检索结果-内蒙古大学图书馆

中华微生物学和免疫学杂志 2012年第2期32卷 152-156页

作者：蒋锦琴孙一帆岳文燕严杰阮萍浙江医学高等专科学校基础医学部杭州310053 浙江大学医学院病原生物学系绍兴文理学院医学院医学检验系 312000

目的构建甲型副伤寒沙门菌spaO—ompA融合基因及其原核表达系统，确定重组表达产物rSpaO—OmpA免疫保护作用。方法采用柔性肽序列连接spaO与ompA基因，构建spaO-ompA人工融合基因及其原核表达系统。采用SDS-PAGE和Bio—Rad凝胶图像分析... 详细信息

目的构建甲型副伤寒沙门菌spaO—ompA融合基因及其原核表达系统，确定重组表达产物rSpaO—OmpA免疫保护作用。方法采用柔性肽序列连接spaO与ompA基因，构建spaO-ompA人工融合基因及其原核表达系统。采用SDS-PAGE和Bio—Rad凝胶图像分析系统检测目的重组表达产物rSpaO—OmpA表达情况及其产量。采用免疫扩散法、微量肥达和Westernblot法鉴定rSpaO—OmpA抗原性和免疫反应性。采用小鼠感染模型了解rSpaO—OmpA对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的免疫保护作用，实验中采用重组表达的SpaO（rSpaO）及OmpA（rOmpA）作为对照。结果所构建的spaO-ompA融合基因与spaO或ompA单基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。所构建的原核表达系统EcoliBk21DE3pET42a-spaO-ompA能高效表达重组融合蛋白rSpaO-OmpA。rSpaO-OmpA能与甲型副伤寒沙门菌全菌抗血清结合并产生阳性杂交信号，免疫家兔后可产生特异性抗体。100汕g或2006xgrSpaO—OmpA对甲型副伤寒沙门菌感染小鼠的免疫保护率分别为66．7％（8／12）和83．3％（10／12），明显高于等量rSpaO及rOmpA（P〈0．05）。rSpaO—OmpA免疫小鼠血清与不同副伤寒沙门菌H抗原的凝集效价为1：5～1：40、与rSpaO和rOmpA及rSpaO—OmpA免疫双扩散效价为1：1～1：16。结论人工融合重组抗原rSpaO—OmpA免疫原性和免疫保护作用较等量rSpaO或rOmpA更强。

关键词：甲型副伤寒沙门菌 spaO—ompA融合基因重组表达免疫原性免疫保护性

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甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白的分离、纯化和鉴定

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中华微生物学和免疫学杂志 2005年第7期25卷 599-603页

作者：胡明冬徐剑铖周长喜冯英凯龚传明毛宝龄第三军医大学新桥医院呼吸研究所重庆400037

目的提纯甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白并鉴定。方法选用甲型副伤寒沙门菌,经自制的液体培养基扩大培养后,酸裂解法初步分离出鞭毛蛋白,用AKTAExplorer蛋白纯化系统除盐,弱阴离子交换层析纯化。纯化的蛋白用SDS-PAGE、Westernblot和磷钨酸... 详细信息

目的提纯甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白并鉴定。方法选用甲型副伤寒沙门菌,经自制的液体培养基扩大培养后,酸裂解法初步分离出鞭毛蛋白,用AKTAExplorer蛋白纯化系统除盐,弱阴离子交换层析纯化。纯化的蛋白用SDS-PAGE、Westernblot和磷钨酸负染扫描电子显微镜(scanningelectronmicrocopy,SEM)观察并摄片鉴定。考马斯亮蓝法测定所获得鞭毛蛋白的产量。结果SDS-PAGE提示纯化的鞭毛蛋白为一条相对分子质量(Mr)为52×103蛋白带;免疫印迹试验亦提示条带在Mr52×103处;SEM观察发现该鞭毛蛋白呈丝状;三者均证实该蛋白为同一均质蛋白。蛋白定量测得每克湿重的细菌可提取(4.8±0.5)mg鞭毛蛋白。结论经酸裂解法可获得高产量的鞭毛蛋白,且易于纯化和鉴定。

