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中华妇产科杂志 2023年第12期58卷 911-921页

作者：熊正花刘贝贝杨琳娟李芹金文娇向梦妮代荣芬陈佳韩雪松昆明医科大学第一附属医院妇科，昆明　650032 云南省保山市中医医院妇产科，保山　678000 昆明医科大学附属延安医院妇科，昆明　650051

目的:构建宫腔粘连动物模型，并探讨低氧处理骨髓间充质干细胞（BMSC）及其来源的外泌体（BMSC-exo）对子宫内膜损伤的修复作用。方法:在常规氧（21%O 2）或低氧（1%O 2）条件下培养从大鼠股骨中提取的BMSC及其BMSC-exo。采... 详细信息

目的:构建宫腔粘连动物模型，并探讨低氧处理骨髓间充质干细胞（BMSC）及其来源的外泌体（BMSC-exo）对子宫内膜损伤的修复作用。方法:在常规氧（21%O 2）或低氧（1%O 2）条件下培养从大鼠股骨中提取的BMSC及其BMSC-exo。采用刮宫+脂多糖宫腔内注射双重损伤的方法对40只健康雌性SD大鼠进行宫腔粘连建模，并于建模第28天，将40只模型大鼠采用随机数字表法随机分为5组（每组各8只），并进行干预：（1）NC组：每侧宫腔注射0.2 ml磷酸盐缓冲液;（2）BMSC组：每侧宫腔注射0.2 ml浓度1×10 6/ml常规氧培养的BMSC;（3）L-BMSC组：每侧宫腔注射0.2 ml浓度1×10 6/ml低氧培养的BMSC;（4）BMSC-exo组：每侧宫腔注射0.2 ml浓度500 μg/ml常规氧培养的BMSC-exo;（5）L-BMSC-exo组：每侧宫腔注射0.2 ml浓度500 μg/ml低氧培养的BMSC-exo。分别于治疗第14、28天，采用麻醉后颈椎脱臼法各处死每组大鼠4只，取子宫内膜组织，进行HE和Masson染色观察计算子宫内膜的腺体数量和纤维化情况，蛋白印迹法（western blot）检测大鼠子宫内膜组织中血管生成相关细胞因子［血管内皮生长因子A（VEGFA）、CD 31］和纤维化相关蛋白［胶原蛋白Ⅰ（collagen-Ⅰ）、胶原蛋白Ⅲ（collagen-Ⅲ）、平滑肌肌动蛋白α（α-SMA）、转化生长因子β1（TGF-β1）］的表达情况。结果:（1）HE和Masson染色结果显示，治疗第14、28天，与NC组相比，L-BMSC组、BMSC-exo组和L-BMSC-exo组宫腔粘连模型大鼠子宫内膜腺体数量均增加、子宫内膜纤维化面积均减少（ P均<0.05），且L-BMSC-exo组较BMSC-exo组变化显著（ P均<0.05），BMSC-exo组较BMSC组变化显著（ P均<0.05）。（2）western blot检测纤维化相关蛋白（collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1）表达结果显示，治疗第14、28天时，与NC组相比，BMSC组、L-BMSC组、BMSC-exo组和L-BMSC-exo组collagen-Ⅲ、TGF-β1的表达均降低（ P均<0.05）。随着治疗时间的延长，纤维化相关蛋白表达情况不同，治疗第28天，与BMSC组相比，BMSC-exo组和L-BMSC组collagen-Ⅲ、α-SMA和TGF-β1的表达均降低（ P均<0.05）;且L-BMSC-exo组collagen-Ⅲ和TGF-β1的表达均较BMSC-exo组更低（ P均<0.05）;L-BMSC-exo组collagen-Ⅰ、α-SMA和TGF-β1的表达均较L-BMSC组更低（ P均<0.05）。（3）western blot检测血管生成相关细胞因子（VEGFA、CD 31）表达的结果显示，治疗第14、28天时，与NC组相比，BMSC组、L-BMSC组、BMSC-exo组和L-BMSC-exo组VEGFA、CD 31的表达均升高（ P均<0.05）。治疗第28天，与BMSC组相比，BMSC-exo组VEGFA和CD 31的表达以及L-BMSC组CD 31的表达均升高（ P均<0.05）;且L-BMSC-exo组VEGFA和CD 31的表达均较BMSC-exo组和L-BMSC组更高（ P均<0.05）。结论:低氧处理的BMSC及其BMSC-exo均能促进宫腔粘连模型大鼠子宫内膜腺体增生，抑制纤维化，促进子宫内膜血管生成，进一步修复受损的子宫内膜。低氧处理的BMSC-exo对宫腔粘连模型大鼠具有更好的治疗效果。

