检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：兰丽盼浙江大学

学位级别：硕士

家蚕杆状病毒基因表达系统是高效的真核表达系统之一。借鉴国外AcMNPV Bac-to-Bac快速基因表达系统工作原理,我们曾构建了可利用我国特色经济资源昆虫一家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统。利用细菌转座子的基因定位转移作用,在大肠杆... 详细信息

家蚕杆状病毒基因表达系统是高效的真核表达系统之一。借鉴国外AcMNPV Bac-to-Bac快速基因表达系统工作原理,我们曾构建了可利用我国特色经济资源昆虫一家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统。利用细菌转座子的基因定位转移作用,在大肠杆菌内实现基因的重组,快速获得重组病毒。利用该系统,仅需要5-7天就能得到重组病毒。该系统由供体质粒、DH10BmBac细菌感受态细胞和家蚕培养细胞、家蚕幼虫组成,利用该系统能够在家蚕体内表达重组外源蛋白。　　在家蚕Bac-to-Bac快速表达系统中,供体质粒为重组病毒的构建提供含有目的基因表达框(启动子+多克隆位点)的转座元件,因此其中的表达框决定了所携外源蛋白的表达方式以及下游蛋白质纯化等的技术路线。然而目前常用的供体质粒如pFastBacHT只能满足一般的重组蛋白表达,没有信号肽序列,难于有效引导表达的外源蛋白分泌到胞外;另外,表达的蛋白由于N端含有较多的附加序列,从而有可能影响重组蛋白的表达效率和理化性质,并有可能进一步影响其生物学活性。　　针对上述问题,为了满足家蚕杆状病毒表达系统表达蛋白的不同需要,我们将商品化质粒pFastBacHT进行了如下改造:①将蛋白质分泌信号肽序列插入到pFastBacHT供体质粒中,使表达的重组蛋白能够有效分泌到细胞外。通过基因操作技术,将该杆状病毒信号肽序列gp67 signal sequence重组入pFastBacHT供体质粒中,得到了携带信号肽序列的供体质粒,我们将之命名为pBacGP67a,b,c。采用该供体质粒,表达的蛋白质就能够有效分泌到细胞外,从而有利于外源蛋白的分离纯化;②切除供体质粒pFastBacHT多克隆位点前冗长的附加序列,减少对外源重组蛋白的影响。将pFastBacHT供体质粒多克隆位点前的TEV序列删除,使重组蛋白的N端仅融合为方便重组蛋白纯化而设计的6×His序列。改造后的质粒命名为pFastShorta,b,c。　　利用上述构建的供体质粒并利用家蚕Bac-to-Bac表达系统,构建了表达新型抗癌基因工程抗体基因(T2融合蛋白)的重组病毒。分别在家蚕细胞和家蚕幼虫内进行了表达,分析了重组蛋白的表达规律,并利用亲和层析技术纯化了该重组蛋白。生物活性检测结果表明,家蚕幼虫中表达的T2蛋白具有较好的生物学活性,说明利用家蚕能够成功表达抗肿瘤蛋白。　　本研究的意义在于:①通过对商品化供体质粒pFastBacHT的改造,开发了两种不同用途的供体质粒,便于重组蛋白的分泌、表达和纯化,以满足不同目的的需要。②利用家蚕Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了新型抗癌基因工程抗体T2融合蛋白,摸索并掌握了该蛋白的表达规律、纯化方法,为将来该蛋白的大量生产和医学应用打好基础。

关键词：家蚕杆状病毒表达系统供体质粒基因表达真核表达系统融合蛋白

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利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统在昆虫Sf-9细胞中表达纳豆激酶基因

利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统在昆虫Sf-9细胞中表达纳豆激酶基...

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作者：李洁湖北大学

学位级别：硕士

杆状病毒Bac-to-Bac表达系统是目前最好的杆状病毒克隆表达策略，它作为一种真核表达系统，具有重组率高，重组过程时间迅速(10～15d可在大肠杆菌中完成)，有多种筛选标记且无需空斑纯化等优点。杆状病毒pFastHT载体系统上带有6个组氨... 详细信息

