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基于硫酸软骨素和聚乙二醇协同抗污的电化学传感界面灵敏检测弧菌tlh基因片段

分析化学 2022年第7期50卷 1041-1052页

作者：张宇宇黄雅玥曾晖杨涛罗细亮中山大学化学工程与技术学院青岛科技大学化学与分子工程学院

通过简单的电化学方法合成高导电性和含有丰富羧基的聚氨基苯甲酸(Poly（m-aminobenzoic acid）, PABA),随后通过共价键合的方式在修饰界面引入具有良好亲水性和生物相容性的聚乙二醇（Polyethylene glycol, PEG）和硫酸软骨素（Chondro... 详细信息

通过简单的电化学方法合成高导电性和含有丰富羧基的聚氨基苯甲酸(Poly（m-aminobenzoic acid）, PABA),随后通过共价键合的方式在修饰界面引入具有良好亲水性和生物相容性的聚乙二醇（Polyethylene glycol, PEG）和硫酸软骨素（Chondroitin sulfate, CS）,构建了一种用于检测副溶血性弧菌tlh基因片段的抗污染电化学生物传感平台。导电聚合物与抗污染材料的结合，在赋予了传感界面抵抗非特异性物质吸附性能的同时，既保持了传感器对弧菌特异性dna片段的高灵敏度、高选择性的检测能力，又增强了传感界面的稳定性。在最佳条件下，采用此生物传感器对tlh基因片段进行检测，线性范围为1.0×10-20～1.0×10-8mol/L,检出限（S/N=3）低至3.3×10-21mol/L。与PABA、单一PEG以及单一CS修饰电极相比，在CS和PEG的协同作用下，此生物传感平台具有更优异的抗蛋白吸附性能。

关键词：电化学dna传感器抗污染聚乙二醇硫酸软骨素副溶血性弧菌

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Au/Ag@Fe-MIL-101修饰电极对癌胚抗原的电化学检测

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武汉理工大学学报 2017年第9期39卷 10-15页

作者：李娜李曦宋淑婷褚梅刘鹏董玉林林亚维张超灿武汉理工大学化学化工与生命科学学院武汉430070 武汉理工大学材料科学与工程学院武汉430070

制备了一种Au/Ag双金属纳米粒子掺杂的Fe-MIL-101复合材料,并以该复合材料作为信号放大器、以发夹型癌胚抗原适配体(CAP)为特异识别癌胚抗原(CEA)的探针dna,构建了电化学dna传感器。该传感器对CEA的线性检测范围为0.000 1~50 ng/mL,检... 详细信息

制备了一种Au/Ag双金属纳米粒子掺杂的Fe-MIL-101复合材料,并以该复合材料作为信号放大器、以发夹型癌胚抗原适配体(CAP)为特异识别癌胚抗原(CEA)的探针dna,构建了电化学dna传感器。该传感器对CEA的线性检测范围为0.000 1~50 ng/mL,检测限为0.011 5 pg/mL,而且具有良好的选择性、重现性和稳定性。

关键词： Au/Ag纳米粒子 Fe-MIL-101 适配体电化学dna传感器癌胚抗原

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新型酶联荧光、电化学免疫及dna传感技术的研究

新型酶联荧光、电化学免疫及DNA传感技术的研究

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作者：龚福春湖南大学

学位级别：博士

免疫传感技术在临床诊断、食品和药物分析以及环境化学等领域具有广阔应用前景，因而吸引了众多研究者的兴趣。免疫组分的特异性反应完全可以保证免疫传感器极高的选择性，提高其检测灵敏度、重复使用性和使用寿命成为了免疫传感器研究... 详细信息