关键词：间质干细胞外泌体组织粘连子宫疾病疾病模型，动物治疗结果低氧大鼠

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动物疾病模型的建立在腹腔镜技术培训中的应用

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腹腔镜外科杂志 2013年第9期18卷 714-716页

作者：任秋英狄长安张卫国首都医科大学附属北京平谷区医院北京101200

目的:研究动物模型的建立在腹腔镜技术培训中的应用。方法:回顾总结来自全国各地基层医院的412名外科医师进行7 d外科腹腔镜技术培训的资料,对比分析培训期间采用活体动物建立疾病模型实体操作前后的技术水平。结果:腹腔镜胆囊切除术培... 详细信息

目的:研究动物模型的建立在腹腔镜技术培训中的应用。方法:回顾总结来自全国各地基层医院的412名外科医师进行7 d外科腹腔镜技术培训的资料,对比分析培训期间采用活体动物建立疾病模型实体操作前后的技术水平。结果:腹腔镜胆囊切除术培训后优于培训前(P<0.05),腹腔镜穿孔缝合修补速度明显高于培训前(P<0.05)。结论:使用活体动物模型进行外科腹腔镜技术培训可取得理想的培训效果,值得推广。

关键词：腹腔镜检查疾病模型，动物教育，专业，再培训

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缺血预处理通过减轻内质网应激保护全脑缺血大鼠

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国际脑血管病杂志 2013年第8期21卷 618-623页

作者：缪亦锋邱永明张晓华上海交通大学医学院附属仁济医院神经外科 200032 南京医科大学附属无锡市第二人民医院神经外科 214002

目的探讨抑制内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在缺血预处理诱导脑缺血耐受中的作用。方法120只成年雄性Sprague—Dawley大鼠，随机分为假手术组、全脑缺血组和缺血预处理组（缺血预处理3min，2d后全脑缺血15min），设1... 详细信息

目的探讨抑制内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在缺血预处理诱导脑缺血耐受中的作用。方法120只成年雄性Sprague—Dawley大鼠，随机分为假手术组、全脑缺血组和缺血预处理组（缺血预处理3min，2d后全脑缺血15min），设1、3和7d共3个时间点。应用Sugawara法观察大鼠行为学变化，TUNEL染色观察皮质神经元凋亡情况，免疫荧光染色和蛋白质印迹分析检测ERS相关蛋白CHOP、GRP78和胱天蛋白酶-12表达情况。结果神经行为学评分显示，假手术组无神经功能缺损，全脑缺血组和缺血预处理组均出现明显的神经功能缺损，而且随着时间推移出现逐步改善，但全脑缺血组在模型制作后各时间点的神经功能评分均显著性低于缺血预处理组：1d时：（11．00±0．63）分对（14．33±0．33）分（t=21．74，P=0．001）；3d时：（12．17±0．31）分对（15．17±0．48）分（t=27．93，P=0．000）；7d时：（14．67±0．49）分对（16．33±0．33）分（t=7．81，P=0．020）。TUNEL染色显示，缺血后7d时，假手术组、全脑缺血组和缺血预处理组每娜奇TUNEL染色阳性细胞计数分别为（4．83±1．85）个、（395．67±43．43）个和（146．17±27．38）个（F=23．62，P=0．001），缺血预处理组显著性低于全脑缺血组（P=0．001）。免疫荧光染色显示，缺血后7d时，缺血预处理组CHOP[（26．50±3．89）个对（82．33±4．25）个；P=0．000]、GRP78[（15．00±2．02）对（35．67±2．99）个；P=0．000]和胱天蛋白酶一12[（22．33±2．76）个对（66．50±7．25）个；P=0．000]阳性细胞数量均显著性少于全脑缺血组。蛋白质印迹法显示，缺血后7d时，缺血预处理组CHOP[（1．22±0．38）对（3．22±0．51）；t=24．50，P=0．001]、GRP78[（1．78±0．45）对（3．16±0．76）；t=14．29，P=0．005]和胱天蛋白酶-12[（2．89±0．53）对（5．96±0．67）；t=77．73；P=0．000]表达显著性低于全脑缺血组。结论缺血预处理对第2次致死性缺血表现出神经保护作用，其机制可能与ERS减轻，ERS相关蛋白表达下调有关。

