检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：吴厚军江南大学

学位级别：硕士

脂肪酶是继蛋白酶和淀粉酶之后的第三大酶制剂，而根霉脂肪酶作为微生物脂肪酶的一种重要来源，因其高效的催化效率等特点，已有多种根霉脂肪酶制成商品化酶制剂，在食品、医药、化工及环保等多个行业表现出广阔的应用前景。华根霉脂肪... 详细信息

脂肪酶是继蛋白酶和淀粉酶之后的第三大酶制剂，而根霉脂肪酶作为微生物脂肪酶的一种重要来源，因其高效的催化效率等特点，已有多种根霉脂肪酶制成商品化酶制剂，在食品、医药、化工及环保等多个行业表现出广阔的应用前景。华根霉脂肪酶是本实验室具有自主知识产权的脂肪酶，前期在酶的稳定性和外源表达量等方面已经取得较好的研究成果，扩大了其工业应用范围。为了获得耐热性更高的华根霉脂肪酶，同时研究其蛋白结构与功能的关系，本文一方面通过理性设计的思路，运用定点突变方法提高华根霉脂肪酶的耐热性；另一方面在毕赤酵母表达系统中研究了华根霉脂肪酶前肽对脂肪酶折叠和分泌的影响，主要研究内容包括：（1）获得了耐热性提高的突变酶。通过同源建模和序列比较，运用重叠延伸PCR方法对华根霉脂肪酶基因proRCL进行定点突变，构建了突变脂肪酶D190V。毕赤酵母表达的突变酶D190V与野生型酶r27RCL相比，D190V的最适温度比r27RCL高5℃，65℃下的半衰期提高了一倍，Km值下降了23.3%。通过结构分析，定点突变D190V提高该酶稳定性的主要原因可能在于提高了突变位点所在的α螺旋的稳定性以及增强了稳定蛋白质结构的氢键作用力。（2）考察了脂肪酶前肽对脂肪酶体外折叠的辅助作用，比较了全长前肽的脂肪酶proRCLCNQ、携带截短前肽的脂肪酶r27RCLC和不含前肽的成熟肽脂肪酶mRCLC在28℃、4种GSH和GSSG浓度下的体外复性差异。不添加GSH和GSSG时，变性的脂肪酶可以自发折叠成活性的酶蛋白，而前肽有助于该过程的进行；当GSH/GSSG浓度比从0提高到2:1，复性6h的数据显示，proRCLCNQ、r27RCLC和mRCLC的复性率分别由13.6%、23.7%、8.7%提高至19.7%、74.5%、40.9%。复性率提高幅度由高到低顺序为：r27RCLC mRCLC proRCLCNQ，说明在不同氧化还原剂浓度下，r27RCLC上的截短前肽可以促进脂肪酶的自发折叠，而在较高还原剂浓度下proRCLCNQ上的全长前肽未能促进酶的折叠。前肽N端的1-67氨基酸对脂肪酶的折叠不是必需的，而68-94位氨基酸则对酶的折叠有明显的促进作用。（3）考察了前肽序列对脂肪酶表达分泌的影响，比较了不同截短前肽序列的proRCLC基因在毕赤酵母中表达分泌差异。华根霉脂肪酶前肽N端的1-16位氨基酸对酶蛋白的表达分泌不是必需的，截去后反而提高了目标蛋白的表达和分泌。截去1-67位氨基酸，脂肪酶不能表达。截去1-35或者1-47位氨基酸的结果相似，不仅影响细胞的生长、降低目标蛋白的表达量和胞外的分泌，还造成胞外的杂蛋白量明显增多。

关键词：华根霉脂肪酶理性设计耐热性前肽毕赤酵母

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理性设计提高硫酸乙酰肝素3-O-磺基转移酶催化活性的研究