免疫传感技术在临床诊断、食品和药物分析以及环境化学等领域具有广阔应用前景，因而吸引了众多研究者的兴趣。免疫组分的特异性反应完全可以保证免疫传感器极高的选择性，提高其检测灵敏度、重复使用性和使用寿命成为了免疫传感器研究的重点和热点。酶联荧光免疫传感技术是藕合高灵敏度的荧光检测与酶联化学倍增放大作用的一种新型免疫传感分析技术，该技术为极大地提高免疫分析的灵敏度提供了可能性。制备酶联荧光免疫传感器或装置的支撑技术有两方面：其一是免疫组分的固定及生物组分支撑体表面的再生；其二是酶荧光底物的开发。在这项技术中，目前主要有免疫组分支撑体表面的再生、免疫组分活性保持和新型荧光底物开发的问题亟待解决；与其它免疫传感器相比，电化学免疫传感器具有检测设备相对简单、使用方便、构制敏感电极方法灵活、体系容易集成化、微型化等优点，发展新型电化学免疫传器也是目前较活跃的研究领域。本论文报道了以日本血吸虫和布氏杆菌为模式免疫试剂，研究几种固定基质材料和固定方法并以之为基础分别制作一次性的和可更新的免疫组分支撑体；开发了二种新型荧光底物，以其为基础设计制备了荧光免疫流通传感装置；针对电化学免疫传感器在实际应用中所碰到的传感器表面再生难和固定生物组分易失活的问题，采用sol-gel技术分别固定完整的布氏杆菌和新城疫病毒构制了一种可再生性电化学免疫传感器，使敏感层具有较大的免疫活性和较好的再生稳定性。另外，针对目前电化学dna传感器研究中的热点问题：dna探针固定和杂交指示，我们在电化学dna传感器方面开展了一定的工作，分别研究了以天然高分子壳聚糖为桥梁固定dna探针，中性红为杂交指示剂和以电聚合中性红膜掺杂壳聚糖固定dna探针，免杂交指示剂的电化学dna传感器。具体内容如下： (1)在第二章中报道了以纳米金／PVC为载体材料固定布氏杆菌抗体，制备一种一次性的生物组分支持体；首次建立了以8-羟基喹啉镁络合物为辣根过氧化物酶底物的酶联荧光反应体系；首次采取在酶反应体系中介入扰动剂4-氨基安替比林扰动酶反应平衡的办法实现了信号的放大，该技术用于布氏杆菌抗原的测定，检测下限达到0.35ng／mL。(2)在第三章和第四章中分别报道了以溶胶一凝胶技术、石蜡／微晶纤微素为包埋基质固定日本血吸虫抗原和布氏杆菌抗原，制备一种可更新的生物组分支持体；以辣根过氧化物酶(HRP)为标志酶通过测定其催化3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)氧化引起的荧光降低来定量样品中日本血吸虫抗体或布氏杆菌抗体的浓度，检测下限分别达到4.5ng／mL和2.7ng／mL。这种方法提高了上述免疫试剂摘要检测的灵敏度，较好的解决了酶联荧光免疫传感技术中生物组分支撑体重复使用性和生物组分活性保持的问题。(3)在第五章中报道了以阿魏酸为HRP酶底物的酶联荧光免疫传感技术。阿魏酸是HRP天然底物，对HZOZ相对稳定，该底物的应用降低了传感体系误差，用于日本血吸虫抗体的测定，检测下限为45ng/mL。(4)在第六章、第七章中报道了以溶胶一凝胶技术分别包埋完整布氏杆菌和新城疫病毒，以。氨基酚和TMB为酶联底物的两种可更新电化学免疫传感器。溶胶一凝胶温和包埋条件有利于布氏杆菌和和新城疫病毒抗原活性的保持，固定完整布氏杆菌细胞可以克服使用纯蛋白抗原需分离、纯化所带来的麻烦而且有利于抗原活性保持，这种传感器表面通过简单的抛光而更新，克服了免疫传感器应用中免疫组分再生难的问题。该技术对布氏杆菌抗体和新城疫病毒抗体检测下限分别为3.5林g/mL和n.1林g/mL。 (5)在第八章中报道了以天然高分子壳聚糖为桥梁分子共价固定dna探针，中性红为杂交指示剂的可再生性电化学dna传感器。本文建议的固定方法简便，固定的dna 探针稳定;中性红杂交指示剂为非致癌物使用安全。这种传感器的线性响应范围为 10一5一10一”M/L，检测下限为10一，’M/L。(6)在第九章中报道了基于具电化学活性聚中性红膜的dna传感器。利用单链和双链与电聚合中性红膜的作用的区别，杂交前后膜的电化学性质改变进而引起响应电流变化来测定dna杂交，这种非标志、无杂交指示剂的dna传感器大大简化了dna测定程序，其检测下限为10一’0M/L。(7)在第十章中报道了以金属叶

关键词：酶联荧光免疫传感布氏杆菌日本血吸虫新城疫 8-羟基喹啉镁络合物 4-氨基安替比林酶反应扰动电化学dna传感器中性红

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基于几种信号放大策略的电化学生物传感研究

基于几种信号放大策略的电化学生物传感研究

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作者：熊二虎湖南大学

学位级别：博士

对于蛋白质、核酸、生物小分子及金属离子等的检测在生物医学、临床诊断、环境监测、工业生产等方面具有重要的意义。然而，如何快速准确地获取这些信息，成为了分析化学科研工作者面临的重要课题。电化学传感器由于具有操作简便、成本... 详细信息

