检索结果-内蒙古大学图书馆

真核表达质粒pCMV-脂联素的构建及其转染对高糖环境下肾系膜细胞增殖影响的研究

中国糖尿病杂志 2017年第7期25卷 649-654页

作者：冯敏温俊平吕琦黄国良福建省老年医院内分泌科 350003 福建省立医院内分泌科福建医科大学附属协和医院内分泌科

目的构建pCMV-脂联素(APN)真核表达质粒,观察转染小鼠肾系膜细胞后APN的表达以及对高糖环境下肾系膜细胞增殖的影响。方法通过RT-PCR扩增小鼠肾系膜细胞中APN基因片段,经酶切、纯化后与pcDNA3.1质粒连接构建pCMV-APN重组质粒。pCMV-APN... 详细信息

目的构建pCMV-脂联素(APN)真核表达质粒,观察转染小鼠肾系膜细胞后APN的表达以及对高糖环境下肾系膜细胞增殖的影响。方法通过RT-PCR扩增小鼠肾系膜细胞中APN基因片段,经酶切、纯化后与pcDNA3.1质粒连接构建pCMV-APN重组质粒。pCMV-APN重组质粒经酶切鉴定及DNA测序验证后,由脂质体转染将pCMV-APN真核表达质粒转导入肾系膜细胞中,Western blot检测转染后细胞中APN蛋白表达,MTT检测转染后细胞在高糖环境下增殖活性的变化。结果真核表达质粒pCMV-APN经酶切、测序鉴定后提示构建成功。转染后肾系膜细胞APN蛋白表达明显增高,且在高糖环境下的增殖活性较空载体转染组明显下降[(0.87±0.06)vs(0.60±0.01),P<0.05]。结论成功构建pCMV-APN真核表达质粒,能稳定表达于小鼠肾系膜细胞及抑制高糖的诱导增殖作用,为进一步研究APN的生物学功能奠定理论基础。

关键词：真核表达质粒 pCMV-脂联素肾系膜细胞转染细胞增殖

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真核表达质粒pBK-Fas的构建及转染舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑瘤效应

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安徽医科大学学报 2009年第4期44卷 437-442页

作者：胡芳芳陈乔尔孙麟何志良祖谷安徽医科大学口腔医学院合肥230032

目的研究Fas基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑制作用,构建Fas基因真核表达质粒pBK-Fas并将其转导入舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的Fas基因治疗提供实验基础。方法采用RT-PCR反转录成cDNA扩增Fas基因全长,亚克隆到真核表达载体pBK-CMV... 详细信息

目的研究Fas基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑制作用,构建Fas基因真核表达质粒pBK-Fas并将其转导入舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的Fas基因治疗提供实验基础。方法采用RT-PCR反转录成cDNA扩增Fas基因全长,亚克隆到真核表达载体pBK-CMV内,构建出重组真核表达质粒pBK-Fas,酶切鉴定并测序。脂质体法将pBK-Fas转染入Tca8113细胞,RT-PCR检测FasmRNA表达及半定量分析,琼脂糖凝胶电泳检测Fas转染细胞凋亡,流式细胞仪检测Fas蛋白表达。通过细胞生长曲线描记和软琼脂集落形成实验研究Fas基因的体外抑瘤效应。结果PCR扩增后的产物在约1008bp处出现明显的特异性条带,重组质粒pBK-Fas经酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的Fas基因片段。经检测Fas基因转染能提高FasmRNA表达水平、Fas蛋白表达强度,以及细胞凋亡指数。Fas基因转染能提高Fas蛋白的表达强度,由转染前的34.01±4.76上升到转染后的55.72±7.33,差异有统计学意义(P<0.01)。Fas转染细胞株在Fas抗体作用下能够有效启动Fas介导的细胞凋亡途径。MTT法检测细胞增殖抑制率的结果显示PBK-Fas转染组Tca8113细胞的增殖抑制作用最明显,表明Fas基因转染能增加舌鳞癌Tca8113细胞的增殖抑制率,结果与细胞生长曲线测定(计数法)结果具有一致性。软琼脂集落形成实验结果显示,与未转染细胞相比,重组质粒转染的Tca8113细胞群体倍增时间延长,克隆形成能力降低。结论Fas基因片段被成功插入真核表达载体pBK-Fas质粒的多克隆位点。Fas基因转染能有效的抑制体外培养的舌鳞癌Tca8113细胞的生长。

关键词：舌肿瘤癌,鳞状细胞转染基因疗法细胞凋亡Fas基因真核表达质粒

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真核表达质粒EX-Y2069-M 29的构建及LRP16基因在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中的表达