理性设计提高硫酸乙酰肝素3-O-磺基转移酶催化活性的研究

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作者：王萱北京化工大学

学位级别：硕士

肝素类药物目前是临床常用的抗凝血药品,如何通过生物合成法高效的合成肝素类抗凝血药一直是人们所关注的问题。3-氧-磺基转移酶I(3-OST-1)是合成具有抗凝活性的硫酸乙酰肝素的必要工具酶,因而增加3-OST-1的酶表达量、提高3-OST-1的酶... 详细信息

肝素类药物目前是临床常用的抗凝血药品,如何通过生物合成法高效的合成肝素类抗凝血药一直是人们所关注的问题。3-氧-磺基转移酶I(3-OST-1)是合成具有抗凝活性的硫酸乙酰肝素的必要工具酶,因而增加3-OST-1的酶表达量、提高3-OST-1的酶活性且拓展其底物广谱性对于肝素类药物的生产与相关药物的研发具有深远意义。本课题采用理性设计策略,通过分子对接和突变能模拟计算的方法解析3-OST-1与底物之间的结合模式,设计出11种突变策略,通过大肠杆菌表达体系将3-OST-1重组蛋白野生型和突变株表达,成功表达出了可溶的有活性的3-OST-1重组蛋白野生型和突变株,并对表达产物进行了纯化及酶学活性的初步研究。经探究,3-OST-1重组蛋白的野生型和突变株在终浓度0.5 mM IPTG、16℃诱导20 h条件下适宜表达,之后进行纯化后的重组蛋白定量和酶活测定,发现3-OST-1重组蛋白突变株的酶量相比野生型提高2-4倍,酶的活性也提高了数十倍。综上,本研究成功构建出适宜3-OST-1的原核表达体系,并通过理性设计提高了3-OST-1的酶催化活性,对于提高肝素类药物生产效率及探究肝素生物合成方式具有重要意义。

关键词：硫酸乙酰肝素磺基转移酶 3-OST-1 表达理性设计

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基于理性设计的β-甘露聚糖酶底物亲和力的定向改造

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2014年第1期40卷 58-64页

作者：魏喜换王春娟赵梅李剑芳邬敏辰江南大学食品学院江苏无锡214122 江南大学无锡医学院江苏无锡214122

以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)为研究对象,对其底物亲和力的定向改造进行理性设计及定点突变以获取米氏常数Km值较低的突变酶AuMan5AY111F.首先采用同源建模和分子对接模拟等方法预测AuMan5A... 详细信息

以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)为研究对象,对其底物亲和力的定向改造进行理性设计及定点突变以获取米氏常数Km值较低的突变酶AuMan5AY111F.首先采用同源建模和分子对接模拟等方法预测AuMan5A与甘露二糖对接复合物的空间结构;在此结构上使用PyMol软件统计到距甘露二糖8以内的38个氨基酸位点.其次对不同来源的、与AuMan5A一级结构序列全同率大于50%的β-甘露聚糖酶进行多序列比对;排除21个保守氨基酸位点,依据17个非保守位点上的氨基酸性质及其所处空间位置,选择AuMan5A中的Tyr111、Phe206和Tyr243作为拟突变氨基酸,将它们分别替换为性质相似的或在其他β-甘露聚糖酶序列中出现频率高的氨基酸,形成一系列拟突变酶.最后采用MM-PBSA法计算AuMan5A及其拟突变酶与甘露二糖的结合自由能(ΔGbind),其中AuMan5AY111F的ΔGbind为-237.7kJ/mol,较其他酶的ΔGbind均低.基于该理性设计采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Tyr111的密码子TAC突变为编码Phe111的TTC,构建出突变酶基因(Auman5AY111F).分别将Auman5AY111F和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,并对重组表达产物reAuMan5AY111F和reAuMan5A进行分离纯化和动力学常数测定.结果表明:reAuMan5AY111F对瓜尔豆胶的Km值由突变前的3.9mg/mL降低为2.5mg/mL;而突变前后酶的Vmax值变化不大.该研究运用多种生物信息学软件对提高AuMan5A底物亲和力进行了理性设计,并通过定点突变证实之,这为β-甘露聚糖酶乃至其他各种酶底物亲和力的定向改造提供了新的技术策略.

