检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：刘欢中国农业科学院

学位级别：博士

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)自上世纪90年代报道以来,给世界养猪业造成了严重的经济损失。由于该病的病原PRRSV遗传变异快、并且能够导致被感染猪群出现持续性感染和免疫抑制现象,因而受... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)自上世纪90年代报道以来,给世界养猪业造成了严重的经济损失。由于该病的病原PRRSV遗传变异快、并且能够导致被感染猪群出现持续性感染和免疫抑制现象,因而受到研究人员的极大关注。随着PRRS疫苗的普遍应用,对预防和控制该病的流行发挥了重要作用。但是在免疫压力的作用下,一些新的高致病性PRRSV变异毒株又陆续出现。为了揭开PRRSV的神秘面纱,研究人员在PRRSV对宿主的致病机理与免疫机制等方面做了大量的研究,但是对于PRRSV病原本身的转录复制特性与致病的相关性尚未得到解析和阐明。因此,我们有必要从病毒的复制转录机制入手,分析PRRSV如何通过连续转录和不连续转录调控基因组RNA和亚基因组RNA合成之间的平衡,挖掘其转录调节因子和具体机制。为了建立PRRSV N蛋白的Western blot检测方法,本研究利用冷休克表达载体p Cold-I成功表达了PRRSV N蛋白。原核表达的蛋白经纯化和免疫BALB/c小鼠后,对PRRSV N蛋白进行Western blot和IFA检测。结果发现,本研究制备的多克隆抗体具有良好的免疫反应性和特异性,为本研究提供了坚实的实验基础。蛋白(N蛋白)的磷酸化修饰现象是套式病毒的共同特征之一。为建立N蛋白磷酸化位点鉴定方法,本研究利用Phos-tag技术成功实现了N蛋白磷酸化与非磷酸形式的分离。经Phos-tag SDS-PAGE凝胶电泳后,真核表达或者病毒本身的N蛋白能够出现2条特异性条带。运用免疫沉淀方法纯化和富集N-HA蛋白后,经牛小肠碱性磷酸酶(Calf intestinal alkaline phosphatase,CIP)处理后,N蛋白的磷酸化条带消失,说明N蛋白的磷酸化位点可能仅有1个。随后利用定点突变技术对N蛋白真核表达载体的丝氨酸位点进行单个突变或者利用基因合成方法将N蛋白的所有丝氨酸位点替换为丙氨酸作为阴性对照。结果发现,Ser120突变后,N蛋白的磷酸化形式消失,与阴性对照一致。说明PRRSV N蛋白的磷酸化位点为蛋白C末端的第120位丝氨酸。为了进一步研究N蛋白磷酸化对于病毒复制的影响,本研究采用反向遗传学方法,对PRRSV感染性cDNA克隆进行N蛋白磷酸化位点突变并成功拯救了病毒。结果发现,突变病毒在致细胞病变、空斑形态及N蛋白的亚细胞定位等均没有明显差异。而病毒的复制能力却稍微下降,多步生长曲线结果表明,在感染后的24-72 h,突变毒的复制水平比亲本毒低一个滴度左右。利用荧光定量方法检测亲本病毒与突变病毒在不同时间的基因组RNA和亚基因组RNA的转录水平,检测结果发现,在病毒感染的早期,突变毒的基因组RNA和长链亚基因组RNA的合成水平明显低于亲本毒,而突变毒的短链sgRNA却比亲本毒略高。这表明N蛋白的磷酸化对于病毒的感染性不是必需的,但是对病毒基因组RNA和亚基因组RNA的转录水平具有调控作用。PRRSV N蛋白不仅能够磷酸化,而且还能够与许多的宿主蛋白相互作用。为了探究N蛋白与宿主蛋白相互作用对病毒复制和转录的影响,本研究通过免疫共沉淀实验发现,PRRSV N蛋白能够与宿主细胞的RNA解旋酶DDX5相互作用,并且主要的相互作用部位处于病毒复制的细胞质。进一步利用截短表达实验发现,DDX5与N蛋白之间的相互作用部位为N-N端连接,这种连接作用不需要RNA的介导作用,但是RNA的存在有利于两种蛋白的结合。利用siRNA干扰方法发现,沉默宿主DDX5蛋白表达能够促进病毒的复制。进一步的研究发现,在病毒感染12 h后,病毒基因组RNA和长链亚基因组RNA的合成水平明显高于对照组,而短链亚基因组RNA没有明显区别。这一结果表明,DDX5在病毒复制过程具有负调控病毒长链RNA的转录过程。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白 DDX5 病毒转录磷酸化修饰