关键词：甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白鉴定 AKTA Explorer蛋白纯化系统沙门菌鞭毛蛋白蛋白纯化 SDS-PAGE Western 扫描电子显微镜

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甲型副伤寒沙门菌特异性基因筛选及PCR检测体系建立

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食品科学 2018年第2期39卷 151-157页

作者：翟立公王俊颖张小雨孟欣崔葆赵婉晴牛萍安徽科技学院食品药品学院安徽滁州233100

以甲型副伤寒沙门菌为检测目标,通过比较基因组和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证方法筛选到4个该血清型的特异性基因,其中以gene_3105作为该血清型的检测靶点设计引物PA23;并结合沙门菌属特异性引物139-141,建立一... 详细信息

以甲型副伤寒沙门菌为检测目标,通过比较基因组和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证方法筛选到4个该血清型的特异性基因,其中以gene_3105作为该血清型的检测靶点设计引物PA23;并结合沙门菌属特异性引物139-141,建立一种甲型副伤寒沙门菌的PCR检测方法。优化PCR反应体系,并对该检测体系的特异性、灵敏度、抗干扰能力及人工污染样品检出限等方面进行评价。结果表明,当样品中含有甲型副伤寒沙门菌时,该体系能扩增出2条特异性条带,含有其他血清型的沙门菌仅能扩增出284 bp条带,不含沙门菌无扩增条带产生。灵敏度评价表明,基因组DNA和纯菌菌落检出限分别为32.4 pg/μL和4.3×10~3 CFU/m L;抗干扰能力实验显示,当鸡肉背景菌群和猪肉背景菌群浓度在10~6 CFU/m L和4.87×10~7 CFU/m L时,检出限为6.43×10~4 CFU/m L。当无菌的鸡肉和猪肉样品中添加N CFU/25 g甲型副伤寒沙门菌时,经10 h增菌,检测结果为阳性(0甲型副伤寒沙门菌PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏度,有很好的应用价值,可在食品安全领域广泛应用。

关键词：甲型副伤寒沙门菌比较基因组血清型特异性基因聚合酶链式反应

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甲型副伤寒沙门菌h1a-spaO融合基因构建及其表达产物免疫保护作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2014年第9期34卷 702-706页

作者：金蕾蒋锦琴方佳琪林旭瑷严杰孙爱华浙江大学医学院病原生物学系杭州310058 浙江医学高等专科学校基础医学部杭州310053

目的：构建甲型副伤寒沙门菌h1a-spaO融合基因及其原核表达系统，确定重组表达产物rH1a-SpaO免疫保护作用。方法采用柔性肽序列连接引物PCR构建并扩增h1a与spaO基因的融合基因h1a-spaO，T-A克隆后测序。采用常规基因工程方法构建h1a-spa... 详细信息

目的：构建甲型副伤寒沙门菌h1a-spaO融合基因及其原核表达系统，确定重组表达产物rH1a-SpaO免疫保护作用。方法采用柔性肽序列连接引物PCR构建并扩增h1a与spaO基因的融合基因h1a-spaO，T-A克隆后测序。采用常规基因工程方法构建h1a-spaO融合基因原核表达系统，SDS-PAGE检测其rH1a-SpaO表达情况。采用Westernblot鉴定rH1a-SpaO抗原性和免疫反应性，微量肥达试验确定rH1a-SpaO抗血清凝集甲型副伤寒沙门菌的能力。采用小鼠感染模型了解rH1a-SpaO对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的保护作用并与等量单一重组表达蛋白H1a（rH1a）及SpaO（rSpaO）比较。结果所构建的h1a-spaO融合基因与单一h1a或spaO基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。h1a-spaO融合基因原核表达系统能高效表达rH1a-SpaO。rH1a-SpaO能与rH1a或rSpaO抗血清结合，rH1a-SpaO抗血清也能识别rH1a和rSpaO并经H抗原凝集甲型副伤寒沙门菌。100μgrH1a-SpaO对甲型副伤寒沙门菌感染小鼠的免疫保护率（93．3％）明显高于等量rH1a（60．0％）及rSpaO（53．3％）（P＜0．05）。结论重组融合蛋白抗原rH1a-SpaO免疫保护作用较等量单一rH1a或rSpaO更强，可作为甲型副伤寒两价基因工程疫苗或伤寒/副伤寒荚膜多糖-蛋白结合疫苗的有效抗原。

