检索结果-内蒙古大学图书馆

水产学报 2020年第2期44卷 321-337页

作者：叶欢危起伟徐冬冬岳华梅竹内裕阮瑞杜浩李创举中国水产科学研究院长江水产研究所农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室浙江省海洋水产研究所浙江省海水增养殖重点实验室金沢大学生命理工学院

生殖细胞移植是指将供体的生殖细胞移植到同种或异种受体体内,供体生殖细胞嵌合到受体性腺,经过增殖、分化并最终发育为功能性配子的过程。作为辅助生殖技术,它不仅为珍稀濒危动物的繁育和保护提供了新途径,同时也为生殖干细胞的功能研... 详细信息

生殖细胞移植是指将供体的生殖细胞移植到同种或异种受体体内,供体生殖细胞嵌合到受体性腺,经过增殖、分化并最终发育为功能性配子的过程。作为辅助生殖技术,它不仅为珍稀濒危动物的繁育和保护提供了新途径,同时也为生殖干细胞的功能研究提供了有效手段。鱼类生殖细胞移植研究首先在模式鱼类斑马鱼中开展,经过十多年的发展,取得了一系列突破性的进展:主要包括先后建立了以胚胎、仔鱼和成鱼为受体的生殖细胞移植体系,精原和卵原干细胞的发现拓宽了供体生殖细胞的选择,受体的选择与制备方法的完善。该技术在缩短鱼类性成熟周期、性控育种、珍稀濒危鱼类保护等方面具有巨大的应用前景,已成功在多种淡水和海水鱼类中开展了研究和应用。本文结合作者的研究实践和经验,系统地梳理和总结了鱼类生殖细胞移植的研究进展,指出了该技术实践应用的关键问题,并探讨了其应用前景。

关键词：鱼类生殖细胞移植种质资源冷冻保存

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达氏鲟种内和种间生殖细胞移植研究

达氏鲟种内和种间生殖细胞移植研究

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作者：叶欢中国科学院水生生物研究所

学位级别：博士

由于人类活动的影响，中华鲟和达氏鲟的生存环境急剧恶化，物种处于极度濒危状态。鲟鱼繁殖生物学和生活史特征导致它们的自然种群恢复极为缓慢。尽管已突破中华鲟全人工繁殖技术，但亲鱼培育面临着较多问题，如初次性成熟时间长且雌雄... 详细信息