对于蛋白质、核酸、生物小分子及金属离子等的检测在生物医学、临床诊断、环境监测、工业生产等方面具有重要的意义。然而，如何快速准确地获取这些信息，成为了分析化学科研工作者面临的重要课题。电化学传感器由于具有操作简便、成本较低、稳定性好、灵敏度高、选择性好和不破坏测试体系等优点，受到了研究者们的广泛青睐。众所周知，核酸分子探针具有结构简单、特异性强、靶分子易于被大量商业化合成的优势，结合电化学分析方法高灵敏度的优点和核酸探针性能优异的特性，以核酸分子作为识别元件，以电极作为信号转换器的电化学核酸传感器越来越受到人们的关注。　　随着分析化学领域的不断发展，对传感器灵敏度的要求越来越高，因此，开发新颖的核酸修饰电极、研制新型核酸探针、设计新型核酸放大方法，对于扩展电化学核酸传感器的应用范围具有重要的意义。　　基于此，本论文结合核酸剪切酶、电化学活性标记物、三链分子开关、杂交链式反应、dna催化发卡自组装以及滚环扩增技术等方法构建了一系列通用的电化学核酸传感平台，实现了核酸、金属离子及蛋白质的灵敏检测。主要工作如下：（1）基于双信号比率策略，发展了一种可重复使用的电化学dna生物传感器，用于汞离子（Hg2+）的灵敏检测。该核酸传感器具有“信号减弱”和“信号增强”两种信号输出的特点。亚甲基蓝（MB）修饰的巯基化的含有富T（胸腺嘧啶）碱基的发卡捕获探针（MB-P）首先固定到金（Au）电极表面。当加入Hg2+后，基于T-Hg2+-T络合原理，修饰有二茂铁（Fc）的含有富T碱基的核酸探针（Fc-P）会与MB-P杂交，这一杂交反应的进行导致MB标记物远离电极表面，Fc标记物靠近电极表面，从而MB电信号（IFc）减小，Fc电信号（IMB）增加。当以MB与Fc信号比值的对数为响应信号检测Hg2+时，检测限达到了0.08nM，远低于单独以MB和Fc作为响应信号的检测结果。该核酸传感器提供了一种快速检测Hg2+的方法，在真正的环境样品检测中具有很大的应用前景。　　（2）结合“信号增强”和“信号减弱”两种传感机理，利用双信号比率策略的优势，基于核酸外切酶III（ExoIII酶）诱导的目标dna（T-dna）循环放大方法，发展了一种新型且灵敏的电化学dna生物传感器用于原癌基因K-ras的检测。3’端修饰有MB且环部修饰有Fc的巯基化的发卡dna探针（HP）首先组装到Au电极表面，当T-dna存在时，T-dna与HP杂交，这一杂交反应诱导ExoIII酶对HP的剪切，导致MB标记物远离电极表面，而T-dna被释放，进入下一个循环，而在镁离子（Mg2+）的帮助下，剪切后的HP片段会形成发卡结构，导致Fc标记物靠近电极表面，从而MB电信号减小，Fc电信号增加。|ΔIMB|/ΔIFc与T-dna的浓度在0.01~0.8pM之间呈线性关系，检测限达到4.16fM。该研究的传感器在生物分析、疾病诊断及临床医学方面有潜在的应用价值。　　（3）基于三链分子开关及双信号比率策略，发展了一种简单且可重复使用的电化学dna生物传感器。首先MB修饰的发卡dna（MB-dna）固定到Au电极表面，在最优实验条件下，两端分别修饰有Fc的单链dna（Fc-dna）能够与MB-dna杂交，形成三链结构。当T-dna存在时，T-dna会与三链分子开关的环部杂交，促使三链分子开关被打开，Fc标记物远离电极表面;在Mg2+的帮助下，MB-dna又重新形成发卡结构，MB标记物靠近电极表面，因此Fc电信号减小，而MB电信号增加。IMB/IFc与T-dna的浓度在0.5~80pM之间呈线性关系，检测限达到了0.12pM。该电化学dna生物传感器提供了一种通用的平台，在早期临床诊断及生物医学研究对于多种目标物检测方面具有潜在的应用价值。　　（4）利用ExoIII酶切诱导的双重信号放大的优势，发展了一种免标记的、超灵敏的“信号增强”型的电化学dna生物传感器用于艾滋病基因（HIVgene）的检测。在T-dna存在的情况下，T-dna会与发卡dna探针（HP1）的3’端杂交，从而诱发ExoIII酶的剪切作用，通过酶切反应，T-dna被释放出来进入下一个循环，剪切后的dna片段，会与修饰在Au电极表面的巯基化的发卡dna（HP2）杂交，这一杂交过程继续诱导ExoIII酶的剪切，从而，第二目标物（ST-dna）被释放出来，电极上剩下的片段在血红素（hemin）和钾离子（K+）存在的情况下会折叠形成G四联体，产生显著的电化学响应，检测限达到4.83fM。该电化学dna生物传感器在与基因有关的疾病及早期临床分析诊断方面具有很大的应用前景。　　（5）通过结合ExoIII酶切诱导的目标物循环及杂交链式反应两种放大方法，发展了一种用于Hg2+检测的电化学dna生物传感器。富T碱基的捕获探针（CP）首先固定到电极表面，接着用

关键词：电化学dna传感器信号放大核酸剪切酶三链分子开关 NA催化发卡滚环扩增

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基于金电极无标记阻抗型AFB1电化学dna传感分析

基于金电极无标记阻抗型AFB1电化学DNA传感分析

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作者：张跃娟哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

电化学dna传感器具有快速、无需标记、灵敏度高等优势,为黄曲霉毒素B(AFB)的监测提供了新的机遇。然而,已报道的AFB电化学dna传感器存在dna固定量少、传感器制备过程繁琐和灵敏度差等问题,其根本原因在于dna固定方法不当、dna与AFB特异... 详细信息