关键词：脑缺血缺血预处理内质网转录因子CHOP 分子伴侣GRP78 胱天蛋白酶12 细胞凋亡疾病模型，动物大鼠

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永久性大脑中动脉闭塞大鼠梗死周围组织p-Akt(Ser473)、p-Bad(Ser136)表达与细胞凋亡

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国际脑血管病杂志 2013年第8期21卷 624-629页

作者：何敏韩江全倪白云张险平芜湖市第一人民医院神经内科 241000 遵义医学院第五(珠海)附属医院神经内科珠海519100

目的探讨永久性大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠脑梗死周围组织P—Akt（Ser473）、p-Bad（Serl36）表达的变化及其与细胞凋亡关系。方法60只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术、MCAO3h、MCAO12h、LY294002干预MCAO3h和LY294002干预MCAO12h组，每组12只。改良线栓法制作永久性MCAO模型，LY294002干预组在模型制作前15n血经侧脑室给药。采用Longa法进行神经功能评分，氯化三苯基四氮唑（2,3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）法检测梗死体积，免疫组织化学染色法检测梗死周围组织p-Akt（Ser473）和p-Bad（Serl36）表达，TUNEL法检测梗死周围组织凋亡细胞。结果模型制作后3h，所有实验大鼠均从麻醉中清醒。假手术组神经功能缺损评分为0分，MCAO3h组、MCAO12h组、LY294002干预MCAO3h组和LY294002干预MCAO12h组分别为（2．25±0．45）、（2．92±0．99）、（3．00±0．95）和（3．02±0．36）分，各组间存在显著性差异（F=26．520，P=0．000）。其中，LY294002干预MCAO3h组显著性高于MCAO3h组（P=0．009），LY294002干预MCAO12h组与MCAO12h组无显著性差异（P=0．354）。TTC染色显示，假手术组未见梗死灶，MCAO3h组、MCAO12h组、LY294002干预MCAO3h组和LY294002干预MCAO12h组梗死体积分别为（23．4±1．4）、（40．3±1．1）、（31．9±6．0）和（44．4±3．8）mm2，各组间存在显著性差异（F=30．440，P=0．000）。其中，LY294002干预MCAO3h组显著性大于MCAO3h组（P=0．002），LY294002干预MCAO12h组与MCAO12h组无显著性差异（P=0．113）。与假手术组相比，MCAO3h组梗死周围组织p-Akt（Ser473）表达显著性增高，MCAO12h组显著性下降；p-Bad（Ser136）表达水平随着MCAO时间的推移呈现进行性下降，同时凋亡细胞数量进行性增多。LY294002干预后，MCAO3h时梗死周围组织p-Akt（Ser473）和p-Bad（Ser136）表达水平均显著性下降，凋亡细胞数量显著性增多（P〈0．05），但对MCAO后12h时的各指标无显著性影响。结论脑梗死早期P13K／Akt信号转导通路的激活以及该通路关键蛋白p-Akt（Ser473）的应激性升高具有脑保护作用，而脑梗死后期该通路活性的衰竭及其关键蛋白的急剧降低则与脑损伤有关。

关键词：脑缺血蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶磷脂酰肌醇3-激酶类 bcl-死亡相关蛋白原癌基因蛋白质c akt 细胞凋亡疾病模型，动物大鼠

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Aktl在颞叶癫痫大鼠海马中的表达变化

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中国现代神经疾病杂志 2012年第5期12卷 581-588页

作者：林慧慧刘艳青刘淼李江丽宋毅军天津医科大学天津医科大学研究生院天津医科大学总医院神经内科

目的研究颞叶癫痼模型海马区神经元Aktl表达变化，探讨其在癫痫发生发展中的作用。方法采用氯化锂．匹罗卡品方法制备颞叶癫痴大鼠模型，Westernblotting检测海马区总蛋白、Quantitvone软件行灰度值分析；免疫组织化学染色观察海马各区A... 详细信息