关键词：甲型副伤寒沙门菌 h1a-spaO融合基因重组表达免疫原性免疫保护性

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甲型副伤寒沙门菌外膜BtuB蛋白的原核表达、纯化及其免疫保护性

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中国生物制品学杂志 2012年第6期25卷 672-675页

作者：王斌李娜董晓宇梁昊宇陈翠萍陈薇曾明军事医学科学院微生物与流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的原核表达、纯化甲型副伤寒沙门菌外膜BtuB蛋白,并检测其免疫原性和免疫保护性。方法采用PCR从甲型副伤寒沙门菌(CMCC 50973)基因组DNA中扩增btuB基因,插入原核表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋... 详细信息

目的原核表达、纯化甲型副伤寒沙门菌外膜BtuB蛋白,并检测其免疫原性和免疫保护性。方法采用PCR从甲型副伤寒沙门菌(CMCC 50973)基因组DNA中扩增btuB基因,插入原核表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经分子筛和亲和层析纯化后,免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中抗BtuB IgG抗体效价,并用最小绝对致死剂量活菌攻毒,计算小鼠的保护率。结果重组原核表达质粒pET-30a-btuB经双酶切和测序证实构建正确;重组蛋白的相对分子质量约为67 000,表达量约为菌体总蛋白的25%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度大于90%,可与鼠抗His-Tag单抗特异性结合;纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠可获得高效价的抗BtuB IgG抗体,且可获得60%的保护率。结论成功原核表达并纯化了甲型副伤寒沙门菌外膜BtuB蛋白,重组蛋白免疫原性良好,并能够为小鼠提供一定的保护作用。

关键词：甲型副伤寒沙门菌细菌外膜蛋白质类 BtuB蛋白原核细胞基因表达免疫原性免疫保护性

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甲型副伤寒沙门菌减毒株的构建与鉴定

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免疫学杂志 2015年第1期31卷 27-31页

作者：熊坤陈志瑾李建华朱春岳丛延广饶贤才第三军医大学基础部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038 第三军医大学基础部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室学员旅16营重庆400038 第三军医大学基础部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室学员旅4营重庆400038

目的构建甲型副伤寒沙门菌减毒株,测试其减毒效果,为制备减毒疫苗奠定基础。方法利用同源重组技术敲除甲型副伤寒沙门菌CMCC50093株的ync D基因和aro C基因,构建出ync D单基因敲除株和ync D-aro C双基因敲除菌株;通过测定和比较野生株、... 详细信息

目的构建甲型副伤寒沙门菌减毒株,测试其减毒效果,为制备减毒疫苗奠定基础。方法利用同源重组技术敲除甲型副伤寒沙门菌CMCC50093株的ync D基因和aro C基因,构建出ync D单基因敲除株和ync D-aro C双基因敲除菌株;通过测定和比较野生株、ync D单基因敲除株及ync D-aro C双基因敲除株的生长曲线,评估基因敲除对细菌生长的影响;以猪胃黏蛋白增毒小鼠为模型,测定野生株和双基因敲除株对模型动物的半数致死量LD50,评价双基因敲除株的减毒效果。结果成功构建并筛选到ync D单基因及ync D-aro C双基因敲除的甲型副伤寒沙门菌突变菌株。生长曲线测定显示ync D基因和aro C基因敲除后,敲除株生长明显缓慢。野生株和双基因敲除株针对模型小鼠的LD50分别为7.90×101和3.33×106CFU,结果表明ync D-aro C双敲除菌株的毒力较野生株下降约42 202倍,具有显著的减毒效果。结论本研究所构建的甲型副伤寒沙门菌ync D-aro C双基因敲除突变株毒力明显降低,安全性好,为研制甲型副伤寒减毒活疫苗奠定了坚实基础。

关键词：甲型副伤寒沙门菌减毒疫苗基因敲除同源重组

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甲型副伤寒沙门菌ompN基因原核表达系统构建及其产物免疫保护作用

