检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：孙闽文江南大学

学位级别：硕士

甲基对硫磷（Methyl parathion,MP）是一类使用较多的有机磷类农药,杀虫谱广,主要用于防治水稻、茶叶、蔬菜等多种作物中的害虫。MP实现杀虫是通过抑制害虫神经系统中胆碱酯酶的活性从而使其致死。但是,甲基对硫磷有着较强的神经毒性,... 详细信息

甲基对硫磷（Methyl parathion,MP）是一类使用较多的有机磷类农药,杀虫谱广,主要用于防治水稻、茶叶、蔬菜等多种作物中的害虫。MP实现杀虫是通过抑制害虫神经系统中胆碱酯酶的活性从而使其致死。但是,甲基对硫磷有着较强的神经毒性,同时会导致人体出现记忆力受损、头痛、言语困难等症状。目前,通过甲基对硫磷水解酶来降解甲基对硫磷是较为有效的手段之一,但是游离的甲基对硫磷水解酶有着稳定性差、降解环境要求苛刻以及不能重复利用等缺点,而固定化甲基对硫磷水解酶不但可以改进上述缺点,还可以降低工业应用中的成本,因此受到了广泛关注。本课题选用甲基对硫磷水解酶Azau-MPH作为固定化研究对象,具体研究内容如下:（1）通过水热法制备了金属有机框架MIL-88A,对其进行了SEM、XRD以及FT-IR表征以确定载体的成功制备。随后,使用制备的MIL-88A从Azau-MPH粗酶液中选择性结合目标蛋白得到Azau-MPH@MIL-88A。结果表明Azau-MPH@MIL-88A对MP的比酶活为14.9 U/mg,较游离酶提高了三倍。此外,Azau-MPH@MIL-88A的储藏稳定性显著提高,4℃下储藏60天后仍然有着80%左右的初始活性保留。最后,以固定化酶为催化剂、7-氨基-4-甲基香豆素作为荧光探针制备了一种能够快速检测甲基对硫磷的荧光检测传感器,该荧光传感器的检测限为0.038μM,线性检测范围为0.038-189μM。（2）通过共沉淀法制备了ZIF-8以及固定化酶Azau-MPH@ZIF-8,且通过SEM、FT-IR以及激光共聚焦显微镜三种表征手段分别对标准ZIF-8和Azau-MPH@ZIF-8进行表征以确定Azau-MPH成功负载与ZIF-8内。结果表明,在最适条件下,固定化酶的催化比酶活为1.2 U/mg。尽管催化效率降低,但是Azau-MPH@ZIF-8的热稳定性、有机试剂耐受性以及SDS耐受性都得到了明显的改善。这表明Azau-MPH@ZIF-8能够实现在不利于游离酶发挥作用的条件下实现对MP的高效降解。此外,将Azau-MPH@ZIF-8用于实际樱桃样品的循环降解,循环使用6次后,Azau-MPH@ZIF-8保留着60%左右的初始酶活。（3）最后,为了提高固定化Azau-MPH的回收便捷性,改善Azau-MPH@ZIF-8酶活回收率低的缺点,在Azau-MPH@ZIF-8的基础上引入了Fe3O4纳米颗粒于载体之中。通过TEM、FT-IR以及XRD三种表征手段验证了ZIF-8@Fe3O4@Azau-MPH的成功制备。此后,对ZIF-8@Fe3O4@Azau-MPH及游离Azau-MPH的性质进行测定,结果表明,相比于Azau-MPH@ZIF-8,ZIF-8@Fe3O4@Azau-MPH对MP的比酶活为3.07 U/mg,且有着更为优秀的稳定性。除此之外,ZIF-8@Fe3O4@Azau-MPH的在循环使用6次后能够保留90%左右的初始酶活,表明相比于Azau-MPH@ZIF-8,其在实际工业应用中有着更加广阔的应用前景。

