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建立CAR-t细胞治疗产品质量控制检测方法及其定量参考品的数字PCR方法研究

中国新药杂志 2021年第24期30卷 2306-2314页

作者：豆敏华朱冰美宗伟英吴晓双杨志行中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心湖州申科生物技术有限公司

目的:本研究建立嵌合抗原受体t（CAR-t）细胞治疗产品质量控制中猿猴病毒40大t抗原（SV40LtA）,腺病毒早期区域1A蛋白（E1A）和质粒残留水平的荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测方法,同时采用微流控芯片式数字PCR技术对质粒定量参考品... 详细信息

目的:本研究建立嵌合抗原受体t（CAR-t）细胞治疗产品质量控制中猿猴病毒40大t抗原（SV40LtA）,腺病毒早期区域1A蛋白（E1A）和质粒残留水平的荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测方法,同时采用微流控芯片式数字PCR技术对质粒定量参考品进行赋值。方法:通过建立多重荧光定量PCR的方法,在一个反应中同时检测SV40LtA和E1A的残留水平。针对目前慢病毒等包装技术存在多种质粒组合系统（如四质粒和五质粒）,对质粒的残留检测标准难以统一,本研究从同源性很高的复制子区域入手,设计和筛选引物探针,能同时检测多种不同质粒的总体残留水平。建立数字PCR技术分别对SV40LtA和E1A的质粒定量参考品拷贝数浓度标定方法进行方法学验证和赋值。结果:SV40LtA和E1A双重定量PCR方法的特异性好,最低定量限分别达到2.80×10和2.98×10 copies·μL-1。质粒残留检测法的最低定量限可达到2.80×10 copies·μL-1。通过采用目前快速发展的数字PCR技术进行赋值,经典吸光度法计算质粒定量参考品SV40LtA和E1A的拷贝数浓度为2.80×10～8和2.98×10～8 copies·μL-1;经数字PCR标定分别为1.06×10～8和1.21×10～8 copies·μL-1。结论:本研究建立的SV40LtA,E1A和质粒检测方法灵敏度较高、特异性强,能满足CAR-t细胞治疗产品的质量控制要求。经典的吸光度法定值的结果大于数字PCR方法,大约有2倍左右的差别。

关键词：嵌合抗原受体t 细胞治疗猿猴病毒40大t抗原腺病毒早期区域1A蛋白质粒残留数字聚合酶链式反应

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人脐静脉内皮细胞永生化及生物学特性的研究

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中华实验外科杂志 2019年第1期36卷 60-62页

作者：李盛波郑勇斌武汉大学人民医院重症医学科 430060 武汉大学人民医院胃肠外科 430060

目的建立永生化人脐静脉内皮细胞(HUVECs)系并探讨永生化对HUVECs增殖、凋亡及成瘤性影响。方法扩增并提取猿猴病毒40大t抗原(SV40Lt)和人端粒酶反转录酶催化亚基(htERt)基因,反转录病毒载体介导感染HUVECs;筛选2周;聚合酶链反应(PCR)... 详细信息

目的建立永生化人脐静脉内皮细胞(HUVECs)系并探讨永生化对HUVECs增殖、凋亡及成瘤性影响。方法扩增并提取猿猴病毒40大t抗原(SV40Lt)和人端粒酶反转录酶催化亚基(htERt)基因,反转录病毒载体介导感染HUVECs;筛选2周;聚合酶链反应(PCR)扩增后行琼脂糖凝胶电泳成像鉴定目的基因是否转入HUVECs;细胞计数法比较细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡、裸鼠成瘤实验检测细胞恶性转化。结果筛选出抗嘌呤霉素阳性克隆,SV40Lt、htERt成功转入HUVECs;永生化组细胞生长曲线上移,细胞增殖第5、6、7天,SV40Lt永生化组及htERt永生化组与HUVECs组细胞数目差异有统计学意义(P<0.05),htERt永生化组和HUVECs组细胞数目差异有统计学意义(P<0.05);HUVECs组细胞总凋亡率为(11.2±0.9)%,SV40Lt永生化组HUVECs总凋亡率为(3.4±0.4)%,htERt永生化组HUVECs总凋亡率为(2.8±0.4)%,SV40Lt永生化组、htERt永生化组凋亡率均低于HUVECs组(均P<0.05);两种永生化细胞株不具成瘤性。结论SV40Lt、htERt基因能使HUVECs发生永生化,永生化HUVECs增殖能力增强,凋亡率下降,无恶性转化。

关键词：猿猴病毒40大t抗原人端粒酶反转录酶催化亚基反转录病毒载体人脐静脉内皮细胞永生化

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1.帕米磷酸钠对成骨不全成骨细胞和成纤维细胞增殖分化的研究 2.成骨不全成纤维细胞永生化细胞系的建立

1.帕米磷酸钠对成骨不全成骨细胞和成纤维细胞增殖分化的研究 2....

