检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：熊吉敏浙江大学

学位级别：硕士

生长激素(GH)生理功能非常广泛，它几乎可以影响到机体所有类型的组织器官，包括骨、软骨、脂肪组织、免疫系统、生殖系统、脑组织和造血系统。本研究从40日龄的长白猪脑垂体中克隆了猪生长激素(pGH)基因，用毕赤酵母真核表达系统表达... 详细信息

生长激素(GH)生理功能非常广泛，它几乎可以影响到机体所有类型的组织器官，包括骨、软骨、脂肪组织、免疫系统、生殖系统、脑组织和造血系统。本研究从40日龄的长白猪脑垂体中克隆了猪生长激素(pGH)基因，用毕赤酵母真核表达系统表达了重组猪生长激素，并研究了表达产物的生物学活性。主要有以下研究结果：\n 1.摘取40日龄的长白猪脑垂体，从中提取总RNA，经过RT-PCR扩增，得到了猪生长激素(pGH)基因编码序列(Acession ***742642)。DNA电泳结果显示，其条带分子量大小与理论值651 bp相符，测序结果表明，其核苷酸序列与Genebank报道的目的基因100％相似，证实已经正确克隆pGH目的基因。\n 2.根据酵母真核表达载体特征重新设计引物，克隆获得pGH基因的成熟肽编码序列(570 bp)，定向插入毕赤酵母真核表达载体pPICZαA和pGAPZαA。DNA测序结果表明重组表达载体pPICZαA-pGH和pGAPZαA-pGH连接方向正确，且序列没有发生移码。将此重组表达载体线性化后通过电击转化至GS115酵母感受态细胞，用含有Zeocin的YPD培养基筛选重组子，提取鉴定酵母基因组，PCR扩增电泳鉴定的结果可以看出重组酵母GS115基因组以特定基因引物扩增出586 bp左右的条带与理论的结果相符，以通用引物扩增的1100 bp左右及1040 bp左右的条带也均符合理论值，说明重组酵母菌构建成功。\n 3.将鉴定的阳性重组酵母用不同浓度的Zeocin(基本浓度100μg/mL)抗性平板筛选多拷贝子，结果显示随着Zeocin浓度的提高，重组酵母的生长状况呈递减趋势，能够在较高抗性浓度(Zeocin浓度>1200μg/mL)平板上较好生长的重组酵母为编号P14的pPICZαA-pGH-GS115重组酵母和编号为G1400，G2400，G3400，和G4400的pGAPZαA-pGH-GS115重组酵母，选取用于进行蛋白表达。\n 4.高抗Zeocin的重组酵母菌株进行培养表达目的蛋白。高抗菌株pGAPZαA-pGH-GS115 G1400、G2400、G3400和G4400的表达分泌上清液SDS-PAGE结果显示，其蛋白表达量均高于阳性对照，且G2400在26 KD处可见与理论分子量大小相符的目的蛋白。相应的Western-blot结果也显示，G1400，G2400，G3400和G4400均在26 KD处有特异性条带出现。\n 5.高抗重组菌pGAPZαA-pGH-GS115和pPICZαA-pGH-GS115接种培养，在不同时间取样，SDS-PAGE分析显示，随着时间的推移，pGAPZαA-pGH-GS115和pPICZαA-pGH-GS115的pGH表达量均在96 h最高，在120 h反而降低，说明96 h是较为理想的分泌上清收集时间。且相对应的Western-blot分析显示，26KD左右均出现特异性条带，与理论大小相符。\n 6.将96 h收集的高产菌株的分泌上清经过Ni++柱亲和纯化以获得目的蛋白的纯化样品。纯化结果SDS-PAGE分析显示，pPICZαA-pGH-GS115分泌上清用Elution buffer洗脱收集的蛋白样E1，E2，E3均有特异性蛋白条带出现，且E1中浓度最高，选为下一步活性分析的样品。pGAPZαA-pGH-GS115分泌上清的目的蛋白在E2和E3中比较集中，且E2的浓度最高，选为下一步活性分析的样品。猪生长激素蛋白纯化样品和标准BSA对照，计算出纯化收集的pGH浓度均约为8 mg/L左右。\n 7.将选定的纯化蛋白样品用受体夹心Elisa方法进行生物活性分析，结果显示，猪肝脏膜受体和表达的猪生长激素发生特异性结合。当猪生长激素量一定时(3μg/mL)，随着猪肝脏膜受体浓度的提高，光密度值也相应提高；当以加热煮沸失活的猪生长激素和活性肝膜受体结合时，其光密度值显著下降。从而说明本研究表达获得的猪生长激素具有生物活性。

关键词：猪生长激素克隆技术毕赤酵母真核表达系统

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葡萄球菌肠毒素B基因真核表达系统的构建及目的蛋白的鉴定

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中国生物制品学杂志 2004年第6期17卷 341-343,379页

