系统能够诱导猪细胞基因表达沉默。然后将Cas9基因整合到猪细胞中得到稳定表达Cas9的细胞系,瞬时转染基因DPM1的gRNA载体,基因敲除率达到20%-30%。进一步在Cas9稳表达的转基因猪细胞系中转染DPM1目基因gRNA进入该细胞系,并筛选获得Cas9和gRNA都稳定表达的,DPM1基因敲除效率超过80%。该结果证明了表达Cas9和gRNA能够有效的诱导靶基因的双链断裂（DSBs）,而且Cas9和gRNA都稳定表达时基因敲除效率最高,可用于基因敲除和基因功能筛选等方面的研究。2.构建了猪全基因组CRISPR/Cas9文库,并且利用高通量测序鉴定了该文库具有较高诱导基因突变的效应,可以进行大规模遗传筛选为了充分利用CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的价值,设计和构建了猪全基因组CRISPR/Cas9文库;高通量测序发现该慢病毒质粒文库包含了 65316个gRNAs,并且全部的基因都含有至少2个gRNAs。进一步利用构建的慢病毒质粒文库分别两种稳定表达Cas9的猪细胞系,形成了两个猪全基因组基因敲除的猪突变细胞系。高通量测序结果分析发现两个猪突变细胞系中都包含13000多个基因,并且每个基因至少含有1个gRNA。说明构建的全基因组突变的猪突变细胞系具有很好的质量,可以进行大规模功能缺失筛选。3.利用构建的全基因组突变的猪细胞系筛选和鉴定与猪流感病毒复制相关的宿主基因本研究以猪流感病毒为研究对象,分别感染全基因组突变的猪细胞系。通过分析和筛选,初步获得了与猪流感病毒复制相关的宿主基因,筛选获得了 140个候选宿主基因。为了进一步验证筛选结果,本研究有设计合成了含有217个基因的二级文库,通过利用两种流感病毒株分别进行筛选,结果获得61个候选基因;然后通过与第一次筛选结果比对,发现有42个基因共同出现在两次筛选中。为了验证每个候选基因,本研究选择了 32个重要的候选基因分别单独设计gRNA,分别转染到Cas9稳定表达的PK15Cas9和C△2（+）Cas9细胞系中,感染流感病毒;利用空斑实验和激光共聚焦实验进行鉴定,该候选基因被敲除和功能缺失后不同程度地降低猪流感病毒的复制增殖,证明被筛选出候选基因在病毒复制增殖中具有一定作用。此外,该结果也同时证明了建立的猪CRISPR/Cas9技术在猪遗传筛选中具有较重要的用应用价值。***感染能诱导细胞自噬和凋亡,并且细胞自噬要早于PRRSV诱导的细胞凋亡以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为研究对象,以MARC-145细胞为模型开展研究。PRRSV感染后明显的触发LC3呈现点状聚集分布,并且诱导LC3 I转化成LC3Ⅱ,但是p62蛋白的表达却不断的减少,表明PRRSV感染可以诱导细胞自噬体形成。此外,通过细胞核染色发现PRRSV感染同样能诱导细胞凋亡的发生,感染后约24小时后诱导细胞凋亡。同时,利用透射电镜观察发现自噬体在感染12小时就能观察到,而细胞核在感染24小时才出现凋亡特性变化,表明细胞自噬要先于PRRSV诱导的细胞凋亡。5.细胞自噬通过抑制细胞凋亡而促进PRRSV增殖细胞自噬和凋亡间存在复杂的相互作用,本研究发现两者都参与PRRS病毒复制调控。通过利用自噬抑制剂3-MA处理细胞来抑制自噬,发现自噬抑制能够显著地提高PRRSV诱

关键词： CRISPR/Cas9 宿主基因猪流感病毒细胞自噬细胞凋亡猪繁殖与呼吸系统综合征病毒

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猪繁殖与呼吸综合征病毒M+N基因重组腺病毒载体的构建

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生物技术通报 2010年第10期26卷 168-171页

作者：徐娜李宝玉柳纪省中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室兰州730046

本研究构建了M+N基因的重组腺病毒载体。首先用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法分别扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因和N基因,将两者用口蹄疫病毒2A序列串联起来,将连接好的M+N基因插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经筛选获得了重... 详细信息

本研究构建了M+N基因的重组腺病毒载体。首先用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法分别扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因和N基因,将两者用口蹄疫病毒2A序列串联起来,将连接好的M+N基因插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经筛选获得了重组质粒pAdTrack-CMV/M+N;然后在大肠杆菌BJ5183内将此重组质粒和腺病毒骨架载体pAdEasy-1进行同源重组,获得了插有外源基因的重组腺病毒质粒pAd/M+N;最后,经PacⅠ酶切线性化后转染HEK-293细胞,成功获得含有M+N基因的重组腺病毒,为重组腺病毒活载体疫苗的研究奠定基础。