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作者：李公超济南大学

学位级别：硕士

背景与目的成骨不全(Osteogenisis Imperfecta)是一种由于间充质组织发育不全、胶原形成障碍而造成的先天性遗传性疾病,又称脆骨症(Fragililis ossium)、原发性骨脆症(Idiopathic osteopsathyrosis)及骨膜发育不良(Periosteal dysplasia)。目前针对成骨不全的治疗主要采用手术矫形后的髓内针固定术及术后双磷酸盐药物的输液治疗。双磷酸盐类药物可降低骨转换,抑制骨吸收,临床上常被用于治疗一些骨吸收亢进疾病,如绝经后骨质疏松症、Puget’s病等。其主要作用机制是通过抑制破骨细胞内甲羟戊酸通路的关键酶使胞内的小G蛋白无法异戊二烯化,从而影响破骨细胞(osteoclast,OC)的生长和分化,促其凋亡。但近几年的研究发现,双磷酸盐可通过对成骨细胞的作用来间接抑制破骨细胞,而且对间充质干细胞(bone marrow stormal cells, BMSCs)和成骨细胞(osteoblast,OB)的增殖和分化也有一定的影响。关于双磷酸盐对成纤维细胞(fibroblast,FB)的作用探讨主要集中在双磷酸盐引起的颌骨坏死疾病(BRONJ)中,研究者发现采用不同剂量的唑来膦酸处理成纤维细胞,其中高于10μM浓度的唑来磷酸盐即可引起成纤维细胞的程序性死亡,这种死亡机制部分是由胞内的甲羟戊酸途径介导的,而较低剂量的唑来磷酸盐则促进细胞增殖及IL-6,IL-8等细胞因子的表达。近几年由于成骨不全症骨质疏松的临床病理表现,双磷酸盐类药物被引入了该病的术后治疗中。其中帕米磷酸钠是主流的针对成骨不全症的治疗药物。本实验用不同浓度的帕米磷酸钠作用于成骨不全患者成骨细胞和成纤维细胞,研究药物对患者细胞增殖分化的影响。方法: 1.收集成骨不全(OI)患者和对照组先天性髋脱位(dislocation of the hip,DDH)患者的股骨松质骨和大腿皮肤组织,消化处理,收集细胞,进行原代培养及鉴定。每一实验组及其对照组含有三例样本。 2.采用10-3M～10-10M等8个帕米磷酸钠药物梯度处理实验组和对照组原代成骨细胞和成纤维细胞48h、72h。采用四甲基偶氮唑盐(Mtt)法检测药物对细胞增殖的影响。采用碱性磷酸酶(ALP)活性测定法(ELISA)检测对成骨不全症成骨细胞和成纤维细胞成骨分化的影响。结果: 1.原代培养成骨不全症和髋关节脱位患者成骨细胞和成纤维细胞,细胞生长状态稳定,可持续传代。经BCIP/NBt碱性磷酸酶显色试剂盒染色鉴定成骨细胞碱性磷酸酶高表达,成纤维细胞低表达。 2.药物作用48h和72h均有利于细胞增殖,其中72h作用效果较明显(P<0.01)。10-3M,10-4M浓度帕米磷酸钠明显抑制两组细胞增殖(P<0.01);10-5M～10-10M浓度的帕米磷酸钠对两组细胞增殖有促进作用,其中实验组成骨细胞和成纤维细胞最佳增殖浓度分别为10-8M和10-6M(P<0.01),对应增殖率可分别达到43%和39%。对照组成骨细胞和成纤维细胞的最佳增殖浓度分别为10-7M和10-5M(P<0.01),对应增殖率为37%和28%。 3.药物浓度在10-5M～10-9M时都促进细胞ALP表达,且ALP活性变化与细胞增殖相一致。其中实验组成骨细胞和成纤维细胞最高ALP活性分别为102U/L和32U/L。结论: 帕米磷酸钠促进实验组和对照组成骨细胞及成纤维细胞增殖能力和碱性磷酸酶的表达,但是对于实验组细胞的作用更明显。针对成骨不全病人适当的给药方案有利于患者骨质增强。背景与目的:细胞原代培养费事费力,而且细胞传代次数有限,在体外长期培养是细胞生理功能容易发生变异,造成实验结果因细胞代数的不同而难以比较。建立永生化的细胞系可以为细胞水平的研究提供一个有效的试验平台,保证实验结果的一致性。本实验利用SV40t能促进细胞永生化的功能,构建含有SV40t基因的真核表达载体并转染成骨不全成纤维细胞构建稳定细胞系,为成骨不全细胞水平实验提供稳定细胞平台。方法: 1. PCI-neo-SV40t重组载体的构建:限制性内切酶XhoI和SalI双酶切PAAV-SV40t,PCI-neo-htERt得PCI-neo载体片段和SV40t基因片段。两片段经连接后转化DH5α宿主菌,重组载体PCI-neo-SV40t经PCR及酶切验证。 2. PCI-neo-SV40t重组质粒通过脂质体转染经鉴定的成骨不全原代成纤维细胞。结果: 1.重组载体PCI-neo-SV40t经XhoI与SalI双酶切以及PCR验证正确。 2.重组质粒PCI-neo-SV40t