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中国现代医学杂志 2014年第30期24卷 8-13页

作者：伍宗惠詹平邹倩张宇骄刘玲泸州医学院附属医院妇产科四川泸州646000

目的构建LRP16基因真核表达质粒EX-Y2069-M29,检测LRP16基因在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中的表达。方法体外培养人子宫内膜癌HEC-1-B细胞,提取总RNA,应用PCR技术,扩增获得LRP16基因编码序列片段,克隆入真核表达载体EX-Y2069-M29,对重组... 详细信息

目的构建LRP16基因真核表达质粒EX-Y2069-M29,检测LRP16基因在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中的表达。方法体外培养人子宫内膜癌HEC-1-B细胞,提取总RNA,应用PCR技术,扩增获得LRP16基因编码序列片段,克隆入真核表达载体EX-Y2069-M29,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将LRP16真核表达载体EX-Y2069-M29和EX-NEG-M29空质粒转染细胞,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法分析LRP16基因的表达情况。结果经LRP16基因真核表达质粒EX-Y2069-M29转染的HEC-1-B细胞中检测到LRP16基因的表达。结论构建的LRP16基因重组真核表达质粒EX-Y2069-M29转染HEC-1-B细胞后,可在HEC-1-B细胞中稳定表达,为进一步研究LRP16基因奠定了基础。

关键词： LRP16基因真核表达质粒 HEC-1-B细胞

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真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

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中国组织工程研究与临床康复 2011年第28期15卷 5295-5298页

作者：王海红董为人张琳晏芳刘忠英李妍南方医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室广东省广州市510515

背景:阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的:构建tau基因的真核表... 详细信息

背景:阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的:构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。方法:采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)的总cDNA中,扩增出约1.0kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。结果与结论:人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。

关键词：基因克隆阿尔茨海默病 tau 转染真核表达质粒

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草鱼CD8α、CD207基因重组真核表达质粒的构建与表达分析

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水产学报 2022年第5期46卷 750-759页

作者：田丁李珂珂蒋飞陈春秀念子清吴志新陈孝煊华中农业大学水产学院湖北省水生动物病害防控工程技术研究中心

为进一步研究CD8α、CD207在草鱼树突状细胞(dendritic cells,DCs)中的功能，实验构建了草鱼CD8α、CD207基因重组真核表达质粒并在草鱼DCs中成功表达。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从草鱼DCs中获得CD8α、CD207开放阅读框序... 详细信息

为进一步研究CD8α、CD207在草鱼树突状细胞(dendritic cells,DCs)中的功能，实验构建了草鱼CD8α、CD207基因重组真核表达质粒并在草鱼DCs中成功表达。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从草鱼DCs中获得CD8α、CD207开放阅读框序列(ORF)，分别插入真核表达质粒pcDNA3.1，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-CD8α、pcDNA3.1-CD207；经测序鉴定正确后，采用脂质体法将重组真核表达质粒分别转染至草鱼树突状细胞，经细胞免疫荧光技术和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证CD8α、CD207的表达。结果显示，在蛋白免疫印迹实验中CD8α、CD207蛋白可正常表达，且大小与预测结果一致。细胞免疫荧光结果显示，CD8α、CD207蛋白主要在草鱼DCs的细胞膜上表达。本研究成功构建pcDNA3.1-CD8α、pcDNA3.1-CD207重组真核表达质粒，为后续研究CD8α、CD207基因在DCs中的作用机制奠定了基础。

关键词：草鱼树突状细胞 CD8α CD207 真核表达质粒

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鸡TIGAR基因真核表达质粒的构建及其抗凋亡功能评价

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中国农业科学 2019年第6期52卷 1102-1109页

作者：栗永华车路平仇旭升谭磊孙英杰刘炜炜宋翠萍廖瑛丁铲王金泉孟春春新疆农业大学动物医学学院中国农业科学院上海兽医研究所

【背景】TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧（Reactive oxygen species,ROS）并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】... 详细信息