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猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控机制研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒转录调控机制研究

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作者：郑海红华南农业大学

学位级别：博士

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的一种传染病.PRRSV的基因表达是通过一系列亚基因组(sgmRNA)完成的,sgmRN... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的一种传染病.PRRSV的基因表达是通过一系列亚基因组(sgmRNA)完成的,sgmRNA的转录采用一种特有的不连续性转录(discontinuous transcription)机制.位于Leader末端及基因组各个ORF前的转录调控序列(Transcription-Regulating Sequence,TRS-L and TRS-B)在mRNA合成过程中起着重要作用,但其作用机制尚不清楚.在北美型PRRSV感染性克隆pAPPRS基础上,本研究通过对相关基因组RNA序列进行插入、替换等一系列突变,初步鉴定了调控病毒转录的顺式调控元件(cis-acting element)并对其作用机制进行了探讨,现将研究内容分述如下:\n 1.北美型PRRSV弱毒APRRS株转录调控序列(TRS)的鉴定\n 不同PRRSV遗传型及亚型使用的TRS不尽相同.以北美型PRRSV弱毒APRRS株感染性克隆的拯救病毒(vAPRRS)为研究对象,利用RT-PCR技术首次确定了介导形成APRRS株各个sgmRNA的TRS及Leader-Body结合位点.结果表明,与其它PRRSV分离株相同的是sgmRNA7的形成受两个TRS-B(TRS123和TRS9)调控,采用经典TRS(canonical TRS)和非经典TRS(noncanonical TRS)来介导形成sgmRNA;与其它分离株不同的是,APRRS株的非经典TRS分布及使用有其特殊性.PRRSV TRS的异同性为下一步研究mRNA转录调控机制奠定了基础。\n 2.北美型PRRSV弱毒APRRS株的TRS功能解析\n 通过对PRRSV感染性克隆pAPRRS进行定点基因突变及其所致拯救病毒的鉴定,以此确定TRS-L和TRS-B突变对亚基因组转录及病毒感染性的影响.结果表明:(1)同时突变TRS-L最后两个CC的全长突变体pLeaderD对MARC-145细胞无感染性,且未产生sgmRNA7转录本;而只突变最后一个C的pLeaderR能拯救出突变病毒,但突变位点在突变病毒系列传代中发生回复突变,由此证明TRS-L3\'的一级序列对不连续性转录起着重要作用且PRRSV具有一定修复功能.(2)突变TRS123 3\'最后两个碱基的pM7Da或突变TRS9 3\'最后两个碱基的pM7Db均能拯救出病毒,而共同含有TRS9和TRS123 3\'最后两个碱基突变的pM7Dab不能拯救出病毒,对拯救的突变病毒进行鉴定发现,TRS123突变的拯救病毒在一系列传代中突变碱基回复,而FRS9突变的拯救病毒传代过程中稳定遗传;突变体pM7S3(含有TRS123的三个碱基突变)和pM7Db虽能拯救出活病毒,但突变都使相应的sgmRNA7转录量至零,且vM7S3滴度偏低.由此证明了TRS9和TRS123都可单独承担PRRSV sgmRNA7的转录调控,其3\'一级序列对不连续性转录起着重要作用且PRRSV具有修复功能;PRRSV的N蛋白主要来源于sgmRNA7.1的翻译.(3)pM7LDD转染细胞后能相应地检测到sgmRNA7转录,由此证明PRRSV TRS-L和反义链TRS-B的互补配对是形成sgmRNA的关键因素.(4)所有突变病毒的亚基因组中leader-body结合位点碱基均来源于TRS-B,为负链RNA不连续转录模型理论提供了直接证据。\n 3.北美型PRRSV弱毒APRRS株的转录调控系统改装及其RNA5转录调控机制研究\n 同型不同毒株PRRSV共同感染细胞时重组病毒产生率高达10%(Yuan,1999),因此为了防止弱毒苗与野毒之间重组而造成弱毒苗毒力返强,我们试图重新构建PRRSV调控系统.本研究通过定点突变,构建了含有TRS-L和TRS-B3\'最后一个碱基共同突变的全长突变体,重新构建了PRRSV调控系统,为研制安全的弱毒疫苗奠定了基础。在本研究室存有两个全长突变体,一个ORF4、ORF5间引入3个碱基获得的突变体能拯救出病毒,而另一个突变体引入23个碱基则不能拯救出病毒.本研究构建了一系列ORF4、ORF5间引入不同碱基数的突变体,在此基础上鉴定了sgmRNA5的调控元件.结果表明,sgmRNA的合成调控非常严格,其中局部RNA二级结构起着重要的启动子作用,且本研究界定了ORF4、ORF5间允许外源序列的最大容量在3nt～9nt.\n 4.北美型PRRSV弱毒APRRS株的RNA2转录调控机制研究\n 以北美株PRRSV感染性克隆pAPRRS为平