关键词：帕米磷酸钠成骨不全症成骨细胞成纤维细胞细胞增殖 ALP活性永生化猿猴病毒40大t抗原成骨不全成纤维细胞

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pcDNA3(-)SVt重组质粒的构建及其在小鼠小肠上皮细胞中的表达

pcDNA3(-)SVT重组质粒的构建及其在小鼠小肠上皮细胞中的表达

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作者：韩庆广扬州大学

学位级别：硕士

小肠是营养物质吸收的主要场所,小肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC)是肠道主要的功能细胞,参与肠道食糜的消化、吸收、免疫屏障和应激反应等,并与肠道的内、外分泌功能有密切关系。原代培养小肠上皮细胞费时费力,传代次数有... 详细信息

小肠是营养物质吸收的主要场所,小肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC)是肠道主要的功能细胞,参与肠道食糜的消化、吸收、免疫屏障和应激反应等,并与肠道的内、外分泌功能有密切关系。原代培养小肠上皮细胞费时费力,传代次数有限,在体外长期培养条件下,细胞生理功能容易变异,造成试验结果因细胞代数不同而难以比较。建立永生化小肠上皮细胞系,可以为研究肠道微生态营养和小肠上皮细胞的增殖分化提供重要的研究工具。本文旨在利用SV40t能促进细胞永生化的功能,构建含有SV40t基因的真核表达载体,将重组克隆转染小鼠小肠上皮细胞,进行小鼠小肠上皮细胞的永生化研究,为永生化小鼠小肠上皮细胞系的建立提供参考依据。设计并构建pcDNA3(-)SVt真核表达载体。PVUII酶切改造pcDNA3真核表达载体,改造产物命名为pcDNA3(-),XholI酶切pGEM-Lt,电泳胶回收得到SV40t基因片段,将其插入pcDNA3(-)真核表达载体,PStI酶切连接产物,通过琼脂糖电泳筛选出插入方向正确的连接产物,并将其送生物公司测序。探索小鼠小肠上皮细胞的分离纯化方法,得到纯度较高的小鼠小肠上皮细胞。以胎鼠小肠为材料,通过组织块培养法进行原代小鼠小肠上皮细胞的体外培养,采用刮除法和相差消化及相差贴壁法对细胞进行纯化,用0.05% trypsin-EDtA进行消化传代,通过形态学观察和免疫组织化学进行鉴定。将SV40 t基因导入小鼠小肠上皮细胞,进行永生化研究。采用脂质体转染法,将编码SV40 t基因的真核表达载体pcDNA3(-)SVt导入经纯化的小鼠小肠上皮细胞,以pEGFP-N1为报告基因检测转染效率,通过PCR和Rt-PCR检测SV40 t基因在小鼠小肠上皮细胞中成功表达。结果表明:真核表达载体pcDNA3(-)SVt构建成功,为利用SV40 t抗原进行真核细胞永生化研究提供了稳定、可靠的分子工具。通过组织块培养法得到的小鼠小肠上皮细胞生长状况良好,增殖旺盛,经过纯化,得到了纯度较高的小鼠小肠上皮细胞,免疫组织化学鉴定为阳性。为小鼠小肠上皮细胞的永生化研究提供较好的细胞材料。PCR和Rt-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳都检测到372bp的目的条带,表明SV40 t基因在小鼠小肠上皮细胞中成功表达,为永生化小鼠小肠上皮细胞系的建立奠定了基础。