【背景】TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧（Reactive oxygen species,ROS）并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】构建鸡源TIGAR基因的真核表达质粒,并检测TIGAR基因在DF1细胞中的抗凋亡作用,为建立稳定表达鸡TIGAR基因的细胞系做准备。【方法】根据GenBank（登录号:XM;17232.6）中预测基因设计引物,利用RT-PCR的方法从SPF鸡脾脏中扩增鸡TIGAR基因,将扩增产物克隆至载体（Flag-CMV14）后送公司测序验证;随后构建进化树对鸡TIGAR基因与其他哺乳动物及水生动物的TIGAR基因进行同源性分析。将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞24 h后,使用新城疫病毒诱导细胞凋亡,利用Western Blot检测重组质粒表达情况以及Poly ADP-Ribose Polymerase（PARP）裂解情况。此外还将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞,并于收样前2 h使用Staurosporine刺激细胞发生凋亡,分别在转染后24、48 h收集样品,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】RT-PCR扩增TIGAR基因,在843 bp处出现目的条带与预测相符,构建的TIGAR真核表达质粒（Flag-TIGAR）经测序,结果显示其序列与GenBank上预测的基本一致。Western Blot结果显示在30 h、36 h收集的样品中PARP均被裂解且转染重组质粒（Flag-TIGAR）的实验组与未转染质粒（MOCK）组或转染空载体（Flag-CMV14）组的样品相比,裂解的PARP表达量明显降低,且差异极显著（P<0.01）。流式结果显示:24 h检测转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为11%（早期凋亡7.8%,晚期凋亡3.2%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率仅为4%（早期凋亡3.7%,晚期凋亡0.3%）,转染Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR组,且差异显著（P<0.05）。48 h转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为20.3%（早期凋亡14.3%,晚期凋亡6.0%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率为6.4%（早期凋亡4.8%,晚期凋亡1.6%）,转染Flag-CMV14组的细胞早期凋亡和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR的组,且差异极显著（P<0.01）。【结论】成功扩增出鸡TIGAR基因,并构建了其真核表达质粒,通过Western Blot和流式实验均证实过表达TIGAR后可降低细胞的凋亡程度并有利于细胞存活。

关键词： TIGAR 真核表达质粒新城疫病毒抗凋亡鸡

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真核表达质粒pcDNA.3.1(+)-ACE2的构建及其在CHO细胞中的表达

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畜牧与兽医 2018年第1期50卷 54-58页

作者：肖航王凯王换换王鲲张源淑南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室

为了构建pcDNA.3.1（＋）-血管紧张素转化酶2（ACE2）真核表达质粒并检测在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达,从羊肾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增出ACE2基因,后将其与pcDNA3.1载体进行连接重组,构建pcDNA3.1（＋）-ACE2真核表达质粒,经H... 详细信息

为了构建pcDNA.3.1（＋）-血管紧张素转化酶2（ACE2）真核表达质粒并检测在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达,从羊肾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增出ACE2基因,后将其与pcDNA3.1载体进行连接重组,构建pcDNA3.1（＋）-ACE2真核表达质粒,经HindⅢ、XhoⅠ限制性内切酶双酶切及DNA序列测序分析等方法验证后,通过Lipofectamine 3000脂质体介导转染至CHO细胞,Western blot法检验ACE2基因在蛋白质水平上的表达。结果显示：RT-PCR扩增出大小约为2 200 bp特异ACE2基因片段,连接获得的pcDNA3.1（＋）-ACE2重组体经HindⅢ、XhoⅠ酶切后分别出现约2 200 bp和5 000 bp片段,测序分析与Gen Bank上公布的结果完全一致,表明成功克隆了重组pcDNA3.1（＋）-ACE2真核表达质粒,Western blot检测显示该pcDNA3.1（＋）-ACE2能在CHO细胞中表达。本研究成功构建了pcDNA3.1（＋）-ACE2真核表达质粒,并证实其能在CHO中表达,为后续探究ACE2蛋白活性及其作用的研究奠定了基础。

关键词：血管紧张素转化酶2(ACE 2) 真核表达质粒转染 CHO细胞

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抑癌基因PTEN真核表达质粒的构建及对乳腺癌MDA468细胞的影响

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中华肿瘤杂志 2005年第4期27卷 216-219页

作者：陈庆永陈道达王春友周友生华中科技大学同济医学院附属协和医院急诊外科武汉430022 华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科武汉430022

目的　研究外源性PTEN基因稳定转染对人乳腺癌MDA4 6 8细胞体外生长的影响。方法　先构建PTEN基因的真核表达质粒pcDNA3.1 - PTEN ,应用重组质粒pcDNA3.1 - PTEN和pcDNA3.1(- )空载体质粒,以脂质体转染法转染体外培养的人乳腺癌细胞株MD... 详细信息

目的　研究外源性PTEN基因稳定转染对人乳腺癌MDA4 6 8细胞体外生长的影响。方法　先构建PTEN基因的真核表达质粒pcDNA3.1 - PTEN ,应用重组质粒pcDNA3.1 - PTEN和pcDNA3.1(- )空载体质粒,以脂质体转染法转染体外培养的人乳腺癌细胞株MDA4 6 8,以未转染组为对照。应用RT PCR、免疫组化和免疫印迹方法分析目的基因及其蛋白表达,MTT法分析细胞生长抑制作用,AnnexinV FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果　稳定转染PTEN基因的细胞株有外源目的基因的整合和相应mRNA及其蛋白的高表达。MTT检测表明,pcDNA3.1 - PTEN转染组活细胞数低于未转染组和pcDNA3.1 - MDA4 6 8细胞转染组。流式细胞术显示,pcDNA3.1 - PTEN转染组凋亡率高于未转染组和pcDNA3.1 -MDA4 6 8细胞转染组。结论　外源性PTEN基因稳定转染可抑制人乳腺癌细胞的恶性表型。