关键词： β-甘露聚糖酶底物亲和力定向改造理性设计定点突变

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基于靶标结构理性设计的替拉那韦

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药学学报 2017年第7期52卷 1196-1202页

作者：郭宗儒中国医学科学院北京协和医学院药物研究所北京100050

新药创制是复杂的智力活动,涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效果等多维科技活动。每个药物都有自身的研发轨迹,而构建化学结构是最重要的环节,因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。本栏目以药物化学视角,对有代... 详细信息

新药创制是复杂的智力活动,涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效果等多维科技活动。每个药物都有自身的研发轨迹,而构建化学结构是最重要的环节,因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。本栏目以药物化学视角,对有代表性的药物的成功构建,加以剖析和解读。药物与靶标分子的相互作用是药效的原动力,基于靶标的三维结构"量体裁衣"式的设计新药,应是最理性的方法。靶标分子的柔性构象与不同化合物结合的多样性是基于结构的药物设计(SBDD)的难点之一。分子量较小的HIV蛋白酶是对称的二聚体,容易获得复合物单晶,所以在由香豆素演化成最终的替拉那韦的历程中,在多个节点处解析了复合物结构,辅助了设计。即使这样,还有许多需要探索的未知内容,因而,应用药物化学的原理和策略,不断驱动着SBDD的进程。替拉那韦的研制特点在于由苗头过渡到先导物乃至先导物优化,SBDD+药物化学方法贯穿于全过程。

关键词：拉那药物化学新药创制化合物结构理性设计技术创造医疗效果药物设计智力活动先导物

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理性设计特异性肽配基对猪心t-PA的亲和色谱纯化

理性设计特异性肽配基对猪心t-PA的亲和色谱纯化

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作者：王涛天津大学

学位级别：硕士

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是一种具有广阔应用价值和经济价值的蛋白质。本文利用理性设计得到的t-PA特异性肽配基QDES对猪心组织中的t-PA进行了亲和色谱纯化。通过碳二亚胺反应将四肽配基QDES固定在商品介质EAH Sepharose 4B上制备出... 详细信息

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是一种具有广阔应用价值和经济价值的蛋白质。本文利用理性设计得到的t-PA特异性肽配基QDES对猪心组织中的t-PA进行了亲和色谱纯化。通过碳二亚胺反应将四肽配基QDES固定在商品介质EAH Sepharose 4B上制备出了配基固定化密度为5μmol/ml的亲和吸附介质,并利用亲和色谱柱考察了其吸附蛋白质特性。通过对不同蛋白质(α-淀粉酶、溶菌酶、胰岛素)的亲和吸附实验发现α-淀粉酶和溶菌酶与亲和柱都不存在特异性亲和吸附而胰岛素与亲和柱却存在较高的亲和吸附作用。由于胰岛素与t-PA具有相似的亲和位点,因此认为固定化四肽配基亲和色谱对t-PA也存在特异性亲和吸附作用。为了考察固定化四肽亲和柱对t-PA的亲和纯化效果,利用新鲜猪心组织制备了丙酮粉,并经过两次交替抽提和盐析后,获得了t-PA粗提液。用Bradford法测定了粗提液中蛋白质的含量,用纤维蛋白板溶圈法测定了粗提液中的t-PA活性,计算得出:1kg猪心组织中可得丙酮粉159g;经抽提、盐析后获得的t-PA粗提液的质量收率为35.12mg/100g丙酮粉;粗提液中t-PA比活性为34037 IU/mg。利用亲和柱对t-PA粗提液进行了亲和色谱分离。通过电泳检测发现,经一步亲和纯化后产品中t-PA纯度即可达91%,比活为278110IU/mg,纯化了8倍,计算其收率为1.3mg t-PA/kg猪心。对吸附的t-PA进行不同条件下的洗脱后发现,t-PA与亲和介质的吸附主要是由t-PA与配基间的静电作用引起的,疏水作用贡献很小。同时,不同pH值下的吸附结果也证实了静电作用是亲和吸附中的主要因素。这一结论与理性设计所得结果相一致。通过上述结果证明,利用理性设计的特异性亲和肽配基能够快捷、有效的从猪心组织中分离纯化t-PA。