由于人类活动的影响，中华鲟和达氏鲟的生存环境急剧恶化，物种处于极度濒危状态。鲟鱼繁殖生物学和生活史特征导致它们的自然种群恢复极为缓慢。尽管已突破中华鲟全人工繁殖技术，但亲鱼培育面临着较多问题，如初次性成熟时间长且雌雄成熟不同步、繁殖周期长等。然而，达氏鲟规模化全人工繁殖已实现，但通过增殖放流来恢复其野生种群的方法效果有限。因此，有必要开发新技术和方法来加强中华鲟和达氏鲟种质资源与遗传多样性的保护。经过十多年的发展，鱼类生殖细胞移植技术已成功应用到多种鱼类，在缩短鱼类性成熟时间、种质资源保存、增殖放流和物种恢复方面具有重大的应用潜力。本论文主要围绕达氏鲟种内和种间生殖细胞移植技术体系建立来开展工作，涉及移植受体、生殖细胞标记基因鉴定、供体细胞制备、细胞移植及嵌合体发育检测。在平均水温为19.1℃下，达氏鲟胚胎历时108 h开始出膜，所需总积温为2056.4-2265.4℃·h。根据其胚胎发育形态特征，划分为7个阶段：合子、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官形成和出膜，并简单描述了每个时期的主要形态特征。通过组织切片发现，出膜后第28天，达氏鲟仔鱼生殖嵴形成；出膜后第78天，发生性别分化，但生殖细胞尚未开始增殖；在543和728日龄，雌性和雄性生殖细胞分别已发生有丝分裂，大量增殖；在728和1155日龄，雌性和雄性生殖细胞分别已发生减数分裂。据此推断，达氏鲟仔鱼作为移植受体的最佳时期在出膜后第28天之前，雌性和雄性达氏鲟作为供体的最佳年龄分别为543和728日龄左右。鉴定了达氏鲟vasa基因（Advasa）的7个亚型，分别从RNA和蛋白质水平揭示其表达模式，发现Advasa主要在精巢和卵巢中表达，但两性存在着差异。在卵巢中，Advasa mRNA和蛋白质在处于有丝和减数分裂时期的生殖细胞中表达，且细胞质和细胞核中都有表达；而在精巢中，Advasa主要在处于有丝分裂时期的生殖细胞的细胞质中表达。通过显微注射人工合成的融合红色荧光蛋白编码区（RFP）和Advasa 3′ 非编码区（UTR）mRNA 到达氏鲟、斑马鱼和青鳉的受精卵中，发现Advasa 3′ UTR能够标记达氏鲟和斑马鱼原始生殖细胞（PGCs），但不能够标记青鳉PGCs。该结果表明，达氏鲟和骨鳔鱼类vasa 3′ UTR RNA定位机制可能相同，而在真真骨鱼类与骨鳔鱼类发生分化的过程中，该机制也发生了变化。此外，解析了达氏鲟PGCs迁移模式，即直到胚胎发育至神经管闭合期，PGCs才出现在尾部原基后方；随后，经卵黄球运动到躯干后部两侧；最后，通过间质作用运动到生殖嵴形成的位置。这为后续对达氏鲟生殖细胞的操作提供必要的基础资料。选取2龄雄性达氏鲟和11.5龄雌性中华鲟作为生殖细胞移植供体，性腺组织切片的免疫组化结果表明，2龄达氏鲟精巢主要含有A型精原细胞，而11.5龄中华鲟卵巢主要含有卵黄形成前的卵母细胞和极少数卵原细胞。将达氏鲟精巢和中华鲟卵巢用蛋白酶（Trypsin与 Collagenase H）消化，获得的细胞经PKH26染色后，注射到出膜后第7-8天达氏鲟仔鱼腹腔。在移植后第2和51天，受体的成活率分别在90%和70%以上。在移植后第51天，经激光共聚焦显微镜观察发现，带PKH26标记的供体细胞嵌合到受体达氏鲟幼鱼性腺，且这些细胞的细胞核在形态和大小方面具有与相应供体达氏鲟精原细胞或中华鲟卵原细胞相同的特征。同种精巢生殖细胞移植（Group 1）的嵌合率为70%，而另外两组异种卵巢生殖细胞移植（Group 2和Group 3）的嵌合率分别为6.7%和40%。在Group 1、Group 2和Group 3中，嵌合到受体性腺的生殖细胞数目相对达氏鲟幼鱼性腺中内源生殖细胞数目的比例分别为11.96%、5.35%和3.56%。因此，本研究成功建立了达氏鲟种内和种间生殖细胞移植体系。将多来源的达氏鲟生殖细胞移植到同一个受体，可有效恢复该物种的遗传多样性；同时，将中华鲟生殖细胞移植到受体达氏鲟，可实现异种生殖，从而缩短中华鲟初次性成熟时间，为中华鲟的物种延续提供新的途径。

关键词：达氏鲟中华鲟性腺 vasa 生殖细胞移植

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石首鱼类的生殖细胞移植研究

石首鱼类的生殖细胞移植研究

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2018年中国水产学会水产生物技术专业委员会第九届学术研讨会暨水产生物技术与绿色发展学术研讨会

作者：徐冬冬 Takeuchi Yutaka 浙江省海洋水产研究所浙江省海水增养殖重点实验室舟山 Tokyo University of Marine Science and Technology TokyoJapan Kagoshima Tokyo University of Marine Science and Technology TokyoJapan Kagoshima University KagoshimaJapan

鱼类生殖细胞移植是将供体(donor)的外源生殖细胞移植到受体中，利用受体生产供体的配子，繁育供体的后代，也被形象的称为"借腹生子"或代孕亲鱼(surrogate broodstock)技术。该技术在缩短鱼类性成熟周期，性控育种(全雌/雄... 详细信息

鱼类生殖细胞移植是将供体(donor)的外源生殖细胞移植到受体中，利用受体生产供体的配子，繁育供体的后代，也被形象的称为"借腹生子"或代孕亲鱼(surrogate broodstock)技术。该技术在缩短鱼类性成熟周期，性控育种(全雌/雄鱼的制备)、濒危物种保护和基因资源保存等方面都具有巨大的应用前景。本研究利用石首鱼科的两种鱼类黄姑鱼(Nibea mitsukurii)和银姑鱼(Pennahia argentata)进行杂交，其杂交子代的性腺不育，通过组织切片、原位杂交等方法分析发现由于原始生殖细胞不能进行正常有丝分裂从而导致性腺不育。