关键词：猪繁殖呼吸综合征病毒转录调控机制基因表达

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基于Cas9-sgRNA的病毒LTR免疫沉淀筛选调控病毒转录靶标

基于Cas9-sgRNA的病毒LTR免疫沉淀筛选调控病毒转录靶标

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作者：于丹刘荣雕高祥姚开虎 100045 北京市西城区南礼士路56号

本发明公开了基于Cas9‑sgRNA的病毒LTR免疫沉淀筛选调控病毒转录靶标的方法和应用。本发明首次采用Cas9‑sgRNA联合免疫沉淀，对艾滋病毒启动子区域LTR互作的宿主蛋白进行检测，证明该方法可用于筛选结合于病毒LTR调控HIV‑1基因转录的宿... 详细信息

标准号: CN111308091B

本发明公开了基于Cas9‑sgRNA的病毒LTR免疫沉淀筛选调控病毒转录靶标的方法和应用。本发明首次采用Cas9‑sgRNA联合免疫沉淀，对艾滋病毒启动子区域LTR互作的宿主蛋白进行检测，证明该方法可用于筛选结合于病毒LTR调控HIV‑1基因转录的宿主蛋白，具有高效、客观和准确等优势；同时本发明基于该方法筛选出了可以调控病毒转录的宿主蛋白CNOT1。

关键词：宿主蛋白病毒转录免疫沉淀筛选调控病毒启动子区域基因转录艾滋病毒可用检测应用联合

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基于Cas9-sgRNA的病毒LTR免疫沉淀筛选调控病毒转录靶标

基于Cas9-sgRNA的病毒LTR免疫沉淀筛选调控病毒转录靶标

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作者：于丹刘荣雕高祥姚开虎 100045 北京市西城区南礼士路56号

标准号: CN111308091A

关键词：宿主蛋白病毒转录免疫沉淀筛选调控病毒启动子区域基因转录艾滋病毒可用检测应用联合

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一种联合检测HPV16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合及应用

一种联合检测HPV16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合及应用

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作者：魏兰兰 518100 广东省深圳市龙岗区南湾街道布澜路29号

本发明提供一种联合检测HPV16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合及应用，所述联合检测HPV16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合包括根据针对HPV16DNA筛选出的高度保守序列设计的16QLCR上游引物，16QLCR下游引物，及LCR‑Pb1... 详细信息

标准号: CN117737304A

本发明提供一种联合检测HPV16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合及应用，所述联合检测HPV16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合包括根据针对HPV16DNA筛选出的高度保守序列设计的16QLCR上游引物，16QLCR下游引物，及LCR‑Pb1探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示以及针对HPV16RNA的HPV16QE6*上游引物、HPV16QE6*下游引物和探针，本发明中，通过基于HPV16的DNA和RNA的特异性保守区域设计出的引物与探针组合，具有很好的特异性，建立了一套联合检测HPV16核酸DNA和E6转录本mRNA方法，实现同时检测HPV核酸DNA和致癌基因E6转录本mRNA。

关键词：联合检测探针组合探针引物病毒感染病毒转录上游引物下游引物核酸DNA 转录本核苷酸序列保守区域高度保守序列设计致癌基因筛选检测应用

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用于调节潜伏的病毒转录的组合物和方法

用于调节潜伏的病毒转录的组合物和方法

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作者： S·R·奎克美国加利福尼亚州

本申请提供了可以用于调节病毒转录的组合物和方法。使用催化失活的核酸酶，例如去活化的Cas9或dCas9，可以将向导RNA设计为在病毒核酸中识别调节元件。所述dCas9可作为RNA依赖的DNA结合蛋白结合至病毒启动子，并上调或下调转录。例如... 详细信息

标准号: CN108603192A

本申请提供了可以用于调节病毒转录的组合物和方法。使用催化失活的核酸酶，例如去活化的Cas9或dCas9，可以将向导RNA设计为在病毒核酸中识别调节元件。所述dCas9可作为RNA依赖的DNA结合蛋白结合至病毒启动子，并上调或下调转录。例如，所述dCas9和病毒启动子特异性的gRNA可以杂交至宿主细胞中的病毒基因组内的启动子，并通过例如空间阻断转录机制的募集来抑制转录。

