Pfu DNA聚合酶具有3'-5'外切酶的即时校正活性,可以在PCR途中即时地识别并切除错配核苷酸,正逐渐取代Taq DNA聚合酶,成为使用最广的PCR工具。随着新冠疫情的爆发,如何快速、准确的检测RNA病毒显得尤为重要。逆转录实时荧光定量PCR（RT-q PCR）是目前检测RNA病毒的金标,该方法需要将逆转录酶和Taq DNA聚合酶联合使用。由于目前使用的逆转录酶不耐高温,因此整个检测过程分为两部分,需要先在较低的温度进行逆转录,然后再升高温度进行PCR,如果待检测RNA具有高级结构还需要对样品进行预处理,操作繁琐、费时。为了解决这一问题,本研究对野生型Pfu DNA聚合酶进行理性设计,预测了16个突变位点,通过筛选获得了既能耐高温又兼具逆转录酶活性和DNA聚合酶活性的突变体Pfu-M12,并对Pfu-M12反应条件进行了探究。本论文研究内容主要包括以下几个方面:1、Pfu DNA聚合酶突变位点的设计:以KOD DNA聚合酶为模板对Pfu DNA聚合酶进行同源建模,通过对比RTX、KOD DNA聚合酶与建模后的Pfu DNA聚合酶的三维空间结构确定突变位点及突变氨基酸;2、Pfu DNA聚合酶突变体的表达纯化与筛选:将野生型的Pfu DNA聚合酶基因克隆至p ET-23a载体,先突变3个关键位置的氨基酸（K467R、F588L、W769R）,验证活性后,在此基础上每次再引入2-3个突变位点,验证活性后再迭代突变。最终获得Pfu DNA聚合酶突变体Pfu-M12;3、Pfu-M12反应条件优化:获得高纯度Pfu-M12突变体后,对反应温度、反应体系中各组分的最适浓度进行探究。实验结果表明,Pfu-M12逆转录最适条件为:68℃、10 m M Tris-HCl（p H 8.8）、2.5m M Mg Cl2、12 m M KCl、8 m M（NH4）2SO4;4、Pfu-M12单酶一步法RT-PCR:利用纯化的Pfu-M12,在优化的反应条件下以体外转录的RNA作为模板进行RT-PCR,实验结果表明,利用Pfu-M12可以省去额外的逆转录步骤,实现“一步法”RT-PCR。综上,本研究通过理性设计,获得了耐高温兼具逆转录酶活性的Pfu DNA聚合酶突变体Pfu-M12,并实现了单酶一步法RT-PCR,有望在本课题组前期建立的基于Pf Ago可编程核酸酶检测技术的基础上开发出能够实现快速、高灵敏检测RNA病毒的新技术。
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