检索结果-内蒙古大学图书馆

中华男科学杂志 2002年第4期8卷 292-294,298页

作者：高云南京军区南京总医院生殖遗传研究室江苏南京210002

真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系 ,表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。基因工程中常用的真核表达系统有 :酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统。甲醇酵母主要利用醇氧化酶的基因启动子在甲醇诱导下表达外源蛋... 详细信息

真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系 ,表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。基因工程中常用的真核表达系统有 :酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统。甲醇酵母主要利用醇氧化酶的基因启动子在甲醇诱导下表达外源蛋白 ,而三磷酸甘油脱氢酶启动不需甲醇诱导 ,可缩短到达峰值表达的时间。杆状病毒是昆虫细胞表达系统中最常用的表达载体 ,利用转座原理构建重组杆状病毒是一种有效的构建重组体的方法 ;杆状病毒 S2 系统是最近构建的一种不裂解宿主细胞的新型昆虫细胞表达系统。哺乳动物细胞表达系统中 ,腺病毒是常用的表达载体 ,通过细菌内同源重组和Cre/loxp系统构建重组体 ,可提高重组效率 ;利用杆状病毒将外源基因导入哺乳动物细胞 ,不会引起病毒基因的表达 ;四环素诱导表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统 ,该系统具有严密、高效。

关键词：真核表达系统酵母昆虫细胞哺乳动物细胞

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牡蛎疱疹病毒结构蛋白真核表达系统构建及多聚化特性

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水产学报 2024年第5期48卷 65-74页

作者：曹书华魏茂乐李永仁黄博闻辛鲁生白昌明王崇明天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在全球范围内导致牡蛎、扇贝与蚶类的大规模死亡，成为双壳贝类养殖产业的重要威胁。为了解OsHV-1的结构与致病机制。本研究利用人胚胎肾细胞(HEK293t)，构建OsHV-1主要核衣壳蛋白(ORF104和ORF33)的真核表达系统，... 详细信息

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在全球范围内导致牡蛎、扇贝与蚶类的大规模死亡，成为双壳贝类养殖产业的重要威胁。为了解OsHV-1的结构与致病机制。本研究利用人胚胎肾细胞(HEK293t)，构建OsHV-1主要核衣壳蛋白(ORF104和ORF33)的真核表达系统，并对ORF104和ORF33潜在相互作用进行分析。实验首先通过特异性PCR扩增技术得到orf 104和orf 33的基因序列，根据其编码蛋白的理化性质、跨膜区与三维结构等生物信息学分析结果，选择pCDNA3.1(+)构建两种基因的重组表达质粒。重组质粒经大肠杆菌扩增、提取后，利用转染试剂Lipo8000?将pCDNA3.1(+)-orf 104与pCDNA3.1(+)-orf 33分别单独或共转染至HEK293t。然后，将转染后的细胞培养18 h后裂解收集蛋白。最后利用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)与负染电镜检测两种目的蛋白的表达情况。结果显示，实验成功构建了OsHV-1衣壳蛋白ORF104和ORF33的重组表达质粒载体，通过真核细胞表达得到大小约为135与35 ku的目的蛋白。研究表明，表达质粒可在真核表达系统中实现蛋白单独转染与共转染，共转染蛋白间可能存在相互作用的趋势并形成多聚体，其中，ORF33自身即可形成分子质量不同的多聚体。本研究首次利用真核表达系统开展OsHV-1关键结构蛋白的表达，为进一步开展该病毒结构蛋白功能与互作，以及病毒入侵机制研究奠定基础。

关键词：牡蛎疱疹病毒核衣壳蛋白真核表达系统蛋白多聚化

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真核表达系统中高效平行筛选可溶药物靶标蛋白的新方法研究

真核表达系统中高效平行筛选可溶药物靶标蛋白的新方法研究

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作者：杨剑南开大学

学位级别：硕士

蛋白结构研究中，稳定可溶的蛋白结构分析起到了关键作用。然而，分析蛋白结构这一过程却因为很多靶标蛋白在不同的表达系统中表达是不可溶，不稳定的或者纯化步骤繁琐且无用而受到阻碍。文献可知，有一种已报道的方法POET，池式开放性... 详细信息