关键词：甲基对硫磷甲基对硫磷水解酶金属有机框架固定化纳米材料

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翻译共转移信号肽及重组甲基对硫磷水解酶的制备方法

翻译共转移信号肽及重组甲基对硫磷水解酶的制备方法

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作者：曾世超詹志春周樱谌颉张成杰吴启涛 430000 湖北省武汉市东湖开发区凌家山南路5号

本发明提供一种翻译共转移信号肽及重组甲基对硫磷水解酶的制备方法，其中所述翻译共转移信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的翻译共转移信号肽可以引导甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母X33中的高效分泌表达，其分泌表达量远... 详细信息

标准号: CN108676077B

本发明提供一种翻译共转移信号肽及重组甲基对硫磷水解酶的制备方法，其中所述翻译共转移信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的翻译共转移信号肽可以引导甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母X33中的高效分泌表达，其分泌表达量远高于毕赤酵母通用信号肽α‑factor，可以极大的降低甲基对硫磷水解酶的生产成本，使得甲基对硫磷水解酶作为一种安全环保的酶制剂大规模应用于食品或环境中的农药残留的降解成为可能。

关键词：甲基对硫磷水解酶转移信号毕赤酵母翻译高效分泌表达氨基酸序列大规模应用安全环保分泌表达农药残留通用信号酶制剂降解制备生产成本

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gfp融合的甲基对硫磷水解酶基因mph在E. coli中的表达

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湖北大学学报（自然科学版） 2019年第1期41卷 22-25页

作者：黄灿程杨马立新严红湖北大学生命科学学院湖北武汉430062

依照大肠杆菌密码子的偏爱性将来源于Pseudomonas sp. M6的有机磷水解酶基因mph设计合成了新的有机磷水解酶基因,然后将其与GFP融合进行表达,构建一株具有全细胞催化活性的大肠杆菌工程菌.设计优化后所合成的mph-r基因全长927 bp,然后... 详细信息

依照大肠杆菌密码子的偏爱性将来源于Pseudomonas sp. M6的有机磷水解酶基因mph设计合成了新的有机磷水解酶基因,然后将其与GFP融合进行表达,构建一株具有全细胞催化活性的大肠杆菌工程菌.设计优化后所合成的mph-r基因全长927 bp,然后将基因克隆到p ET23a-gfp大肠杆菌表达型质粒上,成功构建了重组表达质粒p ET23a-gfpmph-r,转化大肠杆菌感受态Rosetta blue.经过诱导剂IPTG的低温诱导24 h后,收集细胞,通过SDS-PAGE和Western Blot检测融合蛋白的表达.实验结果显示,融合蛋白的表达量大大提高,且通过酶活分析测定,全细胞酶活达到了11. 2 U/m L.

关键词：甲基对硫磷水解酶 GFP mph-r基因融合蛋白

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酶学性能改善的甲基对硫磷水解酶突变体及其应用

酶学性能改善的甲基对硫磷水解酶突变体及其应用

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作者：龚晓洁李立公李光雷 101407 北京市怀柔区雁栖经济开发区雁栖河西一路6号

本发明公开了酶学性能改善的甲基对硫磷水解酶突变体及其应用。本发明对野生型甲基对硫磷水解酶进行定点改造，结合蛋白结构计算、模拟技术和分子生物学技术对OPHC2进行体外突变和表达，并运用生物化学手段检测蛋白酶的动力学参数和稳... 详细信息

标准号: CN107189993B

本发明公开了酶学性能改善的甲基对硫磷水解酶突变体及其应用。本发明对野生型甲基对硫磷水解酶进行定点改造，结合蛋白结构计算、模拟技术和分子生物学技术对OPHC2进行体外突变和表达，并运用生物化学手段检测蛋白酶的动力学参数和稳定性，筛选获得热稳定性和底物亲和力有显著改善的突变体V117HQ119E以及催化效率显著提高并在表面活性剂中稳定性提高的突变体F263W，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。本发明显著改善了OPHC2的酶学性能，拓宽了OPHC2的应用领域和作用效率，在有机磷农药降解、机体解毒和神经毒剂洗消等方面应用前景广泛。