目的研究颞叶癫痼模型海马区神经元Aktl表达变化，探讨其在癫痫发生发展中的作用。方法采用氯化锂．匹罗卡品方法制备颞叶癫痴大鼠模型，Westernblotting检测海马区总蛋白、Quantitvone软件行灰度值分析；免疫组织化学染色观察海马各区Aktl蛋白表达变化，计数不同处理组阳性神经元数目。结果Westernblotting检测结果显示，与正常对照组相比，癫痫模型组大鼠于癫痫持续状态发作即刻海马区Aktl蛋白表达升高（t=2．445，P=0．034），并于第30天时达峰值水平（}=1．214，P=0．002），发作后24h表达水平迅速降低，并低于正常值范围（t=4．294，P=0．000），其余各测量时间点表达无明显改变；与氯化锂组相比，癫痼模型组大鼠于癫痫持续状态后1h海马区Aktl蛋白表达开始降低，24h降至最低水平（t：4．134，P=0．000），至发作48h后开始逐渐升高（t=2．481，P=0．002），并于发作第7天时升至氯化锂组水平。免疫组织化学染色显示，癫痫持续状态发作后海马CA3区Aktl蛋白表达阳性神经元数目立即增加，12h达高峰（t=16．586，P：0．000），48h减少并降至正常值水平（t=0．357，P=0．089），发作后第10天再次增加（t=3．123，P=0．000），于第30天时阳性神经元数目再次达峰值水平（t=18．339，P=0．000），第50天开始恢复至正常值水平（t=3．219，P=0．000）；氯化锂组仅海马CA3区Aktl蛋白表达于实验初始（0h）升高并高于正常对照组（P〈0．05），海马CA1和CA2区Aktl蛋白表达变化组间差异均无统计学意义（P〉O．05）。结论海马及海马CA3区Aktl蛋白表达均呈现癫疝持续状态后升高、降低、再升高的动态过程，提示可能存在神经元保护作用，对抗细胞凋亡、促进细胞存活。

关键词：蛋白激酶类海马癫痫免疫印迹法免疫组织化学疾病模型，动物

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APP／PSL双转基因老年性痴呆小鼠早期病理和认知行为变化

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广州中医药大学学报 2012年第2期29卷 193-196页

作者：朱斌陈静邓汝东孥伊为黎辉周健洪张赛霞宋述财陈云波魏刚陈东风广州中医药大学解剖学教研室广州中医药大学临床药理研究所DME中心广州中医药大学新药开发研究中心

【目的】探讨APP／Psl双转基因老年性痴呆（Alzheimer’s disease，AD）模型小鼠早期病理和行为学变化。【方法】选取5、7月龄的APP／Psl双转基因小鼠和非转基因小鼠，采用刚果红染色法和定量方法，并结合Morris水迷宫行为学测试，对其... 详细信息

【目的】探讨APP／Psl双转基因老年性痴呆（Alzheimer’s disease，AD）模型小鼠早期病理和行为学变化。【方法】选取5、7月龄的APP／Psl双转基因小鼠和非转基因小鼠，采用刚果红染色法和定量方法，并结合Morris水迷宫行为学测试，对其脑内淀粉样斑块积聚与学习记忆能力的月龄变化关系进行研究。【结果】（1）7月龄的双转基因组小鼠的空间辨别学习记忆能力与非转基因组小鼠比较差异有统计学意义（P〈0．05）；（2）APWPSl双转基因组小鼠在5、7月龄时海马与脑皮质均观察到明显的橘红色斑块沉积，但非转基因组小鼠海马及脑皮质均未观察到淀粉样斑块沉积。【结论】7月龄APP／PSl双转基因小鼠的学习记忆能力下降，APP／PSl双转基因小鼠大脑皮层和海马部位淀粉样斑块的早期出现随年龄依赖性增加。

关键词：阿尔茨海默病脑／病理学认知行为疾病模型，动物 APP／PSl双转基因小鼠

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作者：荣赟天津医科大学

学位级别：硕士

目的：本研究利用裸鼠建立人宫颈癌动物模型,通过测定肿瘤组织中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X蛋白质(Bax)蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白的表达情况,探讨内皮抑素重组腺相关病毒(rAAV-ES)对人宫颈癌HeL... 详细信息