关键词：石首鱼类黄姑鱼生殖细胞移植杂交不育

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石首鱼类的生殖细胞移植研究

石首鱼类的生殖细胞移植研究

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第五届中国大黄鱼产业发展论坛

作者：徐冬冬 Takeuchi Yutaka 浙江省海洋水产研究所浙江省海水增养殖重点实验室舟山 Tokyo University of Marine Science and Technology Tokyo Japan Kagoshim Tokyo University of Marine Science and Technology Tokyo Japan Kagoshima University Kagoshima Jap

鱼类生殖细胞移植是将供体(donor)的外源生殖细胞移植到受体中，利用受体生产供体的配子，繁育供体的后代，也被形象的称为“借腹生子”或代孕亲鱼(surrogate broodstock)技术。该技术在缩短鱼类性成熟周期，性控育种(全雌/雄鱼的制备)... 详细信息

鱼类生殖细胞移植是将供体(donor)的外源生殖细胞移植到受体中，利用受体生产供体的配子，繁育供体的后代，也被形象的称为“借腹生子”或代孕亲鱼(surrogate broodstock)技术。该技术在缩短鱼类性成熟周期，性控育种(全雌/雄鱼的制备)、濒危物种保护和基因资源保存等方面都具有巨大的应用前景。本研究利用石首鱼科的两种鱼类黄姑鱼(Nibea mitsukurii)和银姑鱼(Pennahia argentata)进行杂交，其杂交子代的性腺不育，通过组织切片、原位杂交等方法分析发现由于原始生殖细胞不能进行正常有丝分裂从而导致性腺不育。利用杂交鱼作为受体，将日本黄姑鱼(Argyrosomus japonicus)的精原细胞移植到杂交仔稚鱼中，经过1 1个月的培育，能够产生日本黄姑鱼的功能性精子。本研究首次利用杂交不育构建了海水鱼类的亲鱼代孕系统，对于石首鱼类的生殖细胞移植研究与应用具有重要意义。

关键词：石首鱼类黄姑鱼生殖细胞移植杂交不育

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生殖细胞的移植

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第四军医大学吉林军医学院学报（86813X） 2003年第3期25卷 166-169页

作者：石明娟王龙生陕西医学高等专科学校组织学与胚胎学教研室，陕西西安710068 西安交通大学组织学与胚胎学教研室，陕西西安7l0061

生殖细胞移植恢复了生精干细胞向精子的发生，1994年最初的生殖细胞移植开始了对精子发生机理基本方面的探索，结合生殖细胞培养、冻存，生殖细胞移植开创了基因工程和家畜生产的新途径。另外，自身精原细胞的移植使男性肿瘤患者保存受... 详细信息

生殖细胞移植恢复了生精干细胞向精子的发生，1994年最初的生殖细胞移植开始了对精子发生机理基本方面的探索，结合生殖细胞培养、冻存，生殖细胞移植开创了基因工程和家畜生产的新途径。另外，自身精原细胞的移植使男性肿瘤患者保存受精能力的研究又向前迈进了一步。本综述总结了生殖细胞移植的历史和现状，展望了精原干细胞研究的前景。

关键词：生殖细胞移植精子发生机理基因工程精原干细胞

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光唇鱼生殖干细胞提取、冻存及移植的研究

光唇鱼生殖干细胞提取、冻存及移植的研究

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作者：李文雅宁波大学

学位级别：硕士

光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)属于我国溪流性特色经济鱼类,主要产于浙江、江苏、福建等地。近年来,由于生存环境的破坏和过度的捕捞导致光唇鱼种质资源逐渐衰退。因此对光唇鱼进行种质资源保护显得尤为重要。光唇鱼雌鱼较雄鱼具有... 详细信息