作者：孙爱华毛亚飞严杰浙江医学高等专科学校医学检验系杭州310053 浙江大学医学院病原生物学教研室杭州310031

目的　克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因 ,构建其真核表达系统并表达目的蛋白。方法　采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株中扩增全长SEB ,目的片段T A克隆后测序。重组质粒pUCm T SEB经酶切获得的pUCm T SEB基因片段与真核表达载体pPI... 详细信息

目的　克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因 ,构建其真核表达系统并表达目的蛋白。方法　采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株中扩增全长SEB ,目的片段T A克隆后测序。重组质粒pUCm T SEB经酶切获得的pUCm T SEB基因片段与真核表达载体pPIC9K连接。将重组真核载体pPIC9K SEB转化入P .pastorisGS115株 ,经PCR筛选并鉴定pPIC9K SEB P .pastorisGS115。在 0 5 % (v v)甲醇诱导下 ,采用SDS PAGE检测重组SEB(rSEB)的表达 ,并对rSEB的N端氨基酸序列和诱导人脐静脉内皮EVC 30 4细胞分泌IL 1α和TNFα的作用进行了检测。结果　所克隆的SEB基因核苷酸及氨基酸序列的同源性分别高达 98 84 %～ 10 0 %和 10 0 %。表达的SEB在SDS PAGE图谱的位置与预期相符。rSEB氨基末端氨基酸序列与预期完全相符。rSEB与SEB商品有相似的促人脐静脉内皮细胞EVC 30 4分泌IL 1α和TNFα的活性。结论　已成功地构建了SEB的真核表达系统 ,为进一步分析SEB分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础。

关键词：葡萄球菌肠毒素B 基因真核表达系统蛋白突变体

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重组蛋白药物真核表达系统的研究进展

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中国生物制品学杂志 2024年第6期37卷 756-762页

作者：张俊河(综述) 杨雯雯王天云(审校) 新乡医学院健康中原研究院河南新乡453003 新乡医学院生物化学与分子生物学系河南新乡453003 河南省重组药物蛋白表达系统国际联合实验室河南新乡453003

重组蛋白药物具有活性高、特异性强、毒性低等优势,在全球范围内具有广阔的应用前景。目前,用于高效生产重组蛋白药物的表达系统包括原核和真核表达系统。由于真核表达系统具有完善的翻译后修饰和蛋白折叠等优势,在重组蛋白药物生产中... 详细信息

重组蛋白药物具有活性高、特异性强、毒性低等优势,在全球范围内具有广阔的应用前景。目前,用于高效生产重组蛋白药物的表达系统包括原核和真核表达系统。由于真核表达系统具有完善的翻译后修饰和蛋白折叠等优势,在重组蛋白药物生产中得到广泛应用,常用的真核表达系统有酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞表达系统。本文就常见的真核表达系统的特点、应用和发展前景作一综述,以期为重组蛋白药物选择合适的表达系统,促进新型药物研发提供参考。

关键词：重组蛋白药物真核表达系统基因工程

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NA-1株鹅源副粘病毒糖蛋白基因在原核及真核表达系统中的表达

NA-1株鹅源副粘病毒糖蛋白基因在原核及真核表达系统中的表达

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会

作者：马爱霞丁壮李娜宋子运徐明宣华吉林大学预防兽医学国家重点学科动物重要病原与疫病研究室

前言鹅副粘病毒(GPMV)病是1997年开始在我国江苏、广东、吉林等许多地区流行,并造成严损失的一种新的烈性传染病,具有很高的发病率和死亡率。F和HN是两个重要的囊膜糖蛋白,是病毒毒力的决定因素。F蛋白具有促进病毒囊膜与宿主细胞膜融... 详细信息

前言鹅副粘病毒(GPMV)病是1997年开始在我国江苏、广东、吉林等许多地区流行,并造成严损失的一种新的烈性传染病,具有很高的发病率和死亡率。F和HN是两个重要的囊膜糖蛋白,是病毒毒力的决定因素。F蛋白具有促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合的作用,从而使病毒基因组进入宿主细胞。而HN蛋白不但具有识别、吸附受体的功能,而且还具有促融合的功能。糖蛋白基因可作为研究NDV基因工程疫苗的保护性抗原基因。

关键词：鹅源副粘病毒真核表达系统氨基酸同源性间接免疫荧光试验糖蛋白基因

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PRRSV GP5基因及猪IL-18基因共表达真核表达系统的建立

PRRSV GP5基因及猪IL-18基因共表达真核表达系统的建立

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中国畜牧兽医学会2011年学术年会

作者：李国江高磊丁壮王晓莉宋德武吉林大学畜牧兽医学院

目的猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种具有严重危害的病毒性传染病,该病临床症状主要表现为怀孕母猪的早产、流产、死胎、木乃伊胎以及仔猪和生长... 详细信息