目的：本研究利用裸鼠建立人宫颈癌动物模型,通过测定肿瘤组织中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X蛋白质(Bax)蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白的表达情况,探讨内皮抑素重组腺相关病毒(rAAV-ES)对人宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其机制。方法：选择雌性性成熟裸鼠60只,采用左腋皮下接种法,建立人宫颈癌裸鼠模型。造模1周后,将成模的裸鼠模型60只随机分成3组：磷酸盐缓冲液(PBS)对照组,空病毒组和rAAV-ES实验组,每组20只。给药方法：①对照组：接种PBS0.1 mL。②空病毒组：接种5×1010v.g的rAAV0.1 mL。③实验组：接种5×1010v.g的rAAV-ES0.1 mL。均分别瘤内及瘤周注射。隔日观察并记录各组裸鼠皮下移植瘤的生长情况,计算肿瘤体积。治疗3周后颈椎脱臼处死裸鼠,完整剥离肿瘤,称瘤质量并计算抑瘤率。HE染色观察肿瘤细胞形态,应用免疫组织化学技术检测各组肿瘤组织中Bcl-2, Bax和Caspase-3蛋白的表达情况。结果：(1)成功建立人宫颈癌裸鼠模型,成瘤率为100%。 (2) rAAV-ES组治疗后肿瘤生长速度较对照组和空病毒组明显减慢(P<0.001),抑瘤率为62.55%。治疗初期,各组的肿瘤体积差异无统计学意义(均P>0.05),治疗14d和21d时rAAV-ES组肿瘤体积均小于对照组和空病毒组,差异有统计学意义(均P<0.01)。HE染色显示rAAV-ES组肿瘤细胞平均坏死率显著高于对照组及空病毒组(均P<0.01),而对照组和空病毒组间差异无统计学意义(P>0.05)；同时rAAV-ES组中出现明显的细胞凋亡形态学改变,细胞胞质萎缩,核染色质高度聚集,凋亡小体形成,呈散在分布,周围无炎性细胞浸润。 (3)免疫组化显示Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白阳性表达均主要定位于宫颈癌细胞的胞质内,呈棕黄色颗粒。给予治疗后,Bcl-2在rAAV-ES组的阳性率(35%)显著低于空病毒组(85%)和PBS对照组(80%)(均P<0.01)；Bax在rAAV-ES组的阳性率与其他两组比较无明显改变(均P>0.05)；Caspase-3在rAAV-ES组的阳性率(70%)显著高于显著高于空病毒组(25%)和PBS对照组(20%)(均P<0.01)；Bcl-2与Caspase-3蛋白表达呈负相关(r=-0.653,P<0.01)。结论：(1)选择裸鼠建立人宫颈癌动物模型,是一种方便、可靠的方法,成瘤率高,动物种系与人接近,所得实验结果具有参考价值。 (2)经rAAV-ES治疗后,动物模型移植瘤体积较对照组和空病毒组明显缩小,肿瘤细胞平均坏死率显著增高,且出现明显的细胞凋亡形态学改变。 (3) rAAV-ES治疗后肿瘤组织内Bcl-2的表达明显降低,Caspase-3的表达明显增高。抑制肿瘤生长和诱导凋亡的作用不是空病毒的作用,而是内皮抑素基因治疗的结果。 (4) rAAV-ES可抑制宫颈癌移植瘤的生长,其机制可能与下调Bcl-2蛋白、激活下游的Caspase-3诱导细胞凋亡有关。内皮抑素基因治疗有望成为一种治疗宫颈癌的新方法。

关键词：内皮抑素类基因，Bcl-2 Bcl-2相关X蛋白质半肌氨酸天冬氨酸蛋白酶3 宫颈肿瘤疾病模型，动物小鼠，裸

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TRPV1受体与偏头痛关系的实验研究

TRPV1受体与偏头痛关系的实验研究

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作者：熊文萍山东大学

学位级别：硕士

背景偏头痛是一种常见的原发性头痛,表现为反复发作单侧或双侧搏动性头痛伴发作时常伴有植物神经系统症状,如恶心、呕吐、面色苍白、心率加快、呼吸增快、胃肠道功能紊乱等。迄今为止,偏头痛的确切发病机制尚不清楚,我们发现采用结扎脑... 详细信息