杆状病毒Bac-to-Bac表达系统是目前最好的杆状病毒克隆表达策略，它作为一种真核表达系统，具有重组率高，重组过程时间迅速(10～15d可在大肠杆菌中完成)，有多种筛选标记且无需空斑纯化等优点。杆状病毒pFastHT载体系统上带有6个组氨酸标签，在下游分离纯化时可以用镍柱直接分离纳豆激酶蛋白，可大大简化分离纯化步骤，并得到高纯度的纳豆激酶蛋白　　本实验利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统，在昆虫Sf-9细胞中活性表达了纳豆激酶基因，并初步探索了细胞感染后最佳病毒收获时间。实验得到的含有纳豆激酶蛋白的重组病毒可以直接感染昆虫，为在家蚕体系表达得到可直接服用的功能蛋白打下基础。　　本实验对来源于纳豆芽孢杆菌的纳豆激酶基因的表达进行了以下几个方面的研究工作：　　1、将编码纳豆激酶基因成熟肽的nk序列，编码前肽、成熟肽的pro-nk序列以及编码信号肽、前肽、成熟肽的pre-pro-nk序列分别克隆到供体质粒pFast-BacHTa上，构建了三个重组质粒，分别命名为pFnk1，pFnk2，pFnk3。　　2、用***10Bac中的穿梭载体Bacmid与重组质粒转座，使含有NK基因的表达盒插入Bacmid的Tn7att的接受位点，并处于ocu启动子控制之下，获得重组Bacmid。　　3、将挑选的阳性重组子DNA转染Sf-9细胞，取上清和细胞，细胞做破胞处理后，将上清和裂解液分别进行SDS-PAGE和western-blot分析，结果证明只有编码成熟肽的纳豆激酶基因有特征性的蛋白表达，而对照呈现阴性。以纤维蛋白平板法可检测到所表达的纳豆激酶蛋白活性，　　4、以重组病毒vAc-NK1感染状态良好的Sf-9细胞，分不同的时间段收集细胞，进行SDS-PAGE及纤维蛋白平板检测，结果显示在感染48小时后蛋白的表达量及活性达到最高。

关键词：纳豆激酶基因 Bac-to-Bac 真核表达系统重组病毒 Sf-9细胞杆状病毒

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毕赤酵母表达系统

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微生物学杂志 2003年第4期23卷 35-40页

作者：韩雪清刘湘涛尹双辉中国农业科学院

选择合适的表达系统是蛋白质体外成功表达的关键。毕赤酵母表达系统是一种新的、极具潜力的真核表达系统,其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点,正在得到越来越广泛的应用。较详细地综迷了毕赤酵母表达系统的特点、组成及影响... 详细信息

选择合适的表达系统是蛋白质体外成功表达的关键。毕赤酵母表达系统是一种新的、极具潜力的真核表达系统,其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点,正在得到越来越广泛的应用。较详细地综迷了毕赤酵母表达系统的特点、组成及影响其表达的因素等。

关键词：毕赤酵母表达系统真核表达系统基因组表达

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外源基因表达系统的研究进展

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科学技术与工程 2006年第5期6卷 582-587,592页

作者：郭广君吕素芳王荣富安徽农业大学生命科学学院合肥230036

最近20多年来,随着重组DNA技术的迅速发展,对于克隆基因表达问题的研究也日渐深入,并积累了相当丰富的知识。外源基因的表达系统包括原核表达系统和真核表达系统,它们各有优缺点,在选择时应衡量使用。

关键词：原核表达系统真核表达系统大肠杆菌表达系统酵母表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统

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β-NGF在真核细胞蛋白表达系统中的表达及活性鉴定

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牡丹江医学院学报 2002年第1期23卷 7-10页

作者：李贤慧王桂云王育强郭新民天津武警医学院牡丹江医学院

目的 :得到较高表达 ,且表达产物具有良好生物学活性的神经生长因子。方法 :将神经胶质源 β -NGF基因克隆于DNA转移载体pBacPAK8中 ,获得重组DNA转移载体pBacPAK -NGF ,与线性化Bm -BacPAK6修饰病毒基因组DNA共转染Bm -N细胞 ,经过体... 详细信息

目的 :得到较高表达 ,且表达产物具有良好生物学活性的神经生长因子。方法 :将神经胶质源 β -NGF基因克隆于DNA转移载体pBacPAK8中 ,获得重组DNA转移载体pBacPAK -NGF ,与线性化Bm -BacPAK6修饰病毒基因组DNA共转染Bm -N细胞 ,经过体内重组 ,筛选到重组病毒。用重组病毒感染家蚕幼虫 ,经SDS-PAGE检测及利用PC12细胞进行NGF生物活力测定。结果 :感染重组病毒BmNPV -NGF5d的家蚕血淋巴有一条与天然NGF单体分子易相近的蛋白组分 ,且有类似于小鼠 2 .5gNGF的活性。结论 :神经生长因子在家蚕幼虫中得到较高表达。

关键词：真核表达系统神经生长因子生物活性 β-NGF基因神经胶质源基因表达基因活性中枢神经系统疾病

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昆虫杆状病毒表达系统分泌型表达载体的构建和初步应用

昆虫杆状病毒表达系统分泌型表达载体的构建和初步应用

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中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议

作者：谢小燕程通管宝全张军夏宁邵厦门大学细胞生物学和肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门大学细胞生物学和肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门大学细胞生物学和肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门大学细胞生物学和肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门大学细胞生物学和肿瘤细胞工程教育部重点实验室

杆状病毒表达系统是目前普遍使用的真核表达系统之一,为改造其第五代产品——Bac-to-Bac系统,以简化表达产物的纯化步骤,对该系统的转移载体进行了改造,利用一种起源于昆虫的分泌肽蜂毒肽(melittin)建立新的融合表达转移载体.

关键词：分泌型表达载体昆虫杆状病毒表达系统真核表达系统初步应用

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人乳头瘤病毒16型突变型外壳蛋白高效表达系统的构建及目的蛋白的表达

人乳头瘤病毒16型突变型外壳蛋白高效表达系统的构建及目的蛋白的...