光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)属于我国溪流性特色经济鱼类,主要产于浙江、江苏、福建等地。近年来,由于生存环境的破坏和过度的捕捞导致光唇鱼种质资源逐渐衰退。因此对光唇鱼进行种质资源保护显得尤为重要。光唇鱼雌鱼较雄鱼具有更高的经济价值,实现全雌繁育可以提高光唇鱼养殖的经济效益。本研究目的是完成光唇鱼生殖干细胞的提取、生殖干细胞冻存及移植,此技术的成功可以推进光唇鱼种质资源的保护和全雌繁育的进程。研究中将光唇鱼性腺利用不同的消化酶体系和不同的消化时间进行条件优化;性腺冻存中选用不同浓度的抗冻剂及不同的降温方式对冻存条件进行优化;利用显微注射技术将光唇鱼生殖干细胞移植进入斑马鱼仔鱼腹腔内,通过荧光显微镜观察和绝对荧光定量确定移植是否成功。研究结果如下:(1)利用不同的消化酶体系及不同消化时间进行性腺消化,获得最适消化体系为:L-15(细胞培养基):1%胶原酶:0.05%DNA酶Ⅰ:0.25%胰酶:胎牛血清=850μL:30μL:50μL:50μL:20μL,最佳消化时间3小时,以此条件获得的精原细胞和卵原细胞的数目分别为(16.5±0.50)×10～5个/μL和(12.7±0.70)×10～5个/μL。(2)性腺冻存中采用程序降温法,分别选用了不同比例的二甲基亚砜、乙二醇、甲醇为冻存剂,比较性腺复苏后生殖干细胞的存活率确定10%二甲基亚砜为最适冻存剂,复苏后的光唇鱼卵原细胞和精原细胞存活率分别为(42.20±1.02)%和(28.22±2.14)%。(3)消化分离的生殖干细胞悬液经过PKH26荧光染料标记后,移入刚出膜2-3日的斑马鱼仔鱼腹腔内。移植后1-5日实验组仔鱼腹腔内可见明显荧光信号,移植后第1日荧光散布在整个腹腔,第3日荧光向背侧集中,第5日荧光聚集在腹腔后端背侧;对照组仔鱼1-5日腹腔中均无荧光信号,第7日则因色素细胞发育而出现自发荧光;移植组仔鱼第7日腹腔后端背侧也有荧光、但无法与自发荧光相区别。基于光唇鱼ND5线粒体基因特异序列设计引物,光唇鱼组织DNA利用引物扩增后构建质粒标准品,梯度稀释后经绝对荧光定量PCR绘出标准曲线。将移植后的斑马鱼DNA利用ND5基因特异性引物进行荧光定量PCR,通过Ct值计算拷贝数,移植后1日、3日、5日、7日的拷贝数平均值分别为:28355±99copies/100 ng,28372±104 copies/100 ng,23210±871 copies/100 ng,17494±582 copies/100 ng,第7日拷贝数显著减少、为第1日的61.7%。荧光观察和定量检测结果显示光唇鱼生殖干细胞被成功移入斑马鱼仔鱼腹腔。综上所述,本实验中通过各种条件优化后获得光唇鱼生殖干细胞提取和冻存的方法,利用生殖细胞移植技术,将光唇鱼生殖干细胞成功地移入斑马鱼仔鱼腹腔内,结果证明了光唇鱼生殖干细胞提取、冻存、移植的可行性,也为光唇鱼种质资源保护和全雌繁育研究奠定了基础。

关键词：光唇鱼生殖干细胞细胞冻存生殖细胞移植绝对荧光定量PCR

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白消安及其与高温联合处理对黄姑鱼(Nibea albiflora)性腺发育的影响

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海洋与湖沼 2021年第6期52卷 1465-1473页

作者：杨磊胡伟华俞燕洁陈睿毅徐冬冬浙江海洋大学水产学院舟山316022 浙江省海洋水产研究所舟山316021 浙江省海水增养殖重点实验室舟山316021

黄姑鱼(Nibea albiflora)的性成熟周期短,养殖技术成熟,是合适的生殖细胞移植受体。不育受体的制备在鱼类生殖细胞移植中非常关键。为了优化不育黄姑鱼的制备方法,采用白消安和白消安-高温(30℃)对黄姑鱼进行处理,设置5个组:对照组(Con... 详细信息