背景偏头痛是一种常见的原发性头痛,表现为反复发作单侧或双侧搏动性头痛伴发作时常伴有植物神经系统症状,如恶心、呕吐、面色苍白、心率加快、呼吸增快、胃肠道功能紊乱等。迄今为止,偏头痛的确切发病机制尚不清楚,我们发现采用结扎脑膜中动脉和或颞浅动脉、岩浅大神经切断术可有效治疗顽固性偏头痛,表面硬脑膜的血管及支配的神经参与偏头痛的发病过程,但具体机制不明。但是三叉神经血管系统在偏头痛的过程中起重要作用：分布在硬脑膜及脑膜血管的三叉神经传入神经纤维感受刺激后,通过三叉神经节的中枢突传入三叉神经核,随后进入下丘脑及大脑皮质,产生痛觉。硝酸甘油(nitroglycerin, NTG)偏头痛模型的建立为阐明偏头痛的发生机制提供了有效手段。硝酸甘油在体内转化为NO,能够诱发健康志愿者和偏头痛患者头痛发作。偏头痛的发生确切机理以及它是通过哪些介质引起疼痛目前尚不明。分布在三叉神经感觉通路的电位香草酸亚1 (transient receptor potential vanilloid subfamily member 1, TRPV1)受体受到广泛关注,它是存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的非选择性阳离子通道蛋白,已经有学者证明TRPVl受体存在于人类和大鼠的三叉神经节中,能被辣椒辣素或其同类化学物、低PH、高温(43℃)激活。最近研究表明：分布在硬脑膜血管平滑肌的Artemin以及N0通过S-硝基化半胱氨酸激活此受体。TRPVl受体在痛觉的产生及痛觉敏感性增强的病理过程扮演重要角色。目的我们利用硝酸甘油诱导的偏头痛模型,检测瞬时感受器电位香草酸亚1(TRPVl)的基因及蛋白在三叉神经节和硬脑膜的表达,探讨TRPV1受体是否参与硝酸甘油诱导的偏头痛过程以及结扎脑膜中动脉治疗偏头痛的机理。方法成年雌性Wistar大鼠24只,按随机数字法分为硝酸甘油模型组和生理盐水对照组。模型组大鼠颈部皮下注射硝酸甘油(10 mg/kg);对照组在相同部位注射等量生理盐水(0.9%)。随后观察大鼠行为表现,分别于注射药物1 h、2 h、4h和8h取出大鼠双侧的三叉神经节及硬脑膜,采用RT-PCR、Western Blot及间接免疫荧光法检测TRPV1受体表达。结果对照组各时间点三叉神经节均可见TRPV1受体基因及蛋白的表达,但各时间点相对表达无显著差异(P>0.05)；模型组三叉神经节TRPV1受体1 h、2 h mRNA和蛋白相对表达量与对照组比较下调,而4h、8h表达升高(P<0.05)；模型组三叉神经节TRPV1受体8h表面蛋白相对表达量高于对照组(P<0.05)；间接免疫荧光显示模型组硬脑膜8h TRPV1受体表达高于对照组。结论 TRPV1受体在硝酸甘油诱导的偏头痛模型中表达变化,提示其参与偏头痛的病理过程,抑制或拮抗TRPV1受体将是治疗偏头痛的新思路。

关键词：偏头痛 TRPV1受体硝酸甘油疾病模型，动物三叉神经节

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大鼠中耳炎细菌生物膜模型的建立及其组织形态学的观察

大鼠中耳炎细菌生物膜模型的建立及其组织形态学的观察

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作者：杨名保暨南大学

学位级别：硕士

急性中耳炎(acute otitis media,AOM)是儿童期发病仅次于上呼吸道感染的最常见的感染性疾病,其中最困扰临床的是复发性AOM和顽固性AOM,据统计,约20%-30%的儿童罹患复发性AOM,且这一数据还在逐年增加。频繁的中耳感染不仅会引起患儿鼓室... 详细信息