关键词： t-PA 理性设计亲和配基分离纯化

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理性设计结合固定化提高CALB的热稳定性

理性设计结合固定化提高CALB的热稳定性

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作者：温露文江南大学

学位级别：硕士

南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B,CALB）是具有α/β水解酶折叠的丝氨酸水解酶。因其出色的催化性能,在食品、化工、能源等行业具有广泛的应用。然而野生型CALB较差的热稳定性使其在实际的生产应用中受到限制。为提高... 详细信息

南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B,CALB）是具有α/β水解酶折叠的丝氨酸水解酶。因其出色的催化性能,在食品、化工、能源等行业具有广泛的应用。然而野生型CALB较差的热稳定性使其在实际的生产应用中受到限制。为提高CALB的热稳定性,拓展CALB在工业中的应用,本论文采用理性设计结合固定化策略改造CALB,成功提高了CALB的热稳定性。此外,通过补料分批发酵,成功提高了CALB于毕赤酵母中的表达量。具体包括:（1）根据软件PoPMuSiC和FoldX计算各个位点突变后自由能的变化,以及氨基酸残基的空间位置,选择CALB潜在的热稳定性突变位点。经实验验证,突变位点A146G、A151P和L278M均能有效提高CALB的热稳定性。将这3个点突变进行组合后,组合突变体的热稳定性得到了进一步的提高,其中A146G-L278M在50°C的半衰期t1/2为6.28 h,是野生型的1.35倍,Tm值提高了3.3°C,最适反应温度为50°C,比野生型提高了5°C,比活为野生型的2倍,动力学参数测定表明其在酯合成反应中对己酸的催化效率kcat/Km是野生型的4.1倍。（2）将软件MODIP和BridgeD预测的二硫键T180C-A240C引入突变体A146G-L278M,获得突变体CALB-4X。CALB-4X在50°C的半衰期t1/2为121 h,是野生型的26倍,Tm值提高了4.0°C,最适反应温度比野生型提高了5°C,动力学参数测定表明其在酯合成反应中对己酸的催化效率kcat/Km是野生型的3.8倍,抑制常数Ki表明乙醇对野生型具有更强的抑制作用。（3）解析耐热突变体热稳定性提高的机制。通过分子动力学模拟分析,可知突变体A146G-L278M和CALB-4X蛋白质分子整体的RMSD变化幅度低于野生型,表明突变后蛋白分子主链Cα原子的偏移幅度有所下降,蛋白结构具有更好的稳定性。突变体和野生型的RMSF总体上相差不大,表明突变并未对CALB的整体结构造成太大的影响。（4）采用介孔氧化硅材料固定化突变体CALB-4X,每1 g材料的蛋白负载量可达到98.8 mg,固定化产率为47%,酶活力回收率达到80%。固定化酶MCFs-C8-CALB-4X在50°C下的半衰期为481 h,分别是游离酶CALB-4X和野生型的4倍和103倍。相比游离酶,固定化酶在60°C下酶活更高。此外,固定化酶具有良好的重复使用性,连续使用6次后,仍能保留77%的酶活。（5）采用补料分批发酵提高耐热突变体在毕赤酵母中的表达量。在3 L发酵罐中,突变菌株GS115-calb-A146G-L278M和CALB-4X的发酵酶活分别可达到582和542U·mL-1,分别是野生型的2.5和2.4倍,胞外蛋白量分别可达到2.4和2.5 mg·mL-1。