电化学dna传感器具有快速、无需标记、灵敏度高等优势,为黄曲霉毒素B(AFB)的监测提供了新的机遇。然而,已报道的AFB电化学dna传感器存在dna固定量少、传感器制备过程繁琐和灵敏度差等问题,其根本原因在于dna固定方法不当、dna与AFB特异性结合差、电极性质不够好等。因此,本文采用自组装法将巯基化的单链dna(HS-ss dna)直接修饰在电极表面,达到简化操作的目的;而且首次对与AFB特异性结合的dna序列进行了优化研究;本文还引入聚邻苯二胺修饰电极(PoPD/MGE)和三维纳米阵列电极(3DNEEs),利用PoPD聚合物膜活性基团多和3DNEEs表面积大的优势,为dna的固定提供更多的活性位点,从而提高传感器的性能。具体工作如下:通过Au-S键的强相互作用将巯基化的单链dna直接组装在MGE表面,构建了dna/MCH/MGE传感器,该传感器的构建方法较其他方法简单、高效,。对传感器组装过程中的条件以及测试体系进行了优化。采用阻抗谱法对AFB的浓度进行了检测,通过分析传感器的界面组成建立等效电路,对阻抗谱进行拟合。得到传感器的工作区间为5.0×10-10.0×10-8 g/mL,检测限为2.1×10-10g/m L(S/N=3)。本文首次对与AFB特异性结合的dna序列进行了优化研究。结果表明,用本文优化得到的dna序列构建的传感器的检测限可达到6.4×10-12 g/m L(S/N=3),明显低于其他研究者所用的dna序列。传感器的特异性研究结果表明,本文所构建的传感器可以实现对AFB的特异性检测。本文采用电聚合法在MGE表面修饰PoPD聚合膜,利用戊二醛的交联作用固定dna,构建了dna/GA/PoPD/MGE传感器。通过对AFB浓度的检测,得到传感器的工作区间为5.0×10-12.0×10-8 g/m L,检测限为3.4×10-12 g/m L(S/N=3)。可以看出,PoPD聚合膜的引入提高了传感器的检测灵敏度。采用模板法制备了金3DNEEs,采用扫描电子显微镜(SEM)和能量色散X射线分析仪(EDX)对其形貌和组成进行了表征。结果表明,制备的纳米线取向一致、分布均匀,并且具有较高的纯度。采用自组装法构建了基于3DNEEs的AFB阻抗型dna传感器,对3DNEEs表面dna的固定量进行了计算,结果表明,3DNEEs表面上dna的固定量比相同几何面积的MGE上dna的固定量大一个数量级。对AFB的浓度进行了检测,得到传感器的工作区间为1.0×10-12.0×10-8 g/m L,检测限可达到8.0×10-13 g/mL(S/N=3)。该传感器的构建方法简单、高效,而且3DNEEs特殊的三维结构和大的表面积为dna的固定提供了更多的活性位点,与其他研究者构建的无标记的AFB电化学dna传感器相比也具有明显的优势。用该传感器对玉米样品中AFB的浓度进行了检测,得到AFB的平均回收率为102.6%。

关键词：黄曲霉毒素B1 电化学dna传感器 Po PD修饰电极三维纳米阵列电极

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基于dna—染料/CTS膜的联苯类有机污染物电化学传感的研究

基于DNA—染料/CTS膜的联苯类有机污染物电化学传感的研究

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作者：李琳辽宁科技大学

学位级别：硕士

对于在环境中不易降解、残留时间长、对人体有害且本身不具有电化学活性很难实现直接电化学检测的痕量联苯类有机污染物,本文利用dna与小分子之间的特异性相互作用,以双链dna为识别元件,构筑基于dna-染料/壳聚糖(CTS)生物聚合离子膜修... 详细信息