蛋白结构研究中，稳定可溶的蛋白结构分析起到了关键作用。然而，分析蛋白结构这一过程却因为很多靶标蛋白在不同的表达系统中表达是不可溶，不稳定的或者纯化步骤繁琐且无用而受到阻碍。文献可知，有一种已报道的方法POET，池式开放性阅读框技术，可以用于大范围在大肠杆菌表达系统中筛选表达纯化可溶蛋白，但是这一技术并不适合真核系统靶标蛋白的表达.另一方面，尽管（真核系统表达）中的杆状病毒感染昆虫细胞表达系统是现在最有效的异源蛋白表达系统，但耗时久，浪费资源也是它显而易见的缺点，所以寻求一种能高效稳定的在真核表达系统中（尤其是昆虫杆状病毒表达系统）筛选表达可溶蛋白的方法对结构生物学研究是很必要的。　　为满足这一需要，一种改进的POET方法将被运用到昆虫系统中靶标蛋白的重组表达筛选中，同时质谱、蛋白印迹、离子交换层析、分子筛等多种方法也将运用于蛋白的鉴定纯化中，使其能更高效，便捷的选择并确定纯化靶标蛋白。这项工作中，20个人源基因开放式阅读框或基因片段会被亚克隆至杆状病毒表达载体中，并构建形成相应重组的bacmid，然后共同侵染Sodoptera frugiperda 9昆虫草地夜蛾细胞。大小规模侵染反复验证，经过表达和纯化，4种蛋白被鉴定为可溶表达蛋白，我们还对其进行了蛋白生物活性研究，证明这种方法的可行有效性。　　通过这种改进的POET新方法，可以实现高效在杆状病毒感染昆虫细胞表达系统中一次性高效确定可溶靶标蛋白。

关键词：真核表达系统可溶蛋白药物筛选生物活性昆虫细胞杆状病毒

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慢病毒介导的H7N9禽流感病毒血凝素基因快速真核表达系统的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2014年第6期30卷 630-634页

作者：张黎彭海燕周明浩余慧燕曾晓燕祁贤崔仑标焦永军史智扬江苏省疾病预防控制中心卫生部肠道病原微生物重点实验室江苏南京210009

目的利用慢病毒载体构建新型H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因的快速真核表达体系,在人胚肾细胞(HEK293T)中表达并进行功能鉴定。方法提取H7N9禽流感病毒基因组RNA,采用反转录PCR技术扩增HA读码框全长基因,将HA基因连接pMD18-T载体构建pMD1... 详细信息

目的利用慢病毒载体构建新型H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因的快速真核表达体系,在人胚肾细胞(HEK293T)中表达并进行功能鉴定。方法提取H7N9禽流感病毒基因组RNA,采用反转录PCR技术扩增HA读码框全长基因,将HA基因连接pMD18-T载体构建pMD18-T-HA重组载体。设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-HA质粒中扩增出平末端HA基因,采用Topo克隆构建表达载体pLenti-HA-V5。将表达载体转染HEK293T细胞,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法鉴定HA蛋白的表达,通过血凝实验鉴定重组蛋白的生物学活性。结果经反转录PCR获得1 683 bp的HA全长基因,完成真核表达载体的构建并表达出相对分子质量(Mr)为70 000的重组蛋白。IFA和Western blot法结果显示该蛋白与阳性血清具有良好的免疫反应,同时血凝实验证实其具有血凝活性。结论成功利用慢病毒载体建立了HA蛋白的快速真核表达系统,为研制H7N9病毒亚单位疫苗、中和表位研究、假病毒包装奠定基础。

关键词： H7N9禽流感病毒血凝素基因慢病毒载体真核表达系统

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葡萄球菌肠毒素A基因真核表达系统的构建及其目的重组蛋白的鉴定(英文)

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中国人兽共患病杂志 2004年第4期20卷 303-306,310页

作者：孙爱华邵浙新阮萍毛亚飞严杰浙江医学高等专科学校杭州310053

目的　克隆金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因、构建其真核表达系统及目的重组蛋白的表达情况。方法　采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC135 6 5菌株中扩增全长SEA ,目的扩增片段T -A克隆后测序。经核酸内切酶酶切重组质粒 pUCm -T -SEA... 详细信息