关键词：突变体甲基对硫磷水解酶酶学分子生物学技术有机磷农药降解生物化学手段蛋白酶氨基酸序列表面活性剂动力学参数催化效率结构计算结合蛋白模拟技术热稳定性神经毒剂性能改善作用效率野生型解毒底物体外洗消亲和力突变应用筛选检测改造

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体外分子进化提高甲基对硫磷水解酶的催化活力

体外分子进化提高甲基对硫磷水解酶的催化活力

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作者：李英南江南大学

学位级别：硕士

有机磷酸酯（OPs）由于其极强的的毒性而被用作神经毒剂和杀虫剂,并且由于其对乙酰胆碱酯酶的抑制从而引起严重的环境和人类健康问题。甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase,MPH）可实现在大肠杆菌的可溶性表达并且可以水解多... 详细信息

有机磷酸酯（OPs）由于其极强的的毒性而被用作神经毒剂和杀虫剂,并且由于其对乙酰胆碱酯酶的抑制从而引起严重的环境和人类健康问题。甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase,MPH）可实现在大肠杆菌的可溶性表达并且可以水解多种有机磷农药进而可用于修复被农药污染的土地。然而,MPH只在某些已知的有机磷农药中体现了降解活性,对有机磷酸酯神经毒剂的水解活性尚未报道,因此,应用生物技术手段开发具有良好的生物稳定性,广谱性,高效率的有机磷农药显得尤为重要。本研究通过随机突变和定点饱和突变的策略,经过两轮的筛选工作,通过搜索和设计远离活性口袋的关键位点,实现了对来源于假单胞菌Pseudomonas ***-3的甲基对硫磷水解酶的催化效率的提高。论文主要研究结果如下:（1）在第一轮筛选过程中,通过随机突变获得具有催化效率提高的一个四位点突变体D172H/D265V/S277I/K316R。其催化效率(kcat/Km)（337.7μM）为野生型（wild type,WT）(105.3μM)的3.2倍。为了探究四个突变位点中的关键突变,通过将突变体中的四个突变位点进行拆分并重新组合成不同的突变体。最终,关键位点S277被鉴定为可以显著提高底物结合亲和催化效率。（2）进一步将方向集中于277位点的饱和突变,发现在此位点的另外两个突变的Km明显下降,分别为40.2和47.6μM。并且kcat/Km值分别是第一轮筛选到的四位点突变体的3.0和3.2倍,是WT的9.5和10.3倍。在MPH三维结构中,发现S277残基位于loop结构与螺旋结构的铰链区域,其作用可以视为底物在进入结合袋时处充当盖子作用。这表明残基S277位点的突变可以通过底物入口区域的构象变化影响底物结合。（3）通过运用已知的MPH晶体结构信息以及生物信息学分析相结合的策略,更加针对性地选取热点氨基酸进行酶的改造,与野生型MPH相比较,突变体Q272E对底物的催化效率提高到野生型的5.5倍。此研究工作运用随机突变,位点饱和突变,结构和生物信息学分析相结合的策略,从较小的突变库（3800株）中获得具有高催化效率的突变体。

关键词：甲基对硫磷水解酶定向进化定点饱和突变催化效率结构与生物信息学分析

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一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及构建方法和应用

一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及构建方法和应用

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作者：薛文娇刘晨马赛箭安超丁浩 710043 陕西省西安市雁塔区西影路76号

本发明公开了一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及构建方法和应用，本发明的基因工程菌能有效降解有机磷农药中的甲基对硫磷、杀螟松和辛硫磷，按照降解效率排序依次为甲基对硫磷＞杀螟松＞辛硫磷；在无机盐培养基中完全降解甲基... 详细信息