关键词：转录病毒启动子病毒基因组病毒核酸病毒转录宿主细胞核酸酶启动子去活化失活催化杂交下调申请

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质型多角体病毒侵染、转录调节机制的研究进展

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江西科学 2014年第4期32卷 509-514页

作者：靳亮彭晗王金昌张莉莉张婷江西省科学院微生物研究所南昌330029 南昌大学生命科学与食品工程学院南昌330077

质型多角体病毒(Cytoplasmicpolyhedrosisvirus,CPV)隶属呼肠孤病毒科Reoviridae质型多角体病毒属Cypovirus,通常基因组由10个节段双链RNA构成。根据病毒基因组dsRNA片段在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中电泳图谱的差异,目前CPV已被分为20个... 详细信息

质型多角体病毒(Cytoplasmicpolyhedrosisvirus,CPV)隶属呼肠孤病毒科Reoviridae质型多角体病毒属Cypovirus,通常基因组由10个节段双链RNA构成。根据病毒基因组dsRNA片段在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中电泳图谱的差异,目前CPV已被分为20个电泳型。依据已有的研究结果,综述了质型多角体病毒(Cypovirus,简称CPV)侵染、转录调节机制的最新研究进展。重点分析了CPV入侵过程;转录过程中CPV衣壳蛋白VP1和塔状蛋白VP3构象变化,促进mRNA起始转录和加帽的作用;大突起蛋白VP5,作为夹状蛋白起到稳定CPV病毒粒子结构的作用;另外,VP5作为mRNA分子伴侣,促进RNA链的解旋和加速链的退火。这些研究结果将为下一步深入研究CPV入侵、转录机制,提供了重要的理论依据和研究线索。

关键词：质型多角体病毒病毒入侵病毒转录结构蛋白

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牛泡沫病毒通过活化细胞NF-κB信号通路促进其转录及复制

牛泡沫病毒通过活化细胞NF-κB信号通路促进其转录及复制

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作者：王健南开大学

学位级别：博士

核因子KB,即NF-κB,是细胞中一类重要转录因子,在细胞生存、发育、分化以及免疫、炎症反应过程中参与基因的表达与调控。许多病毒也进化出相应的策略调节细胞的NF-κB信号通路,由此改变相关细胞事件,保证其完成生活周期。对相关现象及... 详细信息

核因子KB,即NF-κB,是细胞中一类重要转录因子,在细胞生存、发育、分化以及免疫、炎症反应过程中参与基因的表达与调控。许多病毒也进化出相应的策略调节细胞的NF-κB信号通路,由此改变相关细胞事件,保证其完成生活周期。对相关现象及其中分子机制的解析是分子病毒学研究的重要内容。本文对牛泡沫病毒(BFV)与宿主NF-κB信号通路间关系展开研究,发现BFV感染宿主细胞后,可通过其正调控蛋白BTas激活细胞NF-κB信号通路；NF-κB通路的活化反过来又会增强BFV的转录,其中的Rel B作为BTas的转录辅因子完成正调控功能。这些发现为全面认识反转录病毒与细胞NF-κB信号通路之间的关系提供了重要证据。相关实验数据如下：使用NF-κB报告基因系统以及p65细胞定位分析,发现BFV可以通过其反式激活因子BTas激活NF-κB信号通路；竞争抑制实验发现IκBα和IKKβ参与BFV(BTas)激活NF-κB过程；使用IκBα磷酸化抗体检测发现BFV(BTas)能够在体内引起IκBα的磷酸化及后续降解。同时,我们还发现BTas除了能够通过经典途径(IκBα的降解以及p65入核)激活NF-κB信号通路之外,还能通过诱导p100的剪切激活NF-κB替代途径；免疫沉淀分析表明BTas能够与IKKa和IKKp在体内相互作用。这些结果支持BTas通过与IKK复合物的相互作用调节其活性,进而促进IκBα的磷酸化,最终激活NF-κB信号通路。此外,我们使用BFV LTR报告基因系统发现BTas介导的LTR转录受到细胞NF-κB的正调控。对病毒利用NF-κB信号通路促进自身复制相关分子机制的研究表明：BFV LTR没有功能性κB位点,表明细胞NF-κB效应分子不能直接活化BFV的转录。但我室前期酵母双杂交实验提示BTas与NF-κB家族的RelB蛋白可能存在着相互作用。本文通过体内、体外实验验证了两者的相互作用,两者的相互作用区域分别位于RelB的Rel同源域(RHD)以及BTas的C端一侧；过表达及RNA干扰实验证实RelB可以增强BTas介导的LTR转录,这一过程需要RelB与BTas在细胞核内的相互作用以及RelB的转录激活域(TAD)。进一步通过染色体免疫共沉淀实验和EMSA实验证明在BFV复制过程中,细胞内源的RelB蛋白可通过BTas介导间接结合在LTR之上,由此促进BFV的转录及复制。上述结果表明BFV在复制过程中利用宿主细胞RelB蛋白作为其反式激活因子BTas的辅助因子,增强病毒基因的转录并最终促进了病毒的复制。此外,我们还发现BFV (BTas)通过调节细胞NF-κB信号通路增加了细胞内RelB蛋白表达。综上所述,本文的研究结果部分阐明了BFV感染宿主细胞后两者之间形成的正反馈循环：BFV感染激活细胞NF-κB信号通路,细胞NF-κB的活化反过来又会通过上调RelB蛋白的表达增强BTas介导的BFV的转录,最终促进病毒的复制。