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中国人兽共患病学报 2015年第8期31卷 709-713页

作者：金蕾孙爱华胡玮琳葛玉梅林旭瑷浙江大学医学院病原生物学系杭州310058 浙江医学高等专科学校基础医学部杭州310053

目的了解甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白ompN基因携带率及其重组表达产物抗原性和免疫保护作用。方法采用PCR扩增甲型副伤寒沙门菌参考标准株50001及126株临床菌株ompN基因并测序。构建ompN基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提取目的重组蛋... 详细信息

目的了解甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白ompN基因携带率及其重组表达产物抗原性和免疫保护作用。方法采用PCR扩增甲型副伤寒沙门菌参考标准株50001及126株临床菌株ompN基因并测序。构建ompN基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提取目的重组蛋白rOmpN。采用家兔免疫法和ELISA检测rOmpN免疫原性。微量肥达试验和激光共聚焦显微镜法分别检测OmpN在甲型副伤寒沙门菌株中表达率及其膜定位。采用小鼠感染模型了解rOmpN对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的免疫保护作用。结果所有甲型副伤寒沙门菌株中均扩增出全长ompN基因片段,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达98.6%~99.9%和98.7%~100%。OmpN是甲型副伤寒沙门菌跨膜蛋白。ompN基因表达系统能表达rOmpN,免疫家兔后能产生高效价抗血清。98.2%（55/56）甲型副伤寒病人血清标本中rOmpN-IgG阳性,rOmpN兔抗血清能有效凝集甲型副伤寒沙门菌。100和200μg rOmpN对感染小鼠的免疫保护率分别为60.0%（9/15）和73.3%（11/15）。结论甲型副伤寒沙门菌ompN基因分布广泛且序列保守,rOmpN有较强的抗原性和免疫保护作用。

关键词：甲型副伤寒沙门菌 ompN基因重组表达抗原性免疫保护性

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甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体的制备及其初步应用

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中国生物制品学杂志 2017年第6期30卷 628-632页

作者：梁昊宇董思国曾明王斌中国食品药品检定研究院肠道细菌疫苗室卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的制备甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体,并对其进行鉴定及初步应用。方法用甲醛灭活的甲型副伤寒沙门菌免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选出稳定分泌甲型副伤寒沙门菌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对克隆纯... 详细信息

目的制备甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体,并对其进行鉴定及初步应用。方法用甲醛灭活的甲型副伤寒沙门菌免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选出稳定分泌甲型副伤寒沙门菌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对克隆纯化后的阳性细胞扩大培养后,免疫BALB/c小鼠,收获腹水,间接ELISA法检测抗体效价,并进行Ig类和亚类鉴定;腹水经辛酸-硫酸铵盐析法纯化后,采用间接ELISA法、玻片凝集试验、SDSPAGE法、免疫扩散试验进行检测。将纯化后的2株单克隆抗体用于双抗体夹心ELISA法的建立,并用自制配对抗体检测甲型副伤寒患者血浆、乙型副伤寒患者血浆、伤寒患者血浆和正常人血浆。结果共筛选出2株持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1H4和2A9,腹水抗体效价为1∶10~7和1∶10~6,分别为IgG_1和Ig G_3亚类,轻链均为κ型。纯化后的单克隆抗体1H4、2A9效价分别为1∶10~7和1∶10~3,1H4纯度大于85%,2A9纯度小于60%。2株单克隆抗体与甲型副伤寒沙门菌50503、50973可产生凝集反应,与伤寒沙门菌50096不产生反应;1H4在稀释度为1∶8时可与甲型副伤寒沙门菌菌体特异多糖(organism specific polysaccharide,OSP)产生凝集反应,而2A9在每个稀释度与OSP均不发生反应。将1H4和2A9用于双抗体夹心ELISA检测法建立,确定1H4/HRP-2A9的组合为最佳配对,用该配对抗体检测阳性样本检出率为100%,正常人血浆样本检出率为0。结论获得2株甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体,可用于甲型副伤寒沙门菌的快速鉴定。

关键词：甲型副伤寒沙门菌单克隆抗体 Sp2/0骨髓瘤细胞脾细胞

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甲型副伤寒沙门菌CMCC 50973的基因表达谱及外膜蛋白BtuB的保护性研究

甲型副伤寒沙门菌CMCC 50973的基因表达谱及外膜蛋白BtuB的保护性...