标准号: CN110029080A

本发明公开了一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及构建方法和应用，本发明的基因工程菌能有效降解有机磷农药中的甲基对硫磷、杀螟松和辛硫磷，按照降解效率排序依次为甲基对硫磷＞杀螟松＞辛硫磷；在无机盐培养基中完全降解甲基对硫磷25mg/L、50mg/L、100mg/L所需时长分别为60h、68h、76h；且mpd基因的转入并未影响固氮施氏假单胞菌L38‑1的固氮酶活性。

关键词：基因工程菌甲基对硫磷辛硫磷固氮甲基对硫磷水解酶施氏假单胞菌无机盐培养基固氮酶活性有机磷农药降解甲基降解效率有效降解对硫磷杀螟松构建时长排序转入应用

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翻译共转移信号肽及重组甲基对硫磷水解酶的制备方法

翻译共转移信号肽及重组甲基对硫磷水解酶的制备方法

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作者：曾世超詹志春周樱谌颉张成杰吴启涛 430000 湖北省武汉市东湖开发区凌家山南路5号

标准号: CN108676077A

关键词：甲基对硫磷水解酶转移信号毕赤酵母翻译高效分泌表达氨基酸序列大规模应用安全环保分泌表达农药残留通用信号酶制剂降解制备生产成本

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多功能粘质沙雷氏菌的筛选鉴定及其甲基对硫磷水解酶基因的克隆

多功能粘质沙雷氏菌的筛选鉴定及其甲基对硫磷水解酶基因的克隆

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作者：万娟湖北大学

学位级别：硕士

有机磷农药的共性是分子中含有一个P原子,可与乙酰胆碱酯酶（AChE）共价结合形成磷酰化酶,抑制AChE活性,对人和动物产生毒性。目前,常用处理有机磷农药方法主要有絮凝沉降、化学水解、氧化、光催化和生物降解。其中,微生物菌株及其生物... 详细信息

有机磷农药的共性是分子中含有一个P原子,可与乙酰胆碱酯酶（AChE）共价结合形成磷酰化酶,抑制AChE活性,对人和动物产生毒性。目前,常用处理有机磷农药方法主要有絮凝沉降、化学水解、氧化、光催化和生物降解。其中,微生物菌株及其生物酶降解污染物具有无毒、无残留、无二次污染等优点,得到业界人士的广泛认可和充分肯定。从自然环境中分离有机磷农药高效广谱降解功能菌株和高效降解有机磷农药的酶是有机磷农药废水处理的基础和保障。通过对采集于沙湖周边的水样经过富集培养,再经过乐果做唯一碳源的无机盐平板划线筛选,得到9株有机磷农药降解菌,其中中间苍白杆菌MEW68降解乐果的效果最好（降解率为80.45%）,但是它在农药降解方面的研究较多,因此选择在该方向研究较少的粘质沙雷氏菌MEW96作为降解农药的菌株。