目的　克隆金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因、构建其真核表达系统及目的重组蛋白的表达情况。方法　采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC135 6 5菌株中扩增全长SEA ,目的扩增片段T -A克隆后测序。经核酸内切酶酶切重组质粒 pUCm -T -SEA获得的 pUCm -T -SEA基因片段与真核表达载体 pPIC9K连接。采用电融合法将重组真核载体pPIC9K -SEA转化入P pastorisGS115株 ,构建成真核表达系统 pPIC9K -SEA -P pastorisGS115。采用含G4 18抑制剂的YPD琼脂平板和PCR筛选并鉴定 pPIC9K -SEA -P pastorisGS115。 0 5 % (V∶V)甲醇诱导下 ,采用SDS -PAGE检查BMMY液体培养基上清中重组SEA(rSEA)的表达情况。结果　可从S aureusATCC135 6 5株DNA中扩增获得SEA目的片段。与报道的SEA基因序列 (GenBankNo :AP0 0 4 82 8andL2 2 5 6 6 )比较 ,所克隆的SEA基因核苷酸及氨基酸序列的相似性分别高达 98 84 %～ 10 0 %和 10 0 %。在甲醇的诱导下 ,pPIC9K -SEA -P pastorisGS115能表达在SDS -PAGE图谱位于预期位置的rSEA。结论　我们成功地构建了能表达SEA的真核表达系统 ,为进一步分析SEA分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础。

关键词：葡萄球菌肠毒素A 基因真核表达系统构建重组蛋白鉴定

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1型糖尿病自身抗原胰岛素瘤相关蛋白2真核表达系统的构建和鉴定

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中华糖尿病杂志（1006-6187） 2005年第3期13卷 230-233页

作者：刘煜朱虎曾丽玲陈家伟杨金奎钟耀华王若宁陈小章 210029 南京医科大学第一附属医院内分泌科香港中文大学上皮细胞研究中心北京同仁医院内分泌科南京医科大学生化与分子生物学研究室

目的构建能高效表达自身抗原胰岛素瘤相关蛋白2(IA2)的真核表达载体作为预防发生1型糖尿病(T1DM)的基因疫苗。方法利用基因工程技术构建重组pEGFP/IA2真核表达系统,并且转染、筛选稳定高表达IA2的RIN5F胰岛细胞株,用免疫印迹法并在荧光... 详细信息

目的构建能高效表达自身抗原胰岛素瘤相关蛋白2(IA2)的真核表达载体作为预防发生1型糖尿病(T1DM)的基因疫苗。方法利用基因工程技术构建重组pEGFP/IA2真核表达系统,并且转染、筛选稳定高表达IA2的RIN5F胰岛细胞株,用免疫印迹法并在荧光显微镜下鉴定其表达,利用共培养体系检测IA2刺激淋巴细胞增殖率。结果双酶切结果表明成功构建了重组pEGFP/IA2真核表达系统,免疫印迹法证实可在RIN5F细胞内高表达IA2。并且该表达的IA2可显著促进NOD小鼠淋巴细胞增殖反应(P<0.05)。结论成功构建的IA2真核表达系统对于T1DM基因疫苗预防策略和对于IA2生理功能的研究都具有重要的意义。

关键词： 1型糖尿病自身抗原胰岛素瘤相关蛋白2 真核表达系统 IA-2 疫莳

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口蹄疫病毒2B基因的生物信息学分析及其siRNA真核表达系统的建立

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畜牧与兽医 2010年第5期42卷 51-54页

作者：崔丽瑾王兴龙段小宇刘铠党源郎需龙李晓艳军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062 吉林大学人兽共患病研究所吉林长春130062 吉林省华康牧业有限责任公司吉林四平136100 内蒙古民族大学内蒙古通辽028000 吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

应用RT-PCR方法扩增口蹄疫WLF株2B基因,将其克隆到pMD18-T载体中,测序后进行序列保守性分析和RNA二级结构分析,筛选适合作为siRNA的靶序列。根据siRNA表达载体要求,合成shRNA表达模板,连接到含有U6启动子的真核表达载体中,建立了靶向口... 详细信息

应用RT-PCR方法扩增口蹄疫WLF株2B基因,将其克隆到pMD18-T载体中,测序后进行序列保守性分析和RNA二级结构分析,筛选适合作为siRNA的靶序列。根据siRNA表达载体要求,合成shRNA表达模板,连接到含有U6启动子的真核表达载体中,建立了靶向口蹄疫2B基因的真核表达系统,为进一步研究靶向2B基因的RNA干扰对口蹄疫病毒的抑制作用奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 2B基因序列分析 siRNA 真核表达系统