对于在环境中不易降解、残留时间长、对人体有害且本身不具有电化学活性很难实现直接电化学检测的痕量联苯类有机污染物,本文利用dna与小分子之间的特异性相互作用,以双链dna为识别元件,构筑基于dna-染料/壳聚糖(CTS)生物聚合离子膜修饰电极,组装间接型dna电化学传感器,用于痕量联苯类有机污染物的电化学检测,并进一步通过固定不同纳米材料和酶催化放大等方式探索信号放大机制,成功实现电化学传感器的信号放大。首先,利用dna/CTS生物聚合离子膜,构筑dna-染料/CTS聚合膜修饰电极。利用扫描电子显微镜、循环伏安法和电化学阻抗法对三种染料分子[甲苯胺蓝(TB)、亚甲基蓝(MB)、普鲁士蓝(PB)]修饰电极进行考察。结果表明,三种聚合膜均成功固定在电极表面,且具有良好的稳定性。以dna-TB/CTS修饰电极为例,考察了扫描速率、浸泡时间、缓冲溶液p H值和dna种类对修饰电极电化学活性的影响。在此基础上,利用循环伏安法和差分脉冲伏安法考察了三种聚合膜对0～2.5μM一氯联苯的电化学响应,结果发现一氯联苯的存在会抑制修饰电极的氧化还原电流。其次,在此基础上构建检测联苯类有机污染物的电化学传感器。以dna-TB/CTS修饰电极为模板,利用电化学方法,考察了各种因素如氧气、反应时间、dna种类以及膜组分浓度对一氯联苯在该修饰电极上电化学响应的影响。结果表明,在氧气存在下,反应时间为40 s,小牛胸腺dna及各组分浓度为:0.4 m M TB,0.5 mg/m L CTS,1 mg/m L dna时,修饰电极对一氯联苯的电流响应线性范围为0.5～5μM,敏感度为0.5182μA/μM,检测限达0.05μM(S/N=3)。修饰电极对联苯类物质响应具有较好的抗干扰性、稳定性和重现性,对实际样品中联苯类物质检测具有应用潜力。最后,以dna-TB/CTS修饰电极为基础,添加四种纳米材料[高密度碳纳米管(KF)、低密度碳纳米管(KC)、石墨烯和FeO磁性纳米粒子],构筑dna-染料/纳米材料/CTS聚合膜修饰电极,利用电化学方法研究三种染料分子修饰电极检测一氯联苯信号放大作用。结果表明,添加纳米材料均可以明显地增大修饰电极的基础电流,提高检测灵敏度。在添加FeO量为10μL、壳聚糖10μL、dna-染料10μL的条件下对0.5～2.5μM一氯联苯检测灵敏度为0.2578μA/μM,与dna-染料/CTS修饰电极相比,灵敏度提高了约2.5倍,降低检测限至0.01μM(S/N=3),且对葡萄糖、Na Cl、抗坏血酸等物质具有较强的抗干扰性。本文还研究添加生物酶催化底物的方式对检测信号放大的作用,利用辣根过氧化物酶对底物HO的催化作用,构筑dna-染料/HRP/CTS修饰电极,得到检测敏感度为0.2128μA/μM,检出限为0.01μM,灵敏度提高了约2.02倍。

关键词：生物聚合离子膜电化学dna传感器多氯联苯

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电化学dna生物传感构筑新方法及性能研究

电化学DNA生物传感构筑新方法及性能研究

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作者：屈登峰烟台大学

学位级别：硕士

发展简单、快速、灵敏度高及选择性好的核酸传感检测方法是生化分析、疾病诊断、环境监测等领域的迫切需求。电化学分析具有成本低、检测方便、灵敏度高等诸多优势。本论文致力于发展高灵敏电化学dna传感分析新方法,基于不同dna组装策... 详细信息

发展简单、快速、灵敏度高及选择性好的核酸传感检测方法是生化分析、疾病诊断、环境监测等领域的迫切需求。电化学分析具有成本低、检测方便、灵敏度高等诸多优势。本论文致力于发展高灵敏电化学dna传感分析新方法,基于不同dna组装策略及信号放大技术（如立足点介导的链置换、熵驱动靶标循环、催化发夹dna组装、dna walker等）,构筑了三种不同类型电化学dna生物传感器,实现了对靶标dna及尿嘧啶-dna糖基酶（UDG）的快速高灵敏检测。具体内容包括: 1.基于熵驱动靶标循环、Lambda核酸外切酶特异性切割及原位沉积银的电化学氧化检测技术,建立了一种新型dna电化学生物传感器。将5’-端标记有磷酸基团的单链dna（称之为燃料dna）固定在电极表面上。待测溶液中引入三链体dna组装探针,该三链体dna是由三条单链dna链组装而成,且含有靶标dna识别的立足点（Toehold）。该dna组装探针在靶标dna的作用下,通过连续的立足点介导链置换反应,实现靶标循环信号放大（熵驱动靶标循环）,将传感界面上固定的单链dna转变为大量的双链dna;形成双链dna后,标记的磷酸基团可引发Lambda外切酶特异性识别切割及循环放大,将传感界面上的dna消解。结合dna链上原位沉积银及电化学氧化检测技术,可实现对靶标dna的两种响应模式检测（有和无Lambda外切酶）。针对靶标dna的检测限分别为13.41f M（无Lambda外切酶时）和8.47 f M（有Lambda外切酶时）,实现了靶标dna的准确高灵敏分析检测。 2.基于dna walker策略,发展了一种dna纳米机器信号转导及放大技术,并结合dnazyme循环切割手段,构建得到一种新型电化学dna传感器,实现了尿嘧啶-dna糖基酶（UDG）活性的高灵敏检测。电极表面固定Mg2+-dnazyme的底物dna链,具有茎环结构,且标记有亚甲基蓝,用于电化学信号输出。dna纳米机器是基于双足dna walker驱动的催化dna发夹组装操作实现。设计三个茎环dna序列,其中一个茎环dna含有尿嘧啶碱基,其可在UDG作用下脱去尿嘧啶碱基,并进一步在特异性内切酶（APE1）的切割作用下,实现链断裂,从而形成双足dna walker的行走链。其进一步催化另外两个发夹dna在金纳米颗粒表面组装（其中一条茎环dna固定在纳米颗粒表面上）,实现纳米金颗粒表面上UDG驱动的双足dna walker操作,同时在纳米金颗粒表面上形成了组装型dnazyme序列,其可催化切割电极表面上的dnazyme底物链,实现电化学信号响应。该策略巧妙结合了纳米金颗粒表面上的双足dna walker及电极表面上dna纳米机器的多足walker原理,加快了反应速度,同时显著提高了检测灵敏度,针对UDG的检测限可达4.3×10-5 U/m L。该研究为dna纳米机器及生物传感构筑提供了一种新途径。 3.本章基于三发夹dna催化组装策略,发展得到了一种自增强型电化学dna walker传感检测技术,实现了dna片段的高灵敏分析检测。设计三个具有茎环结构的dna,其中一个发夹dna固定在电极表面上,另一个发夹dna标记有亚甲基蓝,用于信号输出。这三个发夹dna可在目标dna片段作用下,进行级联组装,同时目标dna片段可循环利用,实现信号放大。电极表面形成的dna组装体（Y-型结构）,其中一端形成目标dna的类似物,作用与目标dna片段类似。其可与电极表面上邻近的发夹dna继续作用,触发三发夹dna催化组装,形成级联的dna walker操作。这种自增强型dna walker传感检测技术具有操作简单、快速且检测灵敏度高等优势,针对目标dna片段的检测限可达5.33 f M。该研究为构筑自增强型dna传感检测技术提供了一种新思路。