目的猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种具有严重危害的病毒性传染病,该病临床症状主要表现为怀孕母猪的早产、流产、死胎、木乃伊胎以及仔猪和生长猪的呼吸系统疾病和高死亡率。为了进一步研究PRRSV GP5蛋白的免疫功能及猪IL-18对动物免疫应答的调节作用,本研究以PRRSV JL/07/SW毒株ORF5基因和猪IL-18基因为目的基因,以含有绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP-N1为真核表达载体,将PRRSV的ORF5与猪IL-18基因共表达,构建真核表达质粒pEGFP-IL18-GP5,为研究基于以EGFP为报告基因的IL18-GP5为靶蛋白的核酸疫苗以及细胞因子对PRRS核酸疫苗免疫效果的影响奠定了实验基础。

关键词：真核表达系统 PRRSV GP5 IL-18 绿色荧光蛋白基因共表达

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粘多糖贮积症Ⅱ型IDS基因新突变体外真核表达系统的建立

粘多糖贮积症Ⅱ型IDS基因新突变体外真核表达系统的建立

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第十二次全国医学遗传学学术会议

作者：吴晓昀郭奕斌艾阳蒋玮莹黄永兰赵小媛李荣中山大学中山医学院医学遗传室广州妇女儿童医疗中心实验室

目的对一疑似MPSII型家系行IDS基因突变分析,以阐明患者发病的分子遗传学机制。对所发现的新突变,通过建立体外真核表达系统,以探讨其转录和表达的情况,从而在功能学方面对其致病性进行深入鉴定。方法首先采用尿GAGs定性检测对先证者进... 详细信息

目的对一疑似MPSII型家系行IDS基因突变分析,以阐明患者发病的分子遗传学机制。对所发现的新突变,通过建立体外真核表达系统,以探讨其转录和表达的情况,从而在功能学方面对其致病性进行深入鉴定。方法首先采用尿GAGs定性检测对先证者进行快速初诊,然后依次对其IDS基因突变热区和其他外显子进行直接测序。在发现新突变后,RT-PCR扩增正常野生型及患者突变型IDS基因cDNA全长序列,克隆至pcDNA3.1(+)表达载体,分别构建IDS-pcDNA3.1,IDS-p.L381P-pcDNA3.1重组质粒。以IDS-pcDNA3.1为正常对照,空质粒pcDNA3.1为基础对照,IDS-p.L381P-pc DNA3.1为实验组,分别用脂质体2000瞬时转染293T细胞,建立体外真核表达系统。转染后3天收取细胞胞体,胞体用超声破碎并用BCA蛋白定量。然后用荧光分析法检测各组细胞中艾杜糖-2-硫酸酯酶活性。结果1、先证者尿检呈阳性(+)。2、在其IDS基因编码区内检出c.1142 T>C错义突变,其母为该位点的杂合突变。3、检索HGMD数据库和NCBI dbSNP数据库均未发现该变异位点,说明是一新突变并且不是SNP位点。4、IDS基因cDNA全长野生型及突变型序列克隆至载体,经测序验证无误。5、胞体IDS酶活性(取3次重复实验平均值,单位:nmol/4h/m1):IDS-pcDNA3.1转染表达为315.26,pcDNA3.1空质粒为18.1,IDS-p.L381P-pcDNA3.1为15.91。提示该突变造成转染细胞IDS酶活性显著降低,其值甚至低于基础对照。结论IDS基因c.1142T>C错义突变为一新的病理性突变。此突变是该MPSII型患儿发病的根本原因。

关键词：粘多糖贮积症Ⅱ型 IDS基因艾杜糖-2-硫酸酯酶新突变真核表达系统

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mCLCA3增强型绿色荧光蛋白真核表达系统的构建及功能分析

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中国微生态学杂志 2008年第3期20卷 236-238页

作者：吴庆田侯霞任继秋崔刚李丽秋杨景云马淑霞佳木斯大学基础医学院微生物学教研室黑龙江佳木斯154002 佳木斯大学基础医学院生物教研室黑龙江佳木斯154002

目的建立mCLCA3真核细胞表达模型,并对其氯离子通道功能进行分析,为分析其分子本质提供新的理论依据。方法采用RT-PCR、脂质体转染法构建mCLCA3增强绿色荧光型真核细胞表达模型,通过免疫荧光对mCLCA3真核表达情况进行分析,利用FluoStar ... 详细信息

