随着多学科的交叉融合和新技术的不断发展,人们对生物传感器的性能提出了更高的要求,如选择性好、灵敏度高、响应快、稳定性好、操作简便、可自动连续检测及易控制等优点。近年来,便携式传感器件越来越受到市场的青睐,使得人们可以实时监控自己的一些重要生理指标,甚至自行在家中完成疾病的初步诊断。随着纳米技术与微电子技术的交叉,生物传感器朝着微型化、智能化和简便化的方向发展。作为电化学生物传感器的核心部件,催化电极材料除了需要具备基本的生物传感功能之外,还需要具有良好的生物相容性、耐腐蚀性、经久耐用和轻柔等特点,这些方面也是生物传感器件电极材料的研究重点。因此,设计和制备兼具良好柔韧性、优异机械性能和导电性的电极材料对于高性能柔性生物传感器的开发至关重要。石墨烯凭借其大的比表面积、超强的机械强度以及优异的导电性,这些特性使其成为了制备柔性电极的优质候选基底材料,然而本征石墨烯中无官能团,无电化学活性。此外,石墨烯与金属作用力较弱,缺乏锚定位点,不利于活性金属粒子的负载,限制了石墨烯基柔性复合电极的应用。在本文的工作中,通过对石墨烯复合薄膜载体进行掺杂活化、微观形貌调控和金属负载等策略,制备了三种负载金属纳米粒子的石墨烯基复合柔性薄膜电极。具体而言,利用掺杂的杂原子改变石墨烯电子云分布,引入大量缺陷并创造活性位点,同时利用杂原子的配位锚定作用增加载体与负载的活性金属纳米粒子间的相互作用,改善金属物种在石墨烯片层结构中和表面的锚定与分散,以此来提高负载金属的自支撑电极的电化学生物传感性能。具体研究工作如下:
(1)第一部分中,将氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)与溶解的聚丙烯腈(PAN)共混成膜,制备成GO-PAN复合薄膜,并通过预氧化和高温碳化,将PAN作为N源引入到石墨烯的结构中制备成N掺杂的石墨烯复合薄膜(NGF)。N原子的引入为金属纳米粒子钯(Pd)的负载提供了丰富的缺陷锚定位点,构建稳定的配位结构,有利于Pd纳米粒子均匀和稳定地锚定于NGF上,得到Pd/NGF复合薄膜电极。基于Pd/NGF自支撑薄膜电极的传感器对不同浓度的过氧化氢(一种典型的生物标记物)均有较好的检测性能,响应灵敏度为104.2μA·m M-1·cm-2,检测限为0.99μM,线性范围为2.5μM-20.34 m M。
(2)第二部分中,同样以GO为原料,使用Na Cl为造孔剂、HI为还原剂,制备多孔还原氧化石墨烯多孔薄膜材料。然后,以尿素为氮源,将薄膜浸渍在尿素饱和溶液中,干燥后进行高温退火处理,即可得到氮掺杂的多孔石墨烯薄膜(NPGF)。利用NPGF载体中的大量含氧和氮官能团为位点锚定高度分散的Pd纳米粒子,得到Pd/NPGF自支撑复合电极。基于Pd/NPGF自支撑电极的电化学生物传感器显示出比NPGF和未掺杂材料(PGF)电极优异的性能,灵敏度为176.7μA·m M-1·cm-2,在5μM-36.3 m M的线性范围内均能检测,检出限为2.3μM。
(3)第三部分中,将硫脲分子溶解在GO浓缩溶液中,经过冻干成膜将硫脲引入GO薄膜片层结构中,充当造孔剂。然后,经过高温退火,使得硫脲原位分解构建多孔结构,同时硫脲作为N/S实现石墨烯的掺杂改性,在石墨烯结构中掺杂大量且均匀的氮、硫杂原子,即可得到氮硫共掺杂的多孔石墨烯薄膜(NSPGF)。掺入的N和S不仅可以创造活性位点,还可以为Pd纳米粒子的负载提供丰富的锚定位点,有利于Pd纳米粒子均匀地分散在NSPGF上,制备高活性Pd/NSPGF复合薄膜电极。得益于电极材料的诸多特点,如N/S杂原子掺杂赋予石墨烯的电化学活性、均匀分散的活性钯纳米粒子、良好的导电性(阻抗低至77.96?)和石墨烯薄膜的多孔结构,基于Pd/NSPGF自支撑电极的电化学生物传感器对不同浓度的过氧化氢溶液的电化学检测有了较好的性能,灵敏度为1331μA·m M-1·cm-2,检测线性范围为0.5μM-3.2 m M,检出限低至50 n M。该生物传感系统还能进一步应用于正常结肠粘膜上皮细胞和人结肠腺癌细胞等几种癌细胞释放H2O2的实时检测中,展现了良好的应用前景。
电化学生物传感策略结合了电分析方法的高灵敏度和生物识别过程的高特异性。其中,电化学生物传感策略中的生物成分识别待分析物,从而发生催化或结合反应,最终产生由检测器能监测的电信号,该信号与待分析物浓度成比例。由于电化学生物传感成本低、易于操作、便携和结构简单,其中一些传感器设备已进入商业化阶段,通常用于临床、环境、工业和农业应用。但是,在实际分析应用中,由于被测分析物浓度一般都较低,这就要求研究者们结合各种信号放大技术来实现对目标分析物的灵敏检测。因此,该论文采用了特异性高的适体作为生物识别元件,借助多种信号放大技术,如杂交链反应(HCR)、Toehold介导的链置换以及磁纳米颗粒(MNPs)等,构建了对抗疟药物、凝血酶以及转录因子的高选择性且灵敏的电化学生物传感策略。本论文具体的研究内容如下:1.