关键词：熵驱动靶标循环 Toehold介导的链置换反应电化学dna传感器 dna walker 催化发夹组装

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基于dnazyme的重金属离子电化学生物分析方法的构建及其研究

基于DNAzyme的重金属离子电化学生物分析方法的构建及其研究

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作者：赵斯滕江苏大学

学位级别：硕士

重金属因其毒性、持久性和生物蓄积性不仅造成生态环境污染,还通过食物链进入人体,威胁人们的健康。这类物质在人体中的水平被认为是评估健康暴露风险的重要因素,因此,建立高效、可靠、选择性好的分析方法十分必要。金属离子特异性dnaz... 详细信息

重金属因其毒性、持久性和生物蓄积性不仅造成生态环境污染,还通过食物链进入人体,威胁人们的健康。这类物质在人体中的水平被认为是评估健康暴露风险的重要因素,因此,建立高效、可靠、选择性好的分析方法十分必要。金属离子特异性dnazyme合成过程简单、成本低,与蛋白质酶和核酶相比,优势明显。此外,基于功能核酸材料的电化学生物传感器具有操作简单、分析快速等优势,已成为痕量目标物分析的重要手段,本论文以重金属铜离子和铅离子作为研究对象,将金属离子特异性dnazyme引入电化学dna传感器,结合多种信号放大策略极大地提高了方法的灵敏度,实现了对金属离子的超灵敏、快速分析,为环境中重金属离子的痕量检测提供了新思路。主要研究内容如下:（1）以铜离子特异性dnazyme为识别元件构建了一种新型电化学传感器,用于人体血清中铜离子的超灵敏分析。在该研究中,dna四面体结构（TDN）修饰在电极表面作为捕获探针,不仅可识别目标物还能调控相界面;同时,程序化CHA/HCR的信号放大策略和功能化磁珠MBs对目标物的纯化与富集作用,极大地提升了方法的灵敏度。在最优条件下,该传感器对铜离子的检测范围为1.0f M-0.2 p M,检测限为0.33 f M。其加标回收率为87.92%-111.61%（RSD=4.89%-8.85%）。方法良好的选择性、重现性、准确性和稳定性表明其广阔的应用前景。（2）为进一步提高传感器的灵敏度,合成多重dna四面体纳米结构,并以此作为信号放大元件以负载更多的信号分子。在该方法的检测过程中,dnazyme-MNP系统可实现目标物的提纯和信号放大,该系统的引入不仅降低了假阳性信号,而且提高了该传感器的灵敏度;同时,结合CHA反应,该传感器实现了三重信号放大,极大地提高反应灵敏度;在最优条件下,该方法的检测限低至0.033 p M,检测范围为0.1 p M-500 n M。另外,通过优化检测步骤,该方法在检测时间方面具有明显优势,为其广泛应用提供了可能。（3）为提高实际样品分析效率,基于铜离子和铅离子特异性dnazyme,分别使用嵌入式亚甲基蓝和氯化六铵合钌作为信号分子,开发了一种用于同时检测铜离子和铅离子的新型电化学dna传感器。为进一步缩短检测时间,本传感器在简化操作步骤上做了如下改进:简化电极上的反应、信号分子直接嵌入到TDN中以减少滴加信号分子的时间。由于dnazyme的高选择性,该传感器可以实现对铜离子和铅离子两种目标物的同时检测。在最优条件下,该传感器对铜离子的检测限为0.017 p M,检测范围为0.05 p M-100 n M;对铅离子的检测限为0.17 p M,检测范围为0.5 p M-100 n M。经验证,该方法的加标回收实[1]验结果良好,表明其在实际样品中铜离子和铅离子的同时检测方面具有较高的准确性和稳定性。