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第六届全国肿瘤学术大会

作者：李楠章文华孙亚洲周兰萍孙肖红中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所北京100021 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所病毒室北京100021

人乳头瘤病毒(human papilliomavirus,HPV)感染是宫颈癌的首要病因.HPV基因组由三个部分组成:非编码区、早期区、晚期区,晚期区开放阅读框架编码2个病毒外壳蛋白,L1和L2,以L1为主要外壳蛋白.HPV尚不能在体外培养,病变组织中病毒颗粒的... 详细信息

人乳头瘤病毒(human papilliomavirus,HPV)感染是宫颈癌的首要病因.HPV基因组由三个部分组成:非编码区、早期区、晚期区,晚期区开放阅读框架编码2个病毒外壳蛋白,L1和L2,以L1为主要外壳蛋白.HPV尚不能在体外培养,病变组织中病毒颗粒的含量又很少,严重限制了HPV疫苗的研究.但HPV L1蛋白可自组装成病毒样颗粒(virus-like particle,VLP).VLP与天然病毒具有相同的空间结构和免疫原性,是目前研究HPV感染免疫机制及其疫苗的最佳抗原释放系统[1].目前在多种原核和真核表达系统中均已表达了L1蛋白,如何获得高表达量产物一直是学者们研究的问题.研究发现,L1基因的突变可明显影响真核表达系统VLP的产量,突变L1基因在原核系统的表达情况尚不清楚.本研究以突变的L1基因片段构建原核表达为载体,比较其与原型L1表达产量的差异,并探索最佳表达条件.

关键词：乳头瘤病毒真核表达系统免疫机制

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巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

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微生物学杂志 2004年第2期24卷 42-45页

作者：王黎明王琦梅汝鸿中国农业大学农学与生物技术学院北京100094

巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统是近年来发展的一种优秀的真核表达系统 ,与传统的大肠杆菌和酿酒酵母表达体系相比 ,其具有的诸多优势使之研究价值及应用价值不断体现。综述了其在生物学特性、表达载体、基因整合、外源蛋白的分泌、诱... 详细信息

巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统是近年来发展的一种优秀的真核表达系统 ,与传统的大肠杆菌和酿酒酵母表达体系相比 ,其具有的诸多优势使之研究价值及应用价值不断体现。综述了其在生物学特性、表达载体、基因整合、外源蛋白的分泌、诱导表达及发酵等方面的基础研究及新近研究进展。

关键词：巴斯德毕赤酵母基因表达系统外源蛋白生物学特性表达载体基因整合真核表达系统

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杆状病毒表达系统的应用进展和展望

杆状病毒表达系统的应用进展和展望

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世界中医药学会联合会中医药抗病毒研究专业委员会第一届学术年会

作者：高敏闫滨山东中医药大学山东济南250355

杆状病毒表达系统是一个利用杆状病毒作为载体，在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统。自1983年Smith GE等人利用A cNPV成功表达外源蛋白以来，经过不到30年的发展，杆状病毒表达系统己经成为当今基因工程四大表达系统(... 详细信息

杆状病毒表达系统是一个利用杆状病毒作为载体，在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统。自1983年Smith GE等人利用A cNPV成功表达外源蛋白以来，经过不到30年的发展，杆状病毒表达系统己经成为当今基因工程四大表达系统(杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。其在生物医药、农业、疫苗研发等方面均获得广泛应用。通过对杆状病毒及其表达载体系统的描述，展开了系统流感疫苗，单纯疱疹病毒疫苗，肠道病毒疫苗，肝炎病毒疫苗以及人类免疫缺陷病毒疫苗研发。尽管昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)有着自己的特点和优势，但也不可避免的存在一定的不足，一是普遍存在于BEVS中重组蛋白易降解的问题;二是重组蛋白的表达量远远达不到理想的水平，为此，对杆状病毒表达载体系统进行了改进，随着对这一表达系统的基础理论研究的不断深入，新的调控因子及强的增强子也陆续被发现，杆状病毒表达载体系统必会发挥着不可估量的作用。

关键词：杆状病毒真核表达系统重组蛋白流感疫苗

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外源蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的策略

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生物化学与生物物理进展 2000年第5期27卷 496-500页

作者：刘国奇王海涛军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

高效表达外源蛋白 ,在生物制药中有重要意义 .中国仓鼠卵巢细胞 (Chinesehamsterovarycell)是表达外源蛋白的最佳真核表达系统之一 .影响外源蛋白在CHO细胞表达的因素甚多 ,主要包括载体、宿主细胞和外源基因几方面 .深入了解和灵活运... 详细信息

高效表达外源蛋白 ,在生物制药中有重要意义 .中国仓鼠卵巢细胞 (Chinesehamsterovarycell)是表达外源蛋白的最佳真核表达系统之一 .影响外源蛋白在CHO细胞表达的因素甚多 ,主要包括载体、宿主细胞和外源基因几方面 .深入了解和灵活运用它们之间的关系。

关键词：重组蛋白 CHO细胞真核表达系统生物制药

来源：评论

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