关键词：小鼠猿猴病毒40大t抗原 IEC(小肠上皮细胞) 永生化

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温度调控tsSV40Lt抗原转基因干细胞的增殖与分化

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中华实验外科杂志 2009年第9期26卷 1218-1218页

作者：刘振林刘晓智姜忠敏杨树源张赛天津医科大学 300162 武警医学院附属医院神经外科武警医学院附属医院病理科天津医科大学总医院神经外科

脑创伤（tBI）位点及其边缘的半损伤带处于明显的缺血缺氧状态。我们的前期工作证实亚低温治疗可有效改善tBI脑血流、降低脑组织代谢率、减轻局部毒素堆积程度。我们利用温度敏感性猿猴病毒40大t抗原（tsSV40Lt）建立一种温度敏感型干... 详细信息

脑创伤（tBI）位点及其边缘的半损伤带处于明显的缺血缺氧状态。我们的前期工作证实亚低温治疗可有效改善tBI脑血流、降低脑组织代谢率、减轻局部毒素堆积程度。我们利用温度敏感性猿猴病毒40大t抗原（tsSV40Lt）建立一种温度敏感型干细胞株，观察其增殖和分化特征。

关键词： SV40Lt抗原温度调控分化增殖猿猴病毒40大t抗原干细胞转基因 ts

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鸡胚成纤维细胞永生化的初步研究

鸡胚成纤维细胞永生化的初步研究

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作者：商恒华中农业大学

学位级别：硕士

成纤维细胞(fibroblast)由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来,它是结缔组织(connective tissue)的主要细胞成分。由于相对容易获得,成纤维细胞已被广泛应用于分子和细胞生物学的研究的许多方面。鸡胚成纤维细胞(chickenem... 详细信息

成纤维细胞(fibroblast)由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来,它是结缔组织(connective tissue)的主要细胞成分。由于相对容易获得,成纤维细胞已被广泛应用于分子和细胞生物学的研究的许多方面。鸡胚成纤维细胞(chickenembryo fibroblast)除了应用于细胞和分子生物学的研究,还被广泛应用于病毒学研究领域,同时也是疫苗生产的重要细胞资源。但鸡胚成纤维细胞和其他体外培养的正常的体细胞一样,生命周期是有限的。在体外培养一段时间后,细胞就会进入增殖抑制状态,即所谓的细胞衰老,最终发生死亡。本研究通过将猿猴病毒40大t抗原基因转染鸡胚成纤维细胞,以期获得能够长期体外培养的细胞。本研究采用酶消化法培养原代鸡胚成纤维细胞,利用脂质体介导的基因转染技术将含有猿猴病毒40大t抗原基因的载体转染原代培养的鸡胚成纤维细胞,再经嘌呤霉素抗性筛选,结果确定最终的抗生素筛选浓度为1.25μg/mL左右,筛选时间为10-12天左右。在此抗性筛选条件下,转染组细胞开始增殖,大约12天左右出现抗性细胞克隆;转染细胞呈现比较典型的梭形或星形细胞。当细胞长满后传代,一般每隔5-7天传代一次,一共传了15代,培养细胞的生长性能尚未发生明显的变化,细胞生长曲线表明,转染细胞增值周期具有典型的S特征,培养1-2天,细胞处于潜伏期,细胞数量缓慢增加,24-48小时后进入指数增长期;接种4-5天后,细胞数量达到高峰,此后,死亡细胞逐渐增多,细胞生长减缓;从转染细胞基因组模板中,扩增出产物为558bp的目的片段。与Hela细胞比较,转染细胞无致瘤性。通过多代次培养、转染细胞培养特性鉴定,说明本实验所获得的鸡胚成纤维细胞株已初步获得了长期传代的能力。

关键词：鸡胚成纤维细胞永生化猿猴病毒40大t抗原转染

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SV40t荧光真核表达载体构建及转染大鼠胰岛细胞的研究

SV40T荧光真核表达载体构建及转染大鼠胰岛细胞的研究

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作者：谭琪暨南大学

学位级别：硕士

目的构建猿猴病毒40大t抗原(SV40t)荧光真核表达载体,将其转染大鼠胰岛细胞,观察胰岛细胞生物学特征及基因的变化。方法采用基因重组技术,先用NotⅠ和XhoⅠ将SV40t片断从pCMV-SV40t质粒上双酶切下来,回收后克隆到克隆载体pSC-A中成为pSC... 详细信息