急性中耳炎(acute otitis media,AOM)是儿童期发病仅次于上呼吸道感染的最常见的感染性疾病,其中最困扰临床的是复发性AOM和顽固性AOM,据统计,约20%-30%的儿童罹患复发性AOM,且这一数据还在逐年增加。频繁的中耳感染不仅会引起患儿鼓室硬化、粘连性中耳炎以及中耳胆脂瘤,从而导致患儿听力进行性下降,甚至会影响到语言的发育。然而,其确切发病机制、抗生素耐药机理以及反复发作的原因等至今仍不清楚。自2001年Post等首次在分泌性中耳炎的发病机制中提出细菌生物膜的致病理论以来,细菌生物膜与中耳炎的关系迅速成为学者们关注的焦点,但目前文献多侧重于研究细菌生物膜和分泌性中耳炎的关系。2009年,Reid等和Hoa等分别在不同的粟鼠AOM动物模型上观察到有细菌生物膜的存在,但细菌生物膜在AOM中的形成特点、是否参与AOM的发病过程以及临床意义等,仍有待深入研究。基于此,我们设计了本课题。研究分两个部分进行,在第一部分研究中,我们探讨了通过听泡穿刺、将肺炎链球菌注入到大鼠中耳腔建立大鼠AOM模型的可行性,并通过观察其病理变化和病程,探讨了该模型的应用价值,以期为后续的深入研究提供基础资料。研究证实,将50ul肺炎链球菌悬液(1×108CFU/ml)经听泡穿刺注入到大鼠中耳腔建立了急性中耳炎的大鼠模型,成功率100%,是研究人类中耳炎较为理想的动物模型,不仅可用于急性化脓性中耳炎的研究,也可用于急性分泌性中耳炎的研究。在成功建立了急性中耳炎大鼠模型的基础上,我们进行了第二部分的研究,采用扫描电镜并结合免疫荧光原位标记技术、激光扫描共聚焦显微镜来研究细菌生物膜在急性中耳炎大鼠中耳腔的形成及其临床意义,并探讨大鼠AOM动物模型用于细菌生物膜研究的可行性。研究发现,细菌生物膜在中耳急性感染的早期即已开始形成,并可能成为日后炎症反复发作或迁延不愈的原因,早期及时应用抗生物膜药物有助于感染的彻底根除,本研究建立的大鼠急性中耳炎模型是研究细菌生物膜较为理想的动物模型。

关键词：细菌生物膜中耳炎，急性肺炎链球菌免疫荧光技术激光扫描共聚焦显微镜大鼠疾病模型，动物

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流感嗜血杆菌形成生物被膜与慢性阻塞性肺疾患急性发作相关性的研究

流感嗜血杆菌形成生物被膜与慢性阻塞性肺疾患急性发作相关性的研...

引用

作者：王东中国人民解放军军医进修学院

学位级别：博士

【目的】观察流感嗜血杆菌体外生物被膜的形成,并测定氟喹诺酮类药物莫西沙星、加替沙星、左氧氟沙星和环丙沙星对流感嗜血杆菌生物被膜的影响。在体外实验的基础上,依次建立金黄地鼠肺气肿模型和慢性阻塞性肺病急性发作模型,检测体内... 详细信息