关键词：南极假丝酵母脂肪酶B 热稳定性理性设计酶学性质固定化

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理性设计的探索 ——gmp事务所创作思想在中国的实践

理性设计的探索 ——gmp事务所创作思想在中国的实践

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作者：周静西安建筑科技大学

学位级别：硕士

在当今这个纷繁复杂的时代里，多元化建筑思潮广泛的影响着当代的建筑创作，改变着人们的生活方式和审美标准。理性主义创作思想被建筑师广泛应用于当代建筑创作中，并在其不断发展中表现出一种全新的理性主义特征。作为当今欧洲最著名... 详细信息

在当今这个纷繁复杂的时代里，多元化建筑思潮广泛的影响着当代的建筑创作，改变着人们的生活方式和审美标准。理性主义创作思想被建筑师广泛应用于当代建筑创作中，并在其不断发展中表现出一种全新的理性主义特征。作为当今欧洲最著名的建筑师事务所之一，gmp继承了包豪斯以来现代主义尤其是理性主义的设计原则和风格，并对其作出了一定的修正与完善，从而发展了一种严谨、有序的设计逻辑，以及具有浪漫色彩的新理性主义建筑风格，在建筑界正越来越引人注目。在中国十五年实践中，他们创作了大量优秀的建筑作品。笔者通过直接或者间接的研究与访问，求证了它的创作思想与设计手法。通过对其在中国建筑作品的实地调研及多层次分析，从形式、功能、结构与技术等方面，全方位地展现了其理性的建筑特质。本文首先通过对理性主义设计思想的发展分析，力求对其理论思想和发展脉络有一定清晰而明确的认识。在此基础之上，对拥有理性思想的gmp建筑师事务所的创作思想、建筑作品的分析、研究与阐述，尤其是它对于城市与建筑的独特理解，从中发现有助于中国建筑学习和发展的内容，进一步提高我国建筑创作理论和实践水平，对指导未来建筑创作有所裨益，进而达到研究的最终目的。

关键词：理性设计 gmp 创作思想建筑实践

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理性设计提高低温α-淀粉酶稳定性的研究

理性设计提高低温α-淀粉酶稳定性的研究

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作者：闫亚茹河北农业大学

学位级别：硕士

与中温和高温淀粉酶相比,低温淀粉酶在低温环境下有较高的催化活力,这一特性赋予了低温淀粉酶极大的应用潜力。因为在低温环境下进行催化反应易于保持食品的营养价值和风味,而且还可以节约能源和减少环境污染等。然而来源于自然界的野... 详细信息

与中温和高温淀粉酶相比,低温淀粉酶在低温环境下有较高的催化活力,这一特性赋予了低温淀粉酶极大的应用潜力。因为在低温环境下进行催化反应易于保持食品的营养价值和风味,而且还可以节约能源和减少环境污染等。然而来源于自然界的野生型低温淀粉酶大部分稳定性都不好,这一特性限制了其在工业中的生产和实际应用。与它工业用酶相比,国内外对提高低温淀粉酶稳定性的研究相对较少。因此,本研究将来源于假交替单胞菌（Alteromonas haloplanktis）的低温淀粉酶AHA成功在大肠杆菌中进行了异源表达并且利用两种理性设计策略提高了AHA的热稳定性。第一个策略是利用PoPMusic在线软件对低温淀粉酶AHA进行理性设计。通过去除基因中的保守位点和活性中心周围5埃以内的氨基酸,最终选择了8个对蛋白质去折叠自由能影响显著的突变体,经过初步的酶活力筛选和Tm值测定,最后得到2个热稳定性提高的突变体:N124P和A413G。这2个突变体的最适反应温度和pH与野生型相比均没有发生变化（最适温度30℃,最适pH7.0）,然而单点突变体N124P和A413G的Tm值与野生型相比分别提升了1.02和1.85°C。此外,N124P和A413G在40℃下保温80分钟后的残余酶活与野生型的残余酶活相比分别提升了28%和113%左右。第二个策略是利用分子动力学模拟和FoldX能量计算的理性设计方法。通过对蛋白质进行分子模拟和虚拟筛选,预测出10个热稳定性可能会有所改善的突变体。经过初步的酶活筛选和Tm值测定,最终得到了2个热稳定性显著提高的正突变体:S255K和S340P。这2个突变体的最适反应温度和pH与野生型相同。然而它们的Tm值分别比野生型提高了1.52和3.38°C。此外,S255K和S340P在40℃下保温80分钟后的残余酶活与野生型相比分别提高了60%和140%。最后,我们把通过上述两种策略得到的4个单点突变体进行组合突变,得到了4个组合突变体S255K/S340P,S340P/A413G,S255K/S340P/A413G和N124P/S255K/S340P/A413G,其中热稳定性最好的是3点组合突变体:S255K/S340P/A413G。它的Tm值较野生型提升了6.38℃,同时在40℃下保温80分钟后的残余酶活与野生型的残余酶活相比提高了184%,并且它的最适反应温度和最适反应pH也没有发生任何变化。本研究利用两种分子改良的方法对低温α-淀粉酶AHA进行理性设计,最终得到了4个热稳定性提高的单点突变体和4个热稳定性提高的多点突变体。然而这8个热稳定性提高突变体的最适反应条件与野生型相同。这些研究结果表明通过对蛋白质进行理性设计可以在不影响其最适反应条件的基础上改善其稳定性,为蛋白质的理性设计的发展提供借鉴,同时也为低温淀粉酶的工业化应用奠定了基础。