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作者：王斌中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：博士

甲型副伤寒沙门菌（SalmonellaParatyphiA，SPA）是甲型副伤寒（paratyphoidfeverA）的病原菌，通过粪－口途径传播，感染剂量为103～109个菌，能够引起伤寒样临床症状。人是唯一宿主。人群对甲型副伤寒沙门菌普遍易感，但儿童和青壮年... 详细信息

甲型副伤寒沙门菌（SalmonellaParatyphiA，SPA）是甲型副伤寒（paratyphoidfeverA）的病原菌，通过粪－口途径传播，感染剂量为103～109个菌，能够引起伤寒样临床症状。人是唯一宿主。人群对甲型副伤寒沙门菌普遍易感，但儿童和青壮年发病最高。近些年来，在世界范围内，伤寒发病率有所降低，而甲型副伤寒发病率有明显升高。在我国，甲型副伤寒的发病率也相对较高，并在局部地区有爆发或流行。目前，旧的甲型副伤寒灭活疫苗由于副反应太大，已停止使用，尚无新的有效疫苗预防甲型副伤寒。因此对甲型副伤寒沙门菌的研究也越来越引起肠道致病菌领域学者的重视。当前分子生物学、基因组学、蛋白组学、生物信息学等快速发展的学科为疫苗的研发提供了革命性手段。通过对基因组信息的分析，筛选候选蛋白质抗原的方法被称为反向疫苗学（reversevaccinology），包括以下主要步骤：在获取病原体的基因组序列后，芯片分析预测编码分泌蛋白、表面相关抗原和毒力因子；蛋白质组学分析膜相关的蛋白；DNA微阵列鉴定高度表达的基因和体内上调的基因；从中综合分析可能的蛋白质抗原，将它们高通量克隆并表达；进行体内或体外免疫学实验分析，筛选有效的候选疫苗。可见，基因组序列和生物信息学分析的快速发展使基因注释不再是限定了总蛋白数和根据预测的功能分成几个组，而是预测细菌的可能全部蛋白在细胞中定位和功能等的信息。此外，蛋白质组学的发展也对疫苗研究起着积极的促进作用。蛋白质组学技术是对基因组学技术的补充，也是疫苗发展的有力技术支撑。综合基因组学、生物信息学、DNA微阵列和蛋白质组学技术，可以对存在于病原体的不同成分给予充分详细的定性、定量测定，对研发亚单位疫苗有很大的帮助。本研究所使用的甲型副伤寒沙门菌CMCC50973，是一株经筛选的毒力较强的地方流行株，计划用于甲型副伤寒亚单位疫苗的研究。为了全面了解其遗传信息，我们提取了细菌的基因组DNA，委托深圳华大公司测定了CMCC50973的全基因组序列。最终得到1个Scaffold环，全长为4,608,196bp，GC%为52.24%。预测基因4618个，tRNA100种，rRNA7种,sRNA56种。利用KEGG、COG、SwissProt、TrEMBL和NR数据库为基因进行了注释。CMCC50973的基因组通过与已完成测序的甲型副伤寒沙门菌ATCC9150的参考序列NC006511进行比较，一共找到了143个SNP位点，其中：在基因区的有112个；在基因间区的有31个，共找到12个InDel位点，其中插入位点6个，删除位点6个。该菌全基因组序列的获得，为进一步探寻基因间相互作用、新的调控因子等微生物更详尽的遗传学和生物学信息、预测和筛选新的更特异的保护性抗原基因，并在此基础上发展高效疫苗或经过遗传学操作改造疫苗菌株、构建活疫苗以及发展基因工程菌载体等打下了基础。表达蛋白质组学的研究是蛋白质组学研究的基础内容。建立起细胞在正常生理条件下的蛋白质参考图谱和数据库，首先能对细菌的蛋白质表达规律有整体的认识，为细菌的研究提供确切、宝贵的数据资料；其次能为后续的功能比较研究，如比较分析在变化了的条件下，蛋白质表达量的变化、翻译后的加工修饰、蛋白质在亚细胞水平上的改变等，提供很好的基础，从而发现和鉴定出特定功能的蛋白及其基因；第三是可以发现和解决一些生物学问题，如找到新的疫苗靶位，也为将来进行病原性研究、疫苗研制（免疫反应性抗原筛选）等相关工作提供重要的参考。因此，我们由地方流行株中筛选出来的毒力较强的菌株CMCC50973，进行了全菌蛋白表达谱的研究。本试验利用pH4.0-5.0、pH4.5-5.5、pH5.0-6.0、pH5.5-6.7的窄梯度胶条和pH6-11的碱性胶条，对CMCC50973对数生长末期的全菌体蛋白进行了双向电泳分离，然后对考马斯亮兰胶上可见的蛋白点取点进行胶内酶切，用MALDI-TOF/TOF-MS鉴定。共取蛋白点848个，鉴定到705个蛋白质点，代表519个基因编码产物，有多个蛋白点鉴定为同一基因产物的现象。所鉴定蛋白通过试验计算得出的分子量和等电点，与基因组注释中的预测值比较一致，但也有一些蛋白质理论值与计算值间存在一些差异。所鉴定蛋白质中多数功能是和能量代谢、营养素的运输和代谢相关；主要出现在糖酵解途径、三羧酸循环、磷酸戊糖途径、嘌呤和嘧啶的代谢等代谢通路中。在试验中鉴定到的67个蛋白被注释为“假想蛋白”（hypotheticalprotein），功能尚不明确。CMCC50973的全菌蛋白质组图谱的获得，帮助我们从整体层面了解了该菌基因组的蛋白表达信息，为研究细菌的致病机理和宿主特异性、基因组的表达情况、寻找新的疫苗靶位、以及免疫反应性抗原筛选等相关工作提供了基础。