基于核酸电路的电化学适体传感器对抗疟药物哌喹和甲氟喹的多组分检测追踪抗疟药物的使用和疗效对于监测当前抗疟药物耐药性的蔓延十分重要。然而,用于确定片剂质量和患者药物使用的可用方法通常难以获得,需要能够进行液相色谱-质谱的设备齐全的实验室。我们在这构建了基于目标物响应的辅助链杂交反应用于形成树状DNA纳米结构的电化学适体传感器来实现对多组分抗疟药物哌喹和甲氟喹的高灵敏检测。利用特异性适体结合目标抗疟药物引起的构型变化置换出阻断链,同时结合高效的磁分离,分离出的代表哌喹和甲氟喹的阻断链可以作为桥梁分别连接固定在电极表面的双链DNA和修饰有电活性物质的辅助探针。两条辅助探针被精心设计有两种杂交方式,使其能够自组装形成茂密的分支结构,得到放大的电化学信号,能检测到分别低至0.061 ng m L和0.17 ng m L的哌喹和甲氟喹,因此能及时监测当前抗疟药耐药性的蔓延。该适体传感器还对目标抗疟药物有很高的选择性,若能通过开发其他抗疟药物的高特异性适体,该检测体系有希望发展用于其他多种抗疟药物的同时检测。2.基于磁性纳米粒子修饰的DNA聚合物构建的高灵敏检测凝血酶的电化学传感方法在疾病的诊断和治疗中,对微量蛋白质的灵敏和简单的传感策略的发展受到了越来越多的关注。我们在这里描述了一种无电极固定的电化学生物传感策略,其可用于灵敏地检测人血清中的凝血酶。该策略依赖于杂交链式反应和高的磁分离效率。两种不同的适体同时结合凝血酶,可增加适体局部浓度使得邻位结合诱导的链置换反应成为可能,从而导致在亚甲蓝(MB)和生物素标记的发夹之间引发HCR,形成长DNA聚合物。链霉亲和素修饰的MNPs进一步特异性结合生物素部分以形成MNPs/DNA聚合物。因此,磁积累会使聚合物上的MB在电极上检测时发生电子转移而产生显著增强的电流信号。此策略用简单的无电极固定的方式对凝血酶进行高灵敏地检测,检测范围为5 pmol L~50 nmol L,检测限为1.1 pmol L。此外,在实际样本即稀释的人类血清中,运用该策略也对低水平凝血酶实现了高特异性的检测,这表示了该电化学生物传感策略有在早期疾病诊断中方便地、超灵敏地监测其他蛋白质生物标志物的潜力。3.基于杂交链式反应和DNA水凝胶的CRISPR电化学生物传感方法灵敏检测转录因子转录因子是调节基因转录、复制和表达的关键物质,其检测为多种疾病的诊断提供了有价值的信息。通过将杂交链式反应激活的Cas12a酶与生物响应性DNA水凝胶相结合,我们提出了一种双扩增和无标记均相电化学检测方法,以实现对核因子κB p50(NF-κB p50)的灵敏检测。目标分析物的存在保护DNA双链探针不被核酸外切酶III消化,且能启动HCR生成长双链DNA,从而激活RNA引导的Cas12a酶的活性。交联DNA水凝胶的DNA连接物的单链区域可被活化的Cas12a切割,以释放大量嵌入凝胶中的电活性物质,其表现出检测NF-κB p50的高度增强的电化学信号,检测限低至54 fmol L。此外,我们也用这种方法在稀释的He La细胞裂解液中成功检测到了NF-κB p50。因此,该方法为其他转录因子和生物标志物的简单、灵敏检测提供了新的方向。
导电高分子材料聚乙烯二氧噻吩(PEDOT)具有导电,导离子,稳定性高等特点,因此在生物电子与传感领域被广泛关注,但由于PEDOT本身不具备生物识别功能,所以需要引入特定的识别原件或受体赋予PEDOT一定的识别功能,通常识别元件或受体可通过掺杂、机械络合等方法引入到导电聚合物中,为确保材料的稳定性,本研究选用化学偶联的方法在PEDOT侧链接枝识别元件。主要研究内容如下:在PEDOT侧链接枝4-羧基-3-氟苯硼酸(FPBA)构建葡萄糖电化学生物传感器,建立了识别元件EDOT-FPBA单体的合成及分离方法,确定以二氯甲烷为单体溶剂,25℃下电聚合10 s制备Poly(EDOT-FPBA)。通过电化学阻抗测试确定薄膜Poly(EDOT-FPBA)可以在p H=7的PBS溶液中检测到葡萄糖信号,对葡萄糖浓度0.05-25 m M范围内的信号响应呈正相关(R=0.9826),检测限为0.05 m M。Poly(EDOT-FPBA)薄膜特异性、稳定性、循环性较好。在PEDOT侧链接枝炔基聚乙二醇(PEG)构建葡萄糖电化学生物传感器中抑制非特异性蛋白吸附的识别元件,建立了识别元件Poly(EDOT-PEG)薄膜的制备方法,确定以铜离子为催化剂,25℃下Poly(EDOT-N)与炔基聚乙二醇反应4小时为最佳制备条件。柱状形貌的Poly(EDOT-PEG)薄膜对非特异性蛋白有抑制作用,且对0.5%-5.0%质量分数下的牛血清蛋白溶液抑制效果较好,Poly(EDOT-FPBA-co-EDOT-PEG)薄膜检测葡萄糖信号相应灵敏。在EDOT侧链接枝亚麻酸(LA)构建提升细胞亲和性材料,建立了识别元件EDOT-LA单体的合成及分离方法,通过细胞毒性测试确定Poly(EDOT-LA)薄膜的细胞亲和性较强。
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