【目的】观察流感嗜血杆菌体外生物被膜的形成,并测定氟喹诺酮类药物莫西沙星、加替沙星、左氧氟沙星和环丙沙星对流感嗜血杆菌生物被膜的影响。在体外实验的基础上,依次建立金黄地鼠肺气肿模型和慢性阻塞性肺病急性发作模型,检测体内生物被膜的形成,并进一步观察莫西沙星对慢性阻塞性肺病急性发作动物模型体内流感嗜血杆菌生物被膜的影响。【方法】（1）从慢性阻塞性肺病急性发作患者痰液中分离流感嗜血杆菌,采用结晶紫法和扫描电镜观察流感嗜血杆菌体外生物被膜的形成。（2）微量肉汤稀释法测定不同药物对流感嗜血杆菌的最低抑菌浓度,观察氟喹诺酮类药物对流感嗜血杆菌生物被膜形成和破坏的影响,以及莫西沙星对生物被膜内细菌的杀菌作用。（3）采用气管内注入弹性蛋白酶法建立金黄地鼠肺气肿模型,制作流感嗜血杆菌琼脂小珠,将其注入肺气肿动物肺内建立慢性阻塞性肺病急性发作的动物模型,测定随时间延长肺组织炎症程度和菌落计数的变化,利用扫描电镜观察气道表面生物被膜的形成。（4）气管内注入流感嗜血杆菌建立慢性阻塞性肺病急性发作动物模型,观察莫西沙星治疗后,肺组织病理和气道表面生物被膜的变化,同时测定炎症因子和菌落计数的改变。【结果】（1）从慢性阻塞性肺病急性发作患者痰液中分离得到流感嗜血杆菌临床株可在体外培养24-48小时形成成熟、致密、典型的生物被膜,不同菌株形成生物被膜的能力有所不同,扫描电镜可在固相支持物表面见到由大量细菌和其分泌的胞外粘质形成的模样结构,并可见到粘液丝和孔道结构。（2）流感嗜血杆菌对氟喹诺酮类、阿奇霉素、氨苄西林、头孢噻肟和利福平敏感,氟喹诺酮药物可在体外抑制流感嗜血杆菌生物被膜的形成,并有一定的破坏作用;其中莫西沙星随药物浓度的升高,生物被膜吸光度值逐渐降低,4mg/L以上浓度的药物可明显减轻生物被膜程度;另外莫西沙星对处于生物被膜内的细菌仍有强大的清除作用,在0.25mg/L以上浓度膜内活菌数明显减少,细菌清除作用呈剂量效应关系。扫描电镜也证实莫西沙星可明显减轻生物被膜的程度。（3）成功建立肺气肿动物模型,病理学检查可见到肺泡结构紊乱,肺泡大小不等,肺泡管、肺泡囊和肺泡明显扩张,肺泡壁变薄,肺泡间隔不同程度的断裂,肺泡腔融合增大,部分融合成肺大泡,符合全小叶型肺气肿,与正常组相比,模型组的肺泡数/视野明显减少,平均肺泡面积和平均内衬间隔明显增大（P＜0.01）。在此基础上,经气管注入流感嗜血杆菌构建慢性阻塞性肺病急性发作的动物模型,随时间延长,肺气肿动物肺内炎症持续存在;肺泡灌洗液中活菌计数结果显示,与正常动物感染相比,感染后1-3周内,灌洗液中细菌数明显较高(104.14±0.26 vs.102.47±0.31,P＜0.05);肺组织匀浆活菌计数结果显示,正常动物注入细菌后细菌数逐渐减少,3周后没有分离到细菌,而模型动物感染后,细菌得不到清除,1-3周内均可分离出较多的细菌（P＜0.05）;扫描电镜观察,3周后在气道表面形成生物被膜样结构。（4）莫西沙星可有效治疗流感嗜血杆菌感染所致的肺气肿动物的急性发作,镜下可见到炎症程度减轻;1周后血浆中炎性因子水平明显降低（P＜0.05）,支气管肺泡灌洗液中炎性因子水平也有不同程度降低,其中IL-8水平早期就有明显减少;菌落计数结果显示,1周内灌洗液中没有分离到活菌,肺组织匀浆中活菌数也明显下降（P＜0.05）,3周后,细菌数量均再次恢复;但扫描电镜没有发现生物被膜样结构。此外,莫西沙星对气管内放置的硅胶管表面形成的生物被膜也有抑制作用,表现为用药后硅胶管表面分离的细菌数较少（P＜0.05）,扫描电镜也发现在莫西沙星作用下硅胶管表面无法形成成熟的生物被膜,仅见散在的细菌粘附于管壁上,个别有细菌的散在团状聚集,但尚未融合呈膜状。【结论】从慢性阻塞性肺病急性发作患者痰中分离的流感嗜血杆菌可在体外形成典型的生物被膜;通过细菌感染肺气肿动物模型可建立慢性阻塞性肺病急性发作的动物模型,并且随时间延长,细菌数量仍维持在较高水平,同时在气道表面可找到体内生物被膜形成的证据。结合体内外实验的结果,可认为下呼吸道流感嗜血杆菌生物被膜的形成与慢性阻塞性肺病的急性发作密切相关,是导致感染反复出现、病情迁延、治疗效果不完全的重要机制之一。氟喹诺酮类药物对流感嗜血杆菌浮游菌以及生物被膜内的细菌均具有强大的杀菌作用,体外及动物体内研究提示,莫西沙星可作为对抗流感嗜血杆菌生物被膜感染的有效抗菌药物应用于慢性阻塞性肺病急性发作的治疗。

关键词：嗜血菌，流感喹诺酮类生物膜肺疾病，慢性阻塞性肺气肿疾病模型，动物

来源：评论

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