关键词：真核表达质粒抑癌基因PTEN 外源性PTEN基因 pcDNA3 人乳腺癌细胞株 Annexin 流式细胞术检测细胞体外生长稳定转染脂质体转染法 RT-PCR 生长抑制作用目的基因细胞转染 MTT检测载体质粒重组质粒体外培养蛋白表达

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THY1基因真核表达质粒的构建及其对卵巢癌细胞SKOV3生长的影响

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生物医学工程学杂志 2009年第3期26卷 620-624页

作者：曾俐琴彭芝张铭广东省妇幼保健院妇科广州510010 四川大学华西第二医院妇科成都610041 广东省人民医院口腔科广州510080

构建THY1真核表达质粒并转染卵巢癌细胞SKOV3,探讨其对SKOV3细胞生长的影响。通过目的基因克隆,构建pcDNA3.1(+)-THY1质粒并转染SKOV3细胞,实验分3组:重组质粒转染组(SKOV3-THY1)、空质粒转染组(SKOV3-Null)和未转染组(SKOV3)。RT-PCR... 详细信息

构建THY1真核表达质粒并转染卵巢癌细胞SKOV3,探讨其对SKOV3细胞生长的影响。通过目的基因克隆,构建pcDNA3.1(+)-THY1质粒并转染SKOV3细胞,实验分3组:重组质粒转染组(SKOV3-THY1)、空质粒转染组(SKOV3-Null)和未转染组(SKOV3)。RT-PCR和免疫细胞化学方法鉴定THY1表达情况;MTT和流式细胞术检测THY1对SKOV3细胞增殖及周期的影响。DNA测序证实THY1正确插入pcDNA3.1(+)中,并整合于SKOV3细胞;SKOV3-THY1组的细胞抑制率明显高于SKOV3-Null组;且其G1期细胞比例明显高于另两组。结论:S期细胞比例明显低于另两组。结论:成功构建THY1真核表达质粒,该质粒可抑制SKOV3细胞生长。

关键词：基因 THY1 真核表达质粒卵巢癌细胞SKOV3

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真核表达质粒EX-Y2069-M29的构建并检测LRP16蛋白在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中的表达

真核表达质粒EX-Y2069-M29的构建并检测LRP16蛋白在人子宫内膜癌H...

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作者：张宇骄泸州医学院

学位级别：硕士

目的：构建LRP16基因真核表达质粒EX-Y2069-M29,为将其转染人子宫内膜癌HEC-1-B细胞,建立稳定表达L HEC-1-B RP16蛋白的细胞株,并检测LRP16蛋白在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中的表达。方法：采用PCR逆转录cDNA扩增LRP16基因全长,亚克隆到... 详细信息

目的：构建LRP16基因真核表达质粒EX-Y2069-M29,为将其转染人子宫内膜癌HEC-1-B细胞,建立稳定表达L HEC-1-B RP16蛋白的细胞株,并检测LRP16蛋白在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中的表达。方法：采用PCR逆转录cDNA扩增LRP16基因全长,亚克隆到真核表达载体pReceiver-M29内,构建出重组真核表达质粒EX-Y2069-M29,酶切及DNA测序证实重组质粒EX-Y2069-M29正确插入LRP16的核苷酸序列。脂质体法将EX-Y2069-M29转染HEC-1-B细胞,并用Western blot免疫印迹法检测在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中LRP16蛋白表达。结果：1、LRP16基因总RNA在提取进程中没有发生明显的降解,说明总获得的RNA和mRNA完整。PCR扩增后的产物在约980bp处出现明显的特异性条带,与理论预计的cDNA片段长度一致。2、LRP16基因真核表达质粒EX-Y2069-M29成功构建,重组质粒EX-Y2069-M29经酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的LRP16基因片段。3、Western blot免疫印迹法检测在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中LRP16蛋白表达。空白对照组和EX-NEG-M29组LRP16蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)；EX-Y2069-M29组与空白对照组LRP16蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)；EX-Y2069-M29组与EX-NEG-M29组LRP16蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：***16基因片段被成功插入真核表达载体EX-Y2069-M29质粒的多克隆位点,成功构建了LRP16基因的重组真核表达质粒EX-Y2069-M29。2.构建的LRP16基因重组真核表达质粒EX-Y2069-M29转染HEC-1-B细胞后,可在HEC-1-B细胞中稳定表达,为进一步研究LRP16基因奠定了基础。

关键词： LRP16基因真核表达质粒 HEC-1-B细胞基因表达

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