在LB平板培养24 h,MEW96菌落表面光滑、微隆起,不透明,边缘稍带锯齿状,生化分析表明MEW96能在1%–8%NaCl中生长,具有鸟氨酸脱羧酶、酯酶和DNA酶,但是没有精氨酸双水解酶和脲酶活性,甲基红染色阴性,能水解糊精、明胶、肌苷,不能水解Tween 40;结合形态观察,生理生化鉴定和16S rDNA测序分析,将MEW96鉴定为粘质沙雷氏菌（*** ***）。MEW96对甲基对硫磷有比较好降解效果,在5 d内完全降解50 mg/L的甲基对硫磷;MEW96对对氧磷的降解效率为90.3%,且在降解对氧磷的过程中PNP逐渐积累,PNP的增加量与对氧磷的减少量保持一致;MEW96也能够降解乐果,第7 d,降解率为87.2%;说明MEW96是一株降解多种农药的高效菌株。对MEW96的多功能性质进行初步分析,发现MEW96能水解几丁质和卵磷脂,而且能明显抑制尖刀镰孢菌、苹果轮纹菌、花生叶霉和草莓灰霉菌丝的生长,对水稻纹枯菌和灰葡萄孢菌也具有一定的抑制作用,同时还能富集无机磷,当磷含量为10 mg/L,24 h聚磷率为99.94%。因此,MEW96既能在有机磷农药降解方面有良好应用,同时又可应用于生物防治领域。在MEW96基因组中发现编码甲基对硫磷水解酶的基因GM004539,且基因表达量受甲基对硫磷诱导而明显上调。将MEW96 mpd基因表达到*** BL21（DE3）,得到重组菌MBW300,经过最佳条件（温度37 ~oC,IPTG浓度0.3 mM,时间8 h）诱导,得到大量可溶性蛋白,经镍柱纯化,SDS-PAGE和western blot显示约35 kDa的位置有单一条带,Native-PAGE分析在约66 kDa处出现一条清晰的蛋白条带,推测MPH活性形式是同源二聚体。纯化的甲基对硫磷水解酶最适反应温度为35 ~oC,最适pH为11;Co2+、Cd2+、Fe2+对酶有激活作用,Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+对酶有抑制作用。35 ~oC,反应液pH为9时,以甲基对硫磷作为底物,甲基对硫磷水解酶酶比活为3.66U/mg,米氏常数（Km）为430.5±49.5μmol/L,转换数（kcat）为1467.2±6.1 min-1,催化效率（kcat/Km）为3.41μM-1min-1。经HPLC检测,MEW96甲基对硫磷水解酶通过水解P-O键,将甲基对硫磷转化成对硝基苯酚。当酶浓度为300μg/mL,经过约24 h的水浴反应,甲基对硫磷被完全转化为对硝基苯酚,此时对硝基苯酚浓度为24.74 mg/L。重组菌MBW300能在96 h内完全降解50 mg/L的甲基对硫磷,相比于野生菌MEW96,重组菌对甲基对硫磷的降解能力更强。