黄姑鱼(Nibea albiflora)的性成熟周期短,养殖技术成熟,是合适的生殖细胞移植受体。不育受体的制备在鱼类生殖细胞移植中非常关键。为了优化不育黄姑鱼的制备方法,采用白消安和白消安-高温(30℃)对黄姑鱼进行处理,设置5个组:对照组(Con组)、白消安10 mg/kg组(Bu10组)、白消安40 mg/kg组(Bu40组)、白消安10 mg/kg高温组(Bu10H组)、白消安40 mg/kg高温组(Bu40H组),白消安以不同剂量进行2次的腹腔注射,间隔两周。采用组织学、qPCR以及原位杂交等方法分析白消安及其与高温联合处理对黄姑鱼性腺及其生殖细胞和体细胞发育的影响。研究结果表明白消安处理对黄姑鱼生殖细胞的影响具有明显的性别差异:雄鱼在处理28 d后其性腺重和GSI较对照组显著下降,进一步组织学观察发现雄鱼精巢在处理14 d时已经出现空腔,qPCR分析发现雄鱼vasa基因表达在处理期间显著降低,且在处理第48 d仍处于下调状态。然而,白消安及其与高温联合处理并未对雌鱼生殖细胞产生明显的影响。研究还发现高温处理组出现较高的死亡率,但雄鱼生殖细胞的消除效果并未显著增强。因此,白消安处理能够消除黄姑鱼雄鱼性腺内的生殖细胞,以40 mg/kg白消安2次(间隔两周)注射后消除效果最好,能够作为生殖细胞移植受体鱼。

关键词：黄姑鱼(Nibea albiflora) 白消安生殖细胞移植 vasa 原位杂交

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哺乳动物精子诱导相关技术研究进展

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基因组学与应用生物学 2016年第2期35卷 334-341页

作者：李孟琪白琳李婷婷罗奥林陆阳清卢晟盛杨小淦卢克焕广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530004 广西大学动物繁殖与动物生物技术重点实验室南宁530004

正常的精子形成是雄性哺乳动物维持正常生育能力的重要保障。近年来,随着对精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)研究的不断深入,与干细胞特性密切相关的精子发生和精子诱导的许多不同技术方法也引起了人们的关注。精子形成是一... 详细信息

正常的精子形成是雄性哺乳动物维持正常生育能力的重要保障。近年来,随着对精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)研究的不断深入,与干细胞特性密切相关的精子发生和精子诱导的许多不同技术方法也引起了人们的关注。精子形成是一个复杂的过程,是SSCs进入分化途径后发生的许多复杂的生物学变化的过程,最终获得单倍体配子。诱导精子技术是研究动物生殖生理学特性的重要技术。本研究讨论了近年来各个国家和地区的研究者所做的关于哺乳动物精子诱导的不同的技术方法。这些方法将对哺乳动物遗传育种与繁殖学的研究给予协助,对男性不育症的诊疗提供帮助。

关键词：精子诱导组织培养异种移植生殖细胞移植

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白消安及其与高温联合处理对黄姑鱼性腺发育的影响

白消安及其与高温联合处理对黄姑鱼性腺发育的影响

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作者：杨磊浙江海洋大学

学位级别：硕士

黄姑鱼(Nibea albiflora)是我国沿海重要的经济养殖鱼类,具有性成熟周期短、养殖技术成熟等优点,可以作为鱼类生殖细胞移植的受体。在鱼类生殖细胞移植中,由于受体内源的生殖细胞与供体生殖细胞存在竞争,不育受体的制备至关重要。为了... 详细信息