关键词：甲型副伤寒沙门菌基因组学蛋白质组学疫苗外膜蛋白 BtuB蛋白

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甲型副伤寒沙门菌噬菌体LSPA1启动子筛选方法的建立

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郑州大学学报（医学版） 2015年第6期50卷 745-749页

作者：曾韦锟毛普加洪愉冯梦蝶许泽仰宋武战杨洪文赵继华王纪爱黄芬井申荣昆明学院医学院临床检验教研室昆明650214 昆明理工大学医学院病原微生物学实验室昆明650500 成都军区昆明总医院核医学科昆明650532

目的:通过构建p CAT3启动子陷阱载体筛选甲型副伤寒沙门菌噬菌体LSPA1启动子。方法:PCR无义突变去除p CAT2载体骨架上CalⅠ酶切位点,并在CAT片段的5’端引入CalⅠ的酶切位点,构建启动子陷阱载体p CAT3。TaqⅠ酶切噬菌体LSPA1基因组,插入... 详细信息

目的:通过构建p CAT3启动子陷阱载体筛选甲型副伤寒沙门菌噬菌体LSPA1启动子。方法:PCR无义突变去除p CAT2载体骨架上CalⅠ酶切位点,并在CAT片段的5’端引入CalⅠ的酶切位点,构建启动子陷阱载体p CAT3。TaqⅠ酶切噬菌体LSPA1基因组,插入p CAT3载体中,转化至大肠杆菌DH5α,通过氯霉素抗性平板筛选获得噬菌体LSPA1基因文库菌;随机挑取1株提取质粒,测序及比对分析插入序列;根据分析结果设计引物,扩增可能的启动子序列,并插入验证载体p-3lysm-egfp,转化DH5α,荧光显微镜观察。结果:成功构建p CAT3启动子陷阱载体,获得约100启动子文库菌,其中1株文库菌质粒中随机插入片段可能对应噬菌体LSPA1的ORF4启动子;插入待验证DNA片段的p-3lysm-egfp载体重组菌在荧光显微镜下能见到明显绿色荧光。结论:该启动子文库可有效筛选噬菌体LSPA1启动子,为进一步深入研究噬菌体LSPA1提供帮助。

关键词：甲型副伤寒沙门菌噬菌体启动子

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