关键词：猪繁殖与呼吸系统综合征病毒 M+N基因重组腺病毒

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荧光金纳米团簇用于病毒成像分析及抗病毒研究

荧光金纳米团簇用于病毒成像分析及抗病毒研究

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作者：白艳丽华中农业大学

学位级别：硕士

荧光金纳米团簇(Au NCs)因其亚纳米级尺寸表现出独特的光电化学性质,如光稳定性好、双光子吸收截面积大和良好的生物相容性等优点,在离子检测、生物分子检测、细胞成像、活体诊断和抗肿瘤方面都有研究报道,然而AuNCs对病毒的影响鲜有报... 详细信息

荧光金纳米团簇(Au NCs)因其亚纳米级尺寸表现出独特的光电化学性质,如光稳定性好、双光子吸收截面积大和良好的生物相容性等优点,在离子检测、生物分子检测、细胞成像、活体诊断和抗肿瘤方面都有研究报道,然而AuNCs对病毒的影响鲜有报道。本论文探究不同修饰剂的AuNCs对猪伪狂犬病毒(PRV)及猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)的影响,并将其进行细胞成像研究。1.以谷胱甘肽(GSH)为修饰剂合成水溶性的荧光GSH-AuNCs,采用荧光光谱(FL)、紫外光谱(UV)、水合粒径(DLS)、透射电子显微镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和X-射线光电子能谱(XPS)对GSH-Au NCs进行表征,用MTT法评估了GSH-Au NCs在非洲绿猴肾传代细胞(MARC-145)和猪肾传代细胞系(PK-15)的细胞毒性,结果表明:GSH-Au NCs具有良好的光稳定性,当其浓度小于450 μmol/L时,PK-15和MARC-145细胞的存活率大于80%。将GSH-Au NCs应用于PRV入侵PK-15细胞和PRRSV入侵MARC-145细胞的影响研究,通过空斑试验、间接免疫荧光试验和Weston blot试验,结果表明:GSH-Au NCs具有选择性抗PRRSV的作用,而对PRV无明显影响。最后以GSH-Au NCs为荧光探针通过激光共聚焦扫描显微镜观察PRV入侵PK-15细胞的过程,观察到PRV侵入PK-15细胞12 h后在细胞核发现明显的绿色荧光,说明PRV在复制后期会明显的破坏PK-15细胞的细胞核。这将为AuNCs应用于抗病毒领域提供一定的借鉴意义。2.以牛血清白蛋白(BSA)为修饰剂合成水溶性的荧光BSA-Au NCs和Au-Ag NCs,并对合成的AuNCs进行FL、UV、DLS和FT-IR的表征,用MTT法评估了BSA-Au NCs和Au-Ag NCs在PK-15细胞的细胞毒性,结果表明:BSA-Au NCs和Au-Ag NCs具有良好的光稳定性,当两种Au NCs的浓度小于600 μmol/L时,PK-15细胞的存活率在80%以上。将BSA-Au NCs和Au-Ag NCs用于PK-15细胞成像研究,发现这两种Au NCs在PK-15细胞中观察不到明显的荧光。最后,探究这两种Au NCs对于PRV入侵PK-15细胞的影响,发现BSA-Au NCs和Au-Ag NCs对于PRV入侵PK-15细胞无明显的影响。这一研究结果有望将AuNCs进一步应用于病毒的标记研究。

关键词：金纳米团簇表征细胞成像伪狂犬病毒猪繁殖与呼吸系统综合征病毒蛋白表达

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猪繁殖和呼吸综合征病毒GP3蛋白糖基化位点突变株的构建及其生物学特性分析

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中国动物传染病学报 2011年第3期19卷 1-8页

作者：刘欢欢周艳君姜一峰张善瑞童光志中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为研究猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP3蛋白糖基化位点的作用,在弱毒疫苗株HuN4-F112感染性克隆的基础上,采用点突变的方法对GP3蛋白N29、N42、N50、N131位进行单点或多点... 详细信息

为研究猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP3蛋白糖基化位点的作用,在弱毒疫苗株HuN4-F112感染性克隆的基础上,采用点突变的方法对GP3蛋白N29、N42、N50、N131位进行单点或多点组合突变去糖基化,构建了不同糖基化位点的单点和多点突变的PRRSV全长cDNA克隆,最终成功救获N29Q、N42Q、N50Q、N131Q、N29Q/N50Q、N29Q/N195Q六株含糖基化位点突变的病毒,而其余几种糖基化位点突变组合的全长cDNA未能拯救出病毒。对拯救毒株进行滴度测定及多步生长曲线绘制等特性分析,结果显示N29Q、N42Q、N50Q、N131Q位单个糖基化位点的缺失虽不影响子代病毒的产生但会不同程度地降低PRRSV感染细胞的能力,其中N50Q突变体较亲本下降6个滴度且生长明显延迟。多个糖基化位点同时缺失则会影响病毒的拯救,推测这些糖基化位点可能是产生具有感染性病毒粒子所不可或缺的。

关键词：猪繁殖与呼吸系统综合征病毒 GP3蛋白糖基化位点定点突变

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