关键词：低温α-淀粉酶AHA 热稳定性定点突变理性设计

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理性设计提高假交替单胞菌κ-卡拉胶酶耐碱性的研究

理性设计提高假交替单胞菌κ-卡拉胶酶耐碱性的研究

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作者：胡青松集美大学

学位级别：硕士

κ-卡拉胶的工业生产过程产生大量碱性κ-卡拉胶工业废渣,对其进行填埋会造成严重环境污染和资源浪费。κ-卡拉胶酶属于糖苷水解酶,通过作用κ-卡拉胶的β-1,4糖苷键将其降解成一系列偶数聚合度的寡糖。利用κ-卡拉胶酶对废渣中卡拉胶... 详细信息

κ-卡拉胶的工业生产过程产生大量碱性κ-卡拉胶工业废渣,对其进行填埋会造成严重环境污染和资源浪费。κ-卡拉胶酶属于糖苷水解酶,通过作用κ-卡拉胶的β-1,4糖苷键将其降解成一系列偶数聚合度的寡糖。利用κ-卡拉胶酶对废渣中卡拉胶多糖水解回收κ-卡拉胶寡糖和助滤剂是废渣资源化利用的有效途径。已知的κ-卡拉胶酶耐碱性达不到工业应用要求,制约废渣的有效利用。假交替单胞菌JMUZ2来源的κ-卡拉胶酶具有良好的催化活性,但酶的耐碱性不高。本论文通过理性设计的方法对假交替单胞菌κ-卡拉胶酶进行耐碱性改良,提高酶在碱性环境下的应用性能,不仅为κ-卡拉胶工业废渣的资源化利用奠定酶学基础,而且促进酶结构与耐碱性和催化活性的构效关系研究。论文的主要研究内容及结果如下:（1）基于表面电荷优化筛选和鉴定κ-卡拉胶酶耐碱性改良单点突变体。使用SWISS-MODEL在线服务器对κ-卡拉胶酶蛋白质序列进行同源建模,并评估模型的可靠性。通过GH16家族κ-卡拉胶酶蛋白质序列比对分析,并计算氨基酸残基的溶剂可及表面积,绘制该家族κ-卡拉胶酶表面残基序列谱图。选择κ-卡拉胶酶表面非保守的氨基酸残基进行突变,将酸性氨基酸突变为中性或碱性氨基酸,将中性氨基酸突变为碱性氨基酸,结合突变体能量计算,理性设计并构建8个单点突变体。突变体的酶活性和耐碱性分析结果显示,突变体D50N的酶活力比野生型（WT）提高25.4%,突变体E237R和D243N与WT酶活性无显著差异。突变体E237R在pH 10.0和pH 11.0条件下25℃处理30 min,残余酶活力比WT分别提高了14.2%和16.0%,说明E237R的耐碱性提高。在pH 8.0和pH 9.0条件下25℃处理30 min,突变体D50N的残余酶活力比WT分别提高了14.8%和10.6%,突变体D243N也分别提高了14.4%和8.7%,说明D50N和D243N的耐碱性也有所提高。突变没有改变酶的最适反应pH和最适反应温度。动力学参数分析显示,D50N、E237R和D243N的Km值降低,表明突变体与底物的亲和力提高。LC-MS分析显示,WT和上述三个突变体酶解κ-卡拉胶的终产物均为κ-卡拉胶二糖和四糖,说明突变对酶解产物的组成没有影响。（2）组合突变对κ-卡拉胶酶耐碱性的改良。