关键词：信号放大电化学dna传感器重金属离子 dnazyme 磁珠

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基于石墨烯和生物条形码放大技术电化学检测两种重金属离子

基于石墨烯和生物条形码放大技术电化学检测两种重金属离子

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作者：谢金伶云南民族大学

学位级别：硕士

随着纳米技术的不断发展和进步,其本身优异的结合特性以及dna分子识别能力已经被广泛应用于dna传感器制备以及较多领域研究中,本文选择使用了石墨烯和纳米金两种常见的纳米材料,并结合生物条形码信号放大技术和酶催化反应技术,设计了用... 详细信息

随着纳米技术的不断发展和进步,其本身优异的结合特性以及dna分子识别能力已经被广泛应用于dna传感器制备以及较多领域研究中,本文选择使用了石墨烯和纳米金两种常见的纳米材料,并结合生物条形码信号放大技术和酶催化反应技术,设计了用于检测环境水样中银离子和汞离子的电化学dna传感器以及检测食品中过氧化氢的电化学传感器。1、设计了一个新颖、宽范围的基于生物条形码信号放大技术联合金标银染信号放大技术双重信号放大用于水溶液中银离子的检测的方法。该方法通过纳米金标记,表面杂交,银增强技术联用,实现电化学信号的放大,并通过银染时间的控制,以低背景峰电流检测超痕量银离子,检测范围宽,方法简单,具有较高的选择性和灵敏度。对Ag+的检测线性范围为5 p M到50μM,检出限为3 p M(S/N=3)。2、设计了一个简单、夹心结构的基于石墨烯和纳米金两种纳米材料,生物条形码信号放大技术、酶催化双重信号放大技术的电化学dna传感器,用于在水溶液中检测汞离子。这一方法利用石墨烯作为高电子传递基底,同时存在汞离子和目标dna的条件下,由于T?Hg2+?T结构的形成,使标记辣根过氧化物酶的纳米金-生物条形码dna复合物与目标dna形成特异性杂交双链,将与上百条生物条形码dna结合的辣根过氧化物酶接近石墨烯表面,增强了催化对苯二酚的信号。所提出的电化学dna传感器,在与其他金属离子共存情况下,具有较高的选择性和灵敏许,对Hg2+的检测线性范围为25 p M到10μM,检出限为13 p M(S/N=3)。3、制备了一个温和、信号切换、可重复使用的基于T?Hg2+?T的电化学生物传感器,依赖于石墨烯与单链dna和双链dna之间亲和力的差异。Fc标记的ss dna能与目标dna在Hg2+存在下特异性杂交形成ds dna后脱离GR表面,降低了Fc的信号,使修饰电极理论上还原为石墨烯修饰的玻碳电极,实现修饰电极的重复利用。所提出的电化学dna传感器,在与其他金属离子共存情况下,具有较高的选择性,起着信号放大作用的GR载体和游离到溶液中的ds dna使传感器能进一步再次使用,具有较好的再生性。对Hg2+的检测线性范围为25 p M到10μM,检出限计算得5 p M(S/N=3)。4、制备了一种简单、新颖的无酶电化学传感器用于食品中过氧化氢的测定,将石墨烯优越的性能复合纳米二氧化钛形成协同催化作用,可控的在其表面生成普鲁士蓝纳米立方,并呈现规则边缘以及相近尺寸,并使用Nafion作为稳定剂。Nafion/PB/GR-Ti O2/GCE显示出良好的催化还原过氧化氢活性。检测线性范围为40 n M–2 m M,灵敏度为480.97 m A m M-1 cm-2,检测限为8.6 n M(S/N=3),并能应用到啤酒样品中的检测。

关键词：重金属离子纳米金石墨烯生物条形码电化学dna传感器

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电化学方法分析14-3-3c和g基因在转基因烟草中的表达与功能

电化学方法分析14-3-3c和g基因在转基因烟草中的表达与功能

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作者：郭红霞昆明理工大学

学位级别：硕士

14-3-3蛋白是植物细胞内蛋白质间相互作用的核心,14-3-3蛋白通过与靶蛋白结合从而调节各种生命活动,广泛参与植物体内物质运输、生长发育、营养代谢、细胞周期、胁迫应答及光信号传导途径等生理过程的调控。生物和非生物胁迫刺激不仅改... 详细信息