黄姑鱼(Nibea albiflora)是我国沿海重要的经济养殖鱼类,具有性成熟周期短、养殖技术成熟等优点,可以作为鱼类生殖细胞移植的受体。在鱼类生殖细胞移植中,由于受体内源的生殖细胞与供体生殖细胞存在竞争,不育受体的制备至关重要。为了制备不育受体,本研究系统分析了白消安和高温处理对黄姑鱼生长、性腺发育、生殖细胞和体细胞基因表达等影响。本研究设计不同剂量白消安(10 mg/kg、40 mg/kg)及高温(30℃)处理黄姑鱼,实验分为5组:对照组;白消安10 mg/kg组(Bu10组);白消安40 mg/kg组(Bu40组);白消安10 mg/kg高温处理组(Bu10H组);白消安40 mg/kg高温处理组,(Bu40H组)。白消安以不同剂量在第0和14天进行两次的腹腔注射。主要研究结果如下:1.首先发现白消安和高温处理对各组雌雄黄姑鱼的生长性能没有显著影响,但对性腺发育的影响具有明显的性别差异:各组雄鱼的性腺重和性腺成熟指数(GSI)较对照组显著降低(P<0.05),但各组雌鱼的性腺重和GSI没有显著差异(P<0.05)。并且,Bu10组和Bu40组基本没有死亡,而Bu10H组和Bu40H组的存活率较低,表明高温-白消安联合处理对黄姑鱼的存活率有较大影响。2.在实验过程的第14天、28天、38天、48天进行取样,通过组织学分析白消安和白消安-高温联合处理对性腺发育过程的影响。结果发现:雄鱼在白消安注射后第14天出现生殖细胞凋亡,精巢内出现空腔,且高浓度处理组(Bu40组)较低浓度处理组的消除生殖细胞的效果明显,表现一定的浓度效应;白消安-高温的联合处理对雄鱼的生殖细胞并没有表现出累积效果;雌鱼卵巢并未受白消安和高温处理的影响,再次证明白消安处理对黄姑鱼生殖细胞的影响具有性别差异。3.进一步采用荧光定量PCR和原位杂交分析了生殖细胞(vasa)和体细胞标记基因(雄:dmrt1;雌cyp19a)表达的影响,荧光定量结果显示雄性黄姑鱼在白消安注射后第14天、第28天时,性腺内vasa基因表达与对照组相比受到明显抑制,且处理浓度越大受抑制程度越高,而高温会增强抑制效果,但差异并不显著;在处理第38天(恢复10天)、第48天(恢复20天)时,各组雄鱼性腺内的vasa基因表达与对照组相比仍明显被抑制。而各组雌鱼的vasa基因表达与对照组相比则无显著差异。雄鱼性腺内dmrt1基因和雌鱼cyp19a基因表达与对照组相比无显著变化。对vasa进行原位杂交分析,结果显示vasa基因主要在生殖细胞表达,对照组雄鱼vasa基因表达正常,主要在精子、精母细胞内表达,而Bu10、Bu40组、Bu40H组的信号较弱,进一步证明白消安处理导致生殖细胞凋亡。而各组雌鱼vasa基因表达正常,主要表达于卵母细胞的细胞质内。对cyp19a基因进行原位杂交分析,发现对照组和各处理组均有cyp19a基因信号存在,且信号存在于生殖细胞及周围的体细胞内。综上,白消安处理造成黄姑鱼雄鱼精巢内生殖细胞凋亡,其生殖细胞基因表达受到抑制,但对雌鱼生殖细胞及其相关基因则无显著影响。对于雌雄鱼而言,白消安处理不会影响其体细胞相关基因表达。高温处理会强化白消安对生殖细胞的消除效果,但容易造成较高的死亡率而不宜在实际生产使用。通过上述实验结果的优化,本研究认为采用40 mg/kg浓度两次间隔注射白消安能够制备不育黄姑鱼。

关键词：白消安黄姑鱼性腺发育 vasa 原位杂交生殖细胞移植

来源：评论

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尼罗罗非鱼白血病抑制因子(lif)cDNA的分离鉴定、可溶性表达及其生物学活性

尼罗罗非鱼白血病抑制因子(lif)cDNA的分离鉴定、可溶性表达及其...

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作者：周宇杰西南大学

学位级别：硕士

白血病抑制因子Lif (Leukemia inhibitory factor)最早于1988年在小鼠KrebsⅡ腹水瘤细胞条件培养液中分离纯化,因其能诱导白血病细胞株M1细胞向正常细胞分化而得名,它是白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)亚家族的重要成员。哺乳动物的... 详细信息