将D50N、E237R和D243N进行组合,构建组合突变体D50N/E237R、D50N/D243N、E237R/D243N和D50N/E237R/D243N,突变体的酶活性和耐碱性分析显示,相较于WT,突变体D50N/D243N具有89.1%的相对酶活力,其他组合突变体酶活力下降较显著。在pH 9.0和pH 10.0条件下25℃处理30 min,D50N/D243N的残余酶活力分别比WT提高了6.2%和11.8%,说明D50N/D243N的耐碱性提高,但是没有表现出比单点突变体E237R更好的耐碱性。利用分子动力学模拟分析组合突变对酶结构稳定性的影响,发现点突变对距离较远残基的柔性存在影响,且突变点E237R与其他突变点存在非加和效应,同时组合突变体D50N/D243N也未表现出单点突变对结构影响的叠加状态,D50N/D243N与E237R的残基波动状态类似。（3）κ-卡拉胶酶耐碱性提高突变体的结构分析。荧光光谱分析发现,D50N、E237R、D243N和D50N/D243N突变体的荧光团残基疏水微环境和表面疏水性与WT相比无明显改变。利用TKSA-MC在线服务器计算κ-卡拉胶酶带电残基的相互作用,发现在pH 10.0条件下,第50位的天冬酰胺突变和237位的精氨酸突变,他们的ΔGqq值显著降低,有利于其自身结构的稳定性。利用Ring-2.0在线服务器分析κ-卡拉胶酶的残基相互作用网络,发现突变体D50N和E237R并未改变残基网络的作用方式,将243位的天冬氨酸突变为天冬酰胺有利于其与残基K229形成新的范德华力。分子对接结果显示,相较于WT,突变体D50N的对接自由能降低,分子动力学模拟显示,在有底物存在时,突变体D50N活性口袋区域残基的柔性增加,这暗示着其与底物的亲和力增加,有利于催化反应。利用恒pH下分子动力学模拟研究κ-卡拉胶酶在pH 10.0碱性环境下的结构变化,结果显示,相较于WT,突变体E237R在碱性环境下保持自身残基的灵活性,自由能曲线也说明E237R有适应碱性环境的能力。

关键词： κ-卡拉胶酶理性设计耐碱性分子动力学模拟

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试析遵守问题与国际制度的理性设计

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天津社会科学 2008年第1期 62-65页

作者：唐颖侠南开大学法学院

国际制度的理性设计是国际关系理论的前沿问题,对于国际法的遵守问题的研究直接启发了国际制度的理性设计理论,并为国际制度的设计提供了重要的政策导向。同时,对遵守问题的研究,也有助于重塑国际法的基础理论,因此,西方学者对于国际法... 详细信息

国际制度的理性设计是国际关系理论的前沿问题,对于国际法的遵守问题的研究直接启发了国际制度的理性设计理论,并为国际制度的设计提供了重要的政策导向。同时,对遵守问题的研究,也有助于重塑国际法的基础理论,因此,西方学者对于国际法的遵守问题的关注,代表着新兴的国际法与国际关系理论交叉学科新的发展动向。

关键词：遵守理性设计国际法国际关系理论交叉学科

来源：评论

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