目的建立mCLCA3真核细胞表达模型,并对其氯离子通道功能进行分析,为分析其分子本质提供新的理论依据。方法采用RT-PCR、脂质体转染法构建mCLCA3增强绿色荧光型真核细胞表达模型,通过免疫荧光对mCLCA3真核表达情况进行分析,利用FluoStar Optima荧光仪对mCLCA3的氯离子通道功能进行测定分析。结果构建真核表达模型能够稳定高表达mCLCA3及增强型绿色荧光蛋白,适用于离子通道功能分析。结论成功构建了mCLCA3增强绿色荧光型真核细胞表达模型,并通过功能分析证明mCLCA3可能不是氯离子通道。

关键词： mCLCA3氯离子通道真核表达系统增强型绿色荧光蛋白

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基因工程真核表达系统的一颗明星

基因工程真核表达系统的一颗明星

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中国科协2001年学术年会

作者：马兴元沈阳农业大学

基因表达系统是基因工程及生物制药研究的重要工具,理想载体构建也是生命科学研究的热点。大肠杆菌不能表达结构复杂的蛋白质,而哺乳类和昆虫细胞表达系统虽能表达,但表达水平低,操作复杂造价昂贵。由于发酵和

关键词：真核表达系统基因工程甲醇营养型酵母外源蛋白

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汉逊酵母真核表达系统

汉逊酵母真核表达系统

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该项目成功开发了一种能高效表达外源基因的汉逊酵母表达系统。成功的建立了一整套从表达载体构建到产业化发酵和蛋白纯化的通用技术平台。根据外源基因的种类不同,每升发酵液的表达量可达0.1～10克,非常适合大、中、小规模的企业选用... 详细信息

标准号: hg07035213

该项目成功开发了一种能高效表达外源基因的汉逊酵母表达系统。成功的建立了一整套从表达载体构建到产业化发酵和蛋白纯化的通用技术平台。根据外源基因的种类不同,每升发酵液的表达量可达0.1～10克,非常适合大、中、小规模的企业选用。目前已成功的在该系统中表达了绿色荧光蛋白、具有生物学活性的霍乱毒素B亚单位基因和具有免疫学活性的乙肝表面抗原基因以及与CTB融合表达的口蹄疫VP1蛋白的主要抗原决定簇。目前该课题组还承担了在汉逊酵母中表达SARS病毒S基因和主要抗原表位基因的研究项目。另外,该课题组还与新疆农科院微生物研究所合作,首次在汉逊酵母中高效表达了牛促卵泡激素(bFSH)的α/β基因。

关键词：汉逊酵母真核表达系统

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HCV准种的结构蛋白在真核表达系统中的表达

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中华微生物学和免疫学杂志 2003年第10期23卷 821-821页

作者：陈嵩王宇明第三军医大学西南医院全军感染病研究所重庆400038

本实验从1份HCV持续性感染者血标本中随机筛选的8个C／E1／E2克隆序列亚克隆入真核表达载体pCI-neo，并转染大肠杆菌DH5α，经氨苄青霉筛选、酶切鉴定及DNA测序，构建为插入C／E1／E2的重组质粒。将1μg重组质粒、0.36mCi/ml H3-亮氨酸... 详细信息

本实验从1份HCV持续性感染者血标本中随机筛选的8个C／E1／E2克隆序列亚克隆入真核表达载体pCI-neo，并转染大肠杆菌DH5α，经氨苄青霉筛选、酶切鉴定及DNA测序，构建为插入C／E1／E2的重组质粒。将1μg重组质粒、0.36mCi/ml H3-亮氨酸加入TNT/T7 Couple Reticulootye Lysate Systems（含有25μl TNT Lysate、4U T7 RNA聚合酶、20μmol/L不含亮氨酸的氨基酸混合物、40U RNA酶抑制剂），总反应体积50μl。取5μl反应液进行12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，抽干凝胶，-70℃放射自显影3d。构建后的重组表达载体pCI-neo-HCV用EcoRI酶切下约1kb的目的片段和5.4kb的空载体。DNA测序证实，C／E1／E2片段的起始密码子置于T7启动子下游的翻译起始位点，插入片段起码正确及无提前出现的终止密码子。经真核表达系统内表达结构蛋白，放射自身显影可见电泳道出现1条清晰的蛋白质条带，相对分子质量约57*10~3，与HCV结构蛋白氨基酸序列推算出的蛋白分子量基本一致。然而，血标本的8个克隆中仅2个克隆表达结构蛋白。本研究以完整表达结构蛋白的重组载体为对照质粒，经亚克隆和宿主菌扩增，挑选8个阳性克隆在真核表达系统内表达蛋白；结果显示，5个重组载体可完整表达结构蛋白，3个重组载体不能表达结构蛋白，提示分子克隆导致碱基缺失及终止密码子提前出现。

关键词： HCV准种结构蛋白真核表达系统基因克隆基因表达丙型肝炎病毒

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