白血病抑制因子Lif (Leukemia inhibitory factor)最早于1988年在小鼠KrebsⅡ腹水瘤细胞条件培养液中分离纯化,因其能诱导白血病细胞株M1细胞向正常细胞分化而得名,它是白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)亚家族的重要成员。哺乳动物的大量研究显示,Lif具有广泛的生物学功能,在神经元的存活、形成与修复、血细胞生成、激素产生、胚胎发育等方面均具有重要作用。近年来,Lif被大量应用于临床及科研,具有极大的市场需求量。在临床上Lif被用于预防癌症病人化疗引起的神经病变、促进不孕妇女移植胚胎的着床等,在科研中被广泛应用于神经干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞等的体外培养,是维持其未分化状态的必需因子,占干细胞体外培养成本的90%以上。因此,如何能够大量获得具有生物学活性的Lif显得尤为必要。目前,Lif的重组表达主要问题是表达量低,原核表达主要以包涵体形式,难以获得具有生物学活性的蛋白。低等脊椎动物硬骨鱼类是否存在哺乳类Lif的同源分子,其功能如何,尚待研究。本研究以罗非鱼(在本研究中,如未特殊说明,用于实验研究的罗非鱼均指尼罗罗非鱼)Oreochromis niloticus))为实验对象,分离、鉴定lif的cDNA序列,并通过半定量RT-PCR方法检测其在胚胎发育及不同组织中的表达模式；构建pET22、pET28a及pSUMO (small ubiquitin-related modifier)原核表达载体,获得可溶状态的纯化蛋白ntLif32-221,并对其生物学功能进行初步研究。另一方面,鱼类性腺细胞由体细胞与生殖细胞组成,其中体细胞包括卵巢的颗粒细胞、鞘膜细胞、间质细胞,及精巢的Sertoli细胞、Leydig细胞等,自世界上首株鱼类细胞系即虹鳟(Oncorhynchus mykiss)性腺细胞系RTG-2建立以来,目前仅在少数鱼类如青鳉、牙鲆、南方鲇等建立了性腺的细胞系。罗非鱼是研究鱼类性别决定与分化的良好动物模型,其性腺细胞系的建立将为生殖细胞增殖与分化、相关功能基因研究等提供有力手段。迄今,尚未见罗非鱼性腺来源细胞系建立的相关报道。基于此,本研究还开展了罗非鱼精巢、卵巢体细胞与生殖细胞体外培养条件及其生殖细胞移植的初步探索。主要研究结果如下：1.罗非鱼白血病抑制因子(ntlif)cDNA的分离鉴定、可溶性表达及其生物学活性1.1通过生物信息学分析与RT-PCR方法相结合,从罗非鱼克隆白血病抑制因子cDNA序列,结果显示：ntlif由3个外显子组成,cDNA全长1067 bp,其中5’端UTR 153bp,3’端UTR 248bp,ORF 666 bp,编码221个氨基酸,第1-31位为信号肽序列,具有两个链内二硫键,两个N-糖基化位点,与哺乳类结构特征类似；系统进化分析表明,ntlif为哺乳类Lif/Osm的直系同源基因；氨基酸多重序列分析表明,罗非鱼Lif与鱼类的氨基酸一致性达35.5%以上,而与哺乳动物Lif的氨基酸一致度仅约为18.0%,保守性较低,lif基因存在种属特异性。ntLif蛋白理论分子量为21.294 KDa,等电点为8.83。1.2通过RT-PCR检测结果显示,从受精后12 h至第5天均有lif较高水平的表达,提示ntLi呵能在罗非鱼胚胎发育的整个过程中发挥生物学效应。与此同时,ntLif广泛表达于成年鱼不同组织,其中心脏、脾脏、肠、肌肉表达水平较高。1.3成功构建了罗非鱼除信号肽第1-31位氨基酸的Lif32-221原核重组表达载体***28a及pSUMO,将其转化大肠杆菌*** BL21(DE3),通过不同浓度IPTG.不同温度、不同时间诱导,SDS-PAGE及Western-blot检测,结果显示,pSUMO-ntLif32-221转化阳性菌经O.2 mM IPTG 16℃诱导20 h,可获得重组蛋白 His6-SUMO-Lif32-221最大可溶性表达,特异性条带对应分子量约37 kD与理论值相符；经Ni柱亲和层析及ULP1酶解,获得了去His6-SUMO的纯化蛋白ntLif32-221,特异性条带对应分子量约25 kD与理论值相符,产量约10 mg/L。1.4通过FACS、CCK8法检测纯化蛋白ntLif32-221对青鳉胚胎干细胞(MES1)增殖活性的影响,结果显示,纯化蛋白ntLif32-221可促进MES1的增殖。2罗非鱼性腺细胞培养及生殖细胞移植2.1取3月龄罗非鱼精巢、卵巢组织经胶原蛋白酶Ⅳ及胰蛋白酶-EDTA消化,于28℃进行培养,结果发现,罗非鱼性腺细胞在L-15条件培养基中生长状态良好,其成分为：含15%胎牛血清(FBS)、25mM Hepes、1%非必需氨基酸、0.5mMβ-巯基乙醇、白血病抑制因子(LiD

关键词：罗非鱼白血病抑制因子可溶性表达细胞增殖生殖细胞移植

来源：评论

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