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鸡B-F2基因真核表达系统的建立与鉴定

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畜牧与兽医 2012年第9期44卷 1-3页

作者：金园园陈芳芳余为一安徽农业大学安徽省人兽共患病重点实验室安徽合肥230036

鸡B-F2基因编码的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子α链在递呈内源性抗原中起重要作用。本研究应用RT-PCR方法从鸡外周血单核细胞中扩增了B-F2基因片段,其大小为1 068 bp。进一步将其定向插入真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-B-F2... 详细信息

鸡B-F2基因编码的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子α链在递呈内源性抗原中起重要作用。本研究应用RT-PCR方法从鸡外周血单核细胞中扩增了B-F2基因片段,其大小为1 068 bp。进一步将其定向插入真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-B-F2。经脂质体法转染COS7,所表达的α链定位于在细胞的浆膜,同时转染P815细胞,经G418的筛选(0.6 mg/mL)得到稳定表达细胞株。该细胞株经培养10代次后,仍在RT-PCR中能获得相应DNA片段。上述结果表明,B-F2基因在动物真核表达系统得到表达,建立的P815(B-F2)细胞株为进一步研究MHC I类分子α链在免疫应答中作用奠定了基础。

关键词： B-F2 鸡主要组织相容性复合体(MHC) 真核表达系统

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抗Trop-2抗体IgG真核表达系统的构建及抗体活性分析

抗Trop-2抗体IgG真核表达系统的构建及抗体活性分析

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作者：刘琼琼南京医科大学

学位级别：硕士

人滋养层细胞表面抗原-2(trophoblast cell-surface antigens2, Trop-2)亦称TACSTD2、GA733-1、EGP-1,定位于1p32区域,是无内含子基因,所编码的产物含有323个氨基酸、35.7kDa的蛋白质。它是一个单次跨膜糖蛋白,在正常上皮组织中很少表... 详细信息

人滋养层细胞表面抗原-2(trophoblast cell-surface antigens2, Trop-2)亦称TACSTD2、GA733-1、EGP-1,定位于1p32区域,是无内含子基因,所编码的产物含有323个氨基酸、35.7kDa的蛋白质。它是一个单次跨膜糖蛋白,在正常上皮组织中很少表达或不表达,但在滋养细胞及多种上皮癌中高表达。研究表明,Trop-2与多种肿瘤的侵袭行为密切相关,具有促进肿瘤细胞侵袭和转移的功能。因此,Trop-2可能成为一种新的肿瘤预后标志物,并在肿瘤的靶向治疗中成为潜在靶点。随着现代医学发展和分子生物学技术的提高,人们逐渐从分子、基因水平对肿瘤的发病机制有了了解,肿瘤的靶向治疗技术应运而生,成为近年肿瘤治疗领域研究的热点。肿瘤靶向治疗技术不断完善,多种治疗手段应用于肿瘤的治疗,并在临床实践中取得了的一些成就。其中单抗治疗在靶向治疗中又显示出良好的抗肿瘤效果,抗体可特异靶向识别并结合肿瘤细胞表面抗原、补体、血管内皮细胞生长因子或表皮生长因子,通过补体或抗体依赖的细胞毒性作用,或诱导细胞凋亡,或抑制肿瘤血管形成。抗体IgG分子由两条相同的重链和轻链组成,重链由VH和CH1、CH2和CH3组成,轻链由VL和CL组成。与Fab等小分子抗体相比,IgG亲合力较高,稳定性较好,并且可以激活补体系统以及Fc受体介导的生物效应功能。目前国内多采用原核细胞表达小分子抗体ScFv及Fab,而全分子抗体研究较少,目前常用的原核表达系统大肠杆菌无法表达具有完整功能的抗体分子,要把来源于噬菌体抗体库的人源Fab转换成全分子抗体,必须换用真核细胞表达系统。本研究在实验室已制备的抗Trop-2Fab的基础上,构建全人源抗Trop-2抗体的真核表达载体,并在CHOdhfr-细胞中表达,为生产具有完整功能的全分子抗体及其临床应用研究奠定了基础。目的 1.以抗Trop-2抗体Fab基因为模板,构建人源抗Trop-2抗体的IgG真核表达系统。 2.表达并纯化IgG抗体,对抗体的活性进行分析,并观察抗Trop-2单克隆抗体对胰腺癌细胞增殖的抑制作用。方法 1.抗Trop-2抗体IgG重组表达载体的构建：采用PCR分别扩增抗Trop-2抗体的重链和轻链基因,分别双酶切pWS-2载体和轻链,将轻链基因克隆于载体pWS-2中,测序正确后提取质粒,命名为pWS-L,再分别双酶切pWS-L载体和重链,将重链基因克隆于载体pWS-L中,测序正确后提取质粒。 2.抗Trop-2抗体IgG的表达及纯化：重组质粒转染CHO dhfr-细胞,加药筛选后进行亚克隆。阳性单克隆扩大培养后收集上清,采用ProteinG亲和柱纯化,获得抗Trop-2的IgG抗体分子。 3.抗Trop-2抗体的鉴定：通过酶联免疫法、Western blot、免疫荧光、流式细胞术分析抗Trop-2抗体的免疫学特性。 4.用MTT法分析抗Trop-2抗体对胰腺癌细胞BxPC-3的生长抑制作用。结果 1.经PCR扩增、基因克隆和核酸序列分析,本研究成功构建了抗Trop-2抗体IgG真核表达系统；转染CHO dhfr-细胞后,加药筛选出能够稳定表达抗Trop-2的IgG抗体分子的单克隆抗体细胞株；并获得纯度较高的抗Trop-2人源化IgG抗体分子。 2. SDS-PAGE和Western blot均显示两条带,分别为28kD和55kD,与蛋白预期大小一致,免疫荧光检测显示抗Trop-2抗体可以识别胰腺癌细胞表面的Trop-2膜蛋白；FACS检测结果显示,抗Trop-2抗体能够与胰腺癌细胞结合。 ***检测结果表明,随着时间延长和抗体剂量的增加,抗Trop-2抗体对细胞的生长抑制作用也愈明显,即呈时效、量效依赖关系。其中以浓度最高的抗体作用72小时对细胞抑制率最高(84.15%)；与对照组相比,不同浓度的抗体对细胞增殖的抑制率均有明显的差异(P<0.05)。结论 1.本研究成功构建了抗Trop-2抗体的IgG真核表达系统,成功筛选并纯化出抗Trop-2人源IgG抗体分子,该抗体可特异性识别胰腺癌细胞表面的Trop-2蛋白。 2.抗Trop-2人源化IgG抗体对胰腺癌细胞的增殖有一定的抑制作用。