关键词：粘质沙雷氏菌有机磷农药筛选鉴定甲基对硫磷水解酶酶活

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Plesiomonas sp.M6来源的甲基对硫磷水解酶MPH在毕赤酵母中的表达及其固定化研究

Plesiomonas sp.M6来源的甲基对硫磷水解酶MPH在毕赤酵母中的表达...

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作者：王颖湖北大学

学位级别：硕士

甲基对硫磷水解酶MPH（Methyl Parathion Hydrolase）来源于邻单胞菌属中的一种能降解甲基对硫磷的菌株M6。MPH可以有效并特异性的降解甲基对硫磷,甲基对硫磷与对氧磷、对硫磷等含碳-磷键或含有机基团的磷酸衍生物等有机磷化合物,是有... 详细信息

甲基对硫磷水解酶MPH（Methyl Parathion Hydrolase）来源于邻单胞菌属中的一种能降解甲基对硫磷的菌株M6。MPH可以有效并特异性的降解甲基对硫磷,甲基对硫磷与对氧磷、对硫磷等含碳-磷键或含有机基团的磷酸衍生物等有机磷化合物,是有机磷杀虫剂、有机磷除草剂、有机磷神经毒气等的主要成分。对生物体的毒性主要表现为抑制乙酰胆碱酯酶的活性,造成神经突触后膜上的乙酰胆碱大量积累,从而导致神经系统的过度刺激。由于有机磷农药在许多国家被大量使用,导致了严重的水、土壤、大气环境污染和生态破坏,严重威胁着人类的生命安全。虽然目前已发现了多种有机磷水解酶,但是表达量低,生产成本高等原因阻碍了其工业化生产。本研究转化甲醇营养型毕赤酵母GS115得到了高产量的甲基对硫磷水解酶菌株。实验的结果如下:1.甲基对硫磷水解酶MPH-R的基因合成在NCBI中搜索到邻单胞菌Plesiomonas sp.M6来源的甲基对硫磷水解酶MPH的基因序列并去掉了mph基因中的原始信号肽序列,在其末端添加6个组氨酸标签。翻译成氨基酸序列之后,按照毕赤酵母的密码子偏爱性设计overlapping PCR引物,合成新的基因序列mph-R基因全长为912bp,共编码304个氨基酸。***-R表达载体的构建和表达将合成好的基因通过酶切酶连的方法连接到pHBM905BDM表达型载体,得到pHBM905BDM-mph-R。SalⅠ线性化酶切载体之后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞。筛选出阳性菌落接种于BMGY培养基摇瓶发酵。在48小时甲醇诱导后,500mL摇瓶中MPH-R的表达水平增加至1.9 U/mL,比酶活为15.8 U/mg。且在5 L基础盐高密度发酵培养基中表达量增加至18.4U/mL,将表达量再次提高了9.7倍。到目前为止MPH已成功的在毕赤氏酵母中分泌表达,报道过的野生型MPH在毕赤酵母中的表达量约为0.03 U/m L,用其它方法优化过的MPH表达量约为0.48 U/mL,还达不到工业生产的表达水平。我们通过改变MPH-R的信号肽以及按照毕赤酵母密码子偏好性优化密码子的方法提高表达量,实验数据表明本实验重组蛋白MPH-R在毕赤酵母中的表达水平是野生型MPH的62倍,是其它文献中优化MPH的4倍。***-R的纯化和酶学性质研究使用Ni-NTA亲和层析纯化的方法纯化MPH-R。经测定该酶的最适温度为39℃,最适pH为11。金属离子作为添加剂检测MPH-R活性的变化,当浓度为1mM时,Ni2+、Co2+和Mg2+能有效增加MPH-R的活性,分别达到了196%、201%和154%。***-R固定化研究选用壳聚糖为固定化载体材料,戊二醛为交联剂固定化机磷水解酶MPH-R。壳聚糖是具有好的生物相容性和对环境友好的材料,能有效的通过共价键结合MPH-R,并且较游离酶提高了MPH-R催化效率。通过比较游离的MPH-R与固定化的MPH-R酶学性质发现:虽然固定化酶与游离酶的最适温度及最适pH相近,但是固定化酶对不同的温度和pH的适应性更强,具有更高的活性,且壳聚糖固定化酶热稳定性和pH耐受性较游离酶得到了明显的提升。固定化酶最大的优势是可以回收再利用,进行多次重复反应。本实验中壳聚糖固定化MPH-R在经过100次重复使用后,仍能保持约50%以上的活性。壳聚糖固定化酶优异的特性为其工业化发展提供了良好的选择。

关键词：甲基对硫磷水解酶毕赤酵母高密度发酵固定化壳聚糖

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多策略叠加提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量的方法

多策略叠加提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量的方法

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作者：田健伍宁丰初晓宇黄璐王平江湖刘晓青 100081 北京市海淀区中关村南大街12号

本发明公开了一种多策略叠加提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量的方法，属于提高酶蛋白在毕赤酵母中分泌表达量的领域。本发明通过单因素实验发现分别在其N端融合蛋白质标签、内质网驻留信号突变或酸稳定性突变均可在一定程... 详细信息

标准号: CN104673823B

本发明公开了一种多策略叠加提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量的方法，属于提高酶蛋白在毕赤酵母中分泌表达量的领域。本发明通过单因素实验发现分别在其N端融合蛋白质标签、内质网驻留信号突变或酸稳定性突变均可在一定程度上提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中的分泌表达量。本发明进一步发现，将上述三种方案组合在一起后，甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中的分泌表达量呈显著的提升，三者的协同效应非常显著。本发明方法在应用毕赤酵母表达酶蛋白等方面具有重要的应用前景。

关键词：毕赤酵母分泌表达甲基对硫磷水解酶酶蛋白突变单因素实验融合蛋白质酸稳定性协同效应驻留信号内质网叠加应用标签发现

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