目的构建猿猴病毒40大t抗原(SV40t)荧光真核表达载体,将其转染大鼠胰岛细胞,观察胰岛细胞生物学特征及基因的变化。方法采用基因重组技术,先用NotⅠ和XhoⅠ将SV40t片断从pCMV-SV40t质粒上双酶切下来,回收后克隆到克隆载体pSC-A中成为pSC-SV40t;再用XhoⅠ和SacⅡ将SV40t片断双酶切下来,回收后正向克隆到荧光真核表达载体pIRES2-ZsGreenl中,XhoⅠ和SacⅡ双酶切鉴定。采用脂质体法,将重组基因pIRES2-ZsGreenl-SV40t和pIRES2-ZsGreenl分别转染原代培养的大鼠胰岛细胞,G418筛选,采用荧光显微镜、Rt-PCR及细胞免疫荧光检测绿色荧光及SV40t在胰岛细胞中的表达;对建立的胰岛永生化细胞系,通过胰岛素分泌量、葡萄糖刺激胰岛素释放实验、软琼脂克隆形成实验、细胞免疫荧光、细胞生长曲线和染色体核型分析动态监测永生化胰岛细胞生物学特征的变化,通过Rt-PCR动态监测胰岛细胞基因的变化。结果经XhoⅠ和SacⅡ双酶切后,重组质粒被切成5.3kb和2.4kb 2个片段,与理论预期长度相符;经pIRES2-ZsGreenl-SV40t和pIRES2-ZsGreenl转染的大鼠胰岛细胞在荧光显微镜下均可见绿色荧光,生存期延长;经pIRES2-ZsGreenl-SV40t转染的胰岛细胞,Rt-PCR及细胞免疫荧光证明整合有SV40t,ELISA及细胞免疫荧光证明基础胰岛素分泌及葡萄糖刺激胰岛素释放能力随着永生化细胞系传代逐渐减弱,软琼脂培养无克隆形成,染色体无异常变化,Rt-PCR证明永生化后的胰岛细胞随着时间推移出现了胰岛内分泌祖细胞的特异性基因Ngn3。结论成功构建了SV40t荧光真核表达载体,并可在大鼠胰岛细胞中表达;经pIRES2-ZsGreenl-SV40t转染的胰岛细胞生存期延长,但生理功能减弱,有向祖细胞逆转的趋势。

关键词：猿猴病毒40大t抗原胰岛细胞转染生物学特性

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血管瘤内皮细胞增殖机制的初步研究

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实用口腔医学杂志 2004年第3期20卷 290-294页

作者：代晓明李龙江温玉明王昌美刘华张义正邓尹琳成都四川大学生命科学院分子生物实验室 610065 四川大学华西口腔医学院口腔颌面外科四川大学华西医院病理科

目的 :探讨血管瘤内皮细胞活跃增生与猿猴病毒 40大t抗原、端粒酶活性表达及端粒长度变化的关系 ,明确血管瘤发病的相关机制。方法 :应用免疫组化、基于逆转录聚合酶链反应的端粒重复末端扩增分析法及端粒限制性片段分析化学发光、原位... 详细信息

目的 :探讨血管瘤内皮细胞活跃增生与猿猴病毒 40大t抗原、端粒酶活性表达及端粒长度变化的关系 ,明确血管瘤发病的相关机制。方法 :应用免疫组化、基于逆转录聚合酶链反应的端粒重复末端扩增分析法及端粒限制性片段分析化学发光、原位杂交法检测血管瘤、鳞状细胞癌、人胚肾内皮细胞的猿猴病毒 40大t抗原、端粒酶活性表达及端粒长度变化。结果 :5 4%和 45 %的血管瘤中分别检出端粒酶、猿猴病毒 40大t抗原的表达 ,猿猴病毒 40大t抗原阳性内皮细胞散在分布。血管瘤端粒长度位于 6.8～ 13 .2kb之间。结论 :猿猴病毒 40对血管内皮细胞的作用与血管瘤的发生有关 ;血管瘤端粒酶活性高于一般良性肿瘤。

关键词：血管瘤增生猿猴病毒40大t抗原端粒酶端粒长度

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