关键词：人滋养层细胞表面抗原-2 抗Trop-2抗体IgG 真核表达系统表达与纯化胰腺癌细胞

来源：评论

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柯萨奇病毒B组3型中国分离株VP1基因真核表达系统的克隆

引用

中国地方病学杂志 1999年第3期18卷 169-172页

作者：田野钟照华赵铁强黄建林安毅唐伟沈景霞钟学宽孟繁超黄永麟鲁凤民叶鸿瑁哈尔滨医科大学第一临床医学院心内科哈尔滨医科大学基础医学院哈尔滨工业大学北京医科大学第三临床医学院

目的探讨构建柯萨奇病毒Ｂ组３型（ＣＶＢ３）基因疫苗的可行性。方法应用逆转录ＰＣＲ技术扩增ＣＶＢ３中国分离株ＶＰ１基因，通过ＴＡ克隆法构建ｐＣＲ２．１－ＣＶＢ３ＶＰ１，将ＣＶＢ３ＶＰ１亚克隆至真核表达载体ｐＣＥＰ４，构... 详细信息

目的探讨构建柯萨奇病毒Ｂ组３型（ＣＶＢ３）基因疫苗的可行性。方法应用逆转录ＰＣＲ技术扩增ＣＶＢ３中国分离株ＶＰ１基因，通过ＴＡ克隆法构建ｐＣＲ２．１－ＣＶＢ３ＶＰ１，将ＣＶＢ３ＶＰ１亚克隆至真核表达载体ｐＣＥＰ４，构建真核表达系统ｐＣＥＰ４－ＣＶＢ３ＶＰ１，并进行酶切和测序鉴定。结果发现ＣＶＢ３的中国分离株与Ｎａｎｃｙ株的ＶＰ１基因基本一致，均编码２９３个氨基酸，其中有５９处核苷酸存在变异，但仅改变了１０处氨基酸编码，证实克隆的片段为ＣＶＢ３ＶＰ１基因，表达载体为ｐＣＥＰ４。结论实验成功地构建了ＣＶＢ３中国分离株的真核表达系统ｐＣＥＰ４－ＣＶＢ３ＶＰ１。

关键词： VP1基因真核表达系统柯萨奇B病毒克隆

来源：评论

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