14-3-3蛋白是植物细胞内蛋白质间相互作用的核心,14-3-3蛋白通过与靶蛋白结合从而调节各种生命活动,广泛参与植物体内物质运输、生长发育、营养代谢、细胞周期、胁迫应答及光信号传导途径等生理过程的调控。生物和非生物胁迫刺激不仅改变植物中编码14-3-3蛋白基因的转录和蛋白表达水平,同时还改变14-3-3蛋白与靶蛋白的相互作用。很多研究证实14-3-3蛋白可通过调控抗氧化酶基因的表达来影响其活性。此外,14-3-3蛋白还通过与代谢酶的互作对碳和氮代谢进行调控。植物体内14-3-3蛋白由多基因编码,不同14-3-3基因在功能上有其特异性。因此,要考察植物体内不同14-3-3基因的功能时不仅要分析14-3-3基因的表达水平,还需要考察14-3-3蛋白调控靶蛋白表达水平的变化。目前在科研和诊断中检测基因转录水平多采用RT-PCR,检测蛋白表达水平多采用Western Blot,但这些方法都存在着各自的不足,荧光定量PCR仪在使用过程中运行成本较高,无论是仪器还是耗材的成本都不低;Western Blot分析方法在操作时往往存在操作繁琐、检测限低等不足。电化学分析方法具有选择性好、样品不需预处理、可实现连续在线监测、测定成本远低于大型分析仪器等优点。本论文构建高灵敏性的电化学dna传感器和电化学免疫传感器,对本实验室之前获得的转基因烟草中14-3-3c和14-3-3g及其调控靶蛋白基因的转录和蛋白表达水平进行分析,考察14-3-3c和14-3-3g在烟草应答甲醛胁迫中的作用,主要研究结果如下:1、基于碱基互补配对原理利用丝网印刷电极构建dna传感器,通过壳聚糖把碳纳米管和单链dna探针固定在工作电极表面,在适宜的条件下与溶液中的互补序列进行杂交形成双链dna,然后利用电化学方法检测杂交前后的电化学信号的变化,检测不同浓度的目标序列。结果说明目标序列浓度在0.5-1μmol/L范围内时,DPV曲线的峰电流值与目标序列浓度呈良好的线性关系,线性回归方程为y=-8.225x+34.84(R2=0.836)。从转基因烟草叶片中提取总RNA,与电极片上的单链dna探针进行杂交反应,检测14-3-3c和g基因的转录水平,结果说明与WT相比,14-3-3c(ic4)和14-3-3g(ig2)的RNAi干扰表达植株中这两个基因的转录水平分别下降62.5%和67.4%;14-3-3c(kc1)和14-3-3g(kg2)的过量表达植株中14-3-3c和g基因的转录水平分别上升46.5%和36.8%。这个结果与RT-PCR分析结果相一致,使用该方法进行检测时,无需将所提的RNA反转成cdna,相比RT-PCR节约了时间和成本。2、基于抗原和抗体间的高度特异性结合的原理,利用丝网印刷电极构建14-3-3蛋白的电化学免疫传感器,实现14-3-3蛋白的定量检测。在64 ng/m L到2000ng/ml浓度区间,IT曲线的电流峰值与14-3-3蛋白浓度呈现良好的线性关系,线性回归方程为:y=1.0113x+582.34(R2=0.9986),而Western Blot分析检测限只能达到μg/ml级别。利用14-3-3蛋白的电化学免疫传感器对转基因烟草中14-3-3蛋白表达水平进行定量检测,结果说明与WT相比,在ic4和ig2植株中14-3-3c和g蛋白的表达量分别下降54.7%和23.7%;在kc1和kg2植株中14-3-3c和g蛋白的表达量分别上升27.7%和27.8%。检测结果与传统的Western Blot方法检测结果相一致,但该方法灵敏度高、成本低且耗时少。3、利用电化学dna传感器对14-3-3转基因烟草叶片抗氧化酶和甲醛代谢相关酶基因的转录水平进行定量分析,结果说明与WT相比,在14-3-3c和g的干扰表达植株中,APX转录水平分别上升28.4%和24.8%;CAT转录水平分别上升30.1%和25.7%;MnSOD转录水平分别上升17.7%和12.9%;Cu/ZnSOD转录水平分别上升7.4%和4.6%;POD转录水平分别上升12.9%和8.6%。14-3-3c和g的干扰表达植株中APX转录水平分别下降48.6%和15.9%;CAT转录水平分别下降85.5%和25.9%;MnSOD转录水平分别下降81.6%和51.8%;Cu/ZnSOD转录水平分别下降93.8%和23.2%;POD转录水平分别下降73.9%和64.2%。苹果酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的转录水平与野生型相比,没有显著性差异,表明14-3-3c和g基因调控烟草甲醛代谢途径可能不通过转录水平实现。通过C-NMR分析结果证实在甲醛胁迫下14-3-3c的上调表达使转基因烟草叶片甲醛代谢产生更多的糖类物质和氮转运氨基酸,而干扰该基因的表达则抑制糖类物质和氮转运氨基酸的合成;干扰14-3-3g的表达抑

关键词：烟草14-3-3基因丝网印刷电极电化学dna传感器电化学免疫传感器

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