关键词：牛泡沫病毒牛泡沫病毒反式激活因子核因子κB信号通路 RelB蛋白病毒转录

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家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bm56缺失对病毒复制和转录的影响

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浙江理工大学学报（自然科学版） 2014年第6期31卷 734-739页

作者：石扬辉朱丽萍张臣袁佳解纯刚于威浙江理工大学生物化学研究所杭州310018 浙江理工大学浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室杭州310018

研究Bm56的生物学功能,利用Red重组系统构建了Bm56基因缺失型病毒vBm56-KO-Bacmid,并利用Bac-to-Bac系统构建了Bm56基因补回型病毒vBm56-Re-Bacmid。然后将构建好的上述病毒转染BmN细胞,qPCR研究发现,Bm56敲除型病毒与野生病毒相比,在... 详细信息

研究Bm56的生物学功能,利用Red重组系统构建了Bm56基因缺失型病毒vBm56-KO-Bacmid,并利用Bac-to-Bac系统构建了Bm56基因补回型病毒vBm56-Re-Bacmid。然后将构建好的上述病毒转染BmN细胞,qPCR研究发现,Bm56敲除型病毒与野生病毒相比,在囊膜病毒(Budded virus,BV)的产量上并没有统计学差异,表明Bm56基因不是病毒形成有感染活力病毒粒子的必需基因。同时qRT-PCR研究结果也显示,Bm56缺失没有明显降低病毒基因组的复制水平,进一步研究Bm56缺失对BmNPV基因转录的影响。qRT-PCR结果显示,Bm56对早晚期和极晚期基因的转录水平均没有明显的影响。说明Bm56不是BmNPV病毒复制的必需基因,对病毒早期基因、晚期基因和极晚期基因的转录水平均无显著影响,推测Bm56可能作为一种病毒结构蛋白,在病毒装配等环节中起着重要作用。

关键词： BmNPV Bm56 Red重组病毒复制病毒转录

来源：评论

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家蚕核型多角体病毒(BmNPV) 0RF122基因缺失对病毒复制和转录的影响

家蚕核型多角体病毒(BmNPV) 0RF122基因缺失对病毒复制和转录的影...

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华东六省一市生物化学与分子生物学学会2014年学术交流大会暨浙江省第十一届学会会员代表大会

作者：朱丽萍何欢解纯刚浙江理工大学生物化学研究所杭州310018 浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室杭州 310018

家蚕杆状病毒基因Bm122位于BmNPV(T3株)基因组116325-116928nt,读码框全长606bp,编码201个氨基酸.有研究表明Bm122的转录起始于转染后3h,并且由宿主的RNA聚合酶Ⅱ所转录,由此推测Bm122是一个早期基因.Bm122起始密码子上游240nt和189nt... 详细信息

家蚕杆状病毒基因Bm122位于BmNPV(T3株)基因组116325-116928nt,读码框全长606bp,编码201个氨基酸.有研究表明Bm122的转录起始于转染后3h,并且由宿主的RNA聚合酶Ⅱ所转录,由此推测Bm122是一个早期基因.Bm122起始密码子上游240nt和189nt处分别有CAGT和TATA盒结构,编码的蛋白大小为23KDa左右,Bm122编码的蛋白定位于细胞核内.

关键词： BmNPV Bm122 Red重组病毒复制病毒转录

来源：评论

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