检索结果-内蒙古大学图书馆

中国实验血液学杂志 2019年第6期27卷 1812-1819页

作者：李君君廖佩文锋罗泽宇曹翊雄南华大学附属第一医院血液科

目的:构建人组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)核表达载体,探讨TFPI-2基因对急性单核细胞白血病细胞株(SHI-1)生长的影响。方法:通过基因化学合成的方式得到TFPI-2的cDNA,将TFPI-2基因和线性载体片段进行连接,并插入载体PEGFP-N1多克隆位点... 详细信息

目的:构建人组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)核表达载体,探讨TFPI-2基因对急性单核细胞白血病细胞株(SHI-1)生长的影响。方法:通过基因化学合成的方式得到TFPI-2的cDNA,将TFPI-2基因和线性载体片段进行连接,并插入载体PEGFP-N1多克隆位点处,再将真核表达载体PEGFP-N1-TFPI-2转染SHI-1细胞,在荧光显微镜下观察TFPI-2转染SHI-1细胞的情况;应用MTT法检测TFPI-2基因不同时间段对SHI-1细胞相对生长率的影响;RT-PCR检测TFPI-2转染前后每组细胞中TFPI-2 mRNA表达水平;采用Western blot法检测TFPI-2蛋白表达。将成功转染PEGFP-N1-TFPI-2载体的细胞命名为SHI-1-TFPI-2(实验组),转染空载体pEGFP-N1的细胞和未转染细胞设为对照组,分别命名为SHI-1-V和SHI-1-P。结果:成功构建了人TFPI-2基因真核表达载体PEGFP-N1-TFPI-2;将载体PEGFP-N1-TFPI-2转染SHI-1细胞,24 h后在荧光显微镜下可见荧光细胞,表明载体PEGFP-N1-TFPI-2成功转入SHI-1细胞;48和72 h后荧光细胞数目增多。RT-PCR结果显示:TFPI-2基因与内参β-actin条带灰度比值实验组高于对照组,灰度比值分别为:SHI-1-V组:0.51±0.04、SHI-1-P组:0.52±0.03、SHI-1-TFPI-2组:0.87±0.08;SHI-1-TFPI-2组与SHI-1-V和SHI-1-P组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PEGFP-N1-TFPI-2中TFPI-2基因的表达能抑制SHI-1细胞生长,此为未来白血病的基因治疗提供了研究方向。

关键词： TFPI-2基因真核表达载体 SHI-1细胞抑制

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负链不分节段RNA病毒反向遗传系统中通用型真核表达载体的构建

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病毒学报 2010年第1期26卷 65-70页

作者：黄莹唐青张守峰扈荣良中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室北京100052 军事医学科学院军事兽医研究所长春130062

本研究选择pVAX1作为供体载体,通过分子克隆方法,分别用人工合成的锤头型核酶、丁型肝炎核酶序列(用于获得转录后病毒基因组RNA的精确末端)和含有9个常用限制性酶切位点的linker序列(用于病毒基因组插入的多克隆酶切位点)取代真核表达载... 详细信息

本研究选择pVAX1作为供体载体,通过分子克隆方法,分别用人工合成的锤头型核酶、丁型肝炎核酶序列(用于获得转录后病毒基因组RNA的精确末端)和含有9个常用限制性酶切位点的linker序列(用于病毒基因组插入的多克隆酶切位点)取代真核表达载体pVAX1的多克隆酶切位点,将其改造成负链不分节段RNA病毒反向遗传系统的通用型表达载体。通过酶切鉴定和序列测定表明,pVAX1载体中插入的核酶及linker序列正确无误,并将CTN株狂犬病病毒全长基因组cDNA插入pVAX-R中,通过与辅助质粒的共转染成功拯救CTN株狂犬病毒,证明通用型真核表达载体构建成功,为快速建立负链不分节段RNA病毒反向遗传系统奠定基础。

关键词：负链不分节段RNA病毒反向遗传真核表达载体构建

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真核表达载体pEGFP-N1-ASIC2a的构建及功能验证

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中国现代医学杂志 2017年第11期27卷 8-13页

作者：李栋张康马晓芸袁维秀刘晓燕中国人民解放军总医院麻醉手术中心北京100853 军事医学科学院毒物药物研究所北京100850

目的构建含大鼠ASIC2a全长互补脱氧核糖核酸(cDNA)的绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFPN1-ASIC2a并转染至HEK293细胞,观察其表达和分布情况。方法设计、合成ASIC2a基因引物,利用聚合酶链反应(PCR)技术,以现有质粒pc DNA3.1-ASIC2a为模板扩... 详细信息

目的构建含大鼠ASIC2a全长互补脱氧核糖核酸(cDNA)的绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFPN1-ASIC2a并转染至HEK293细胞,观察其表达和分布情况。方法设计、合成ASIC2a基因引物,利用聚合酶链反应(PCR)技术,以现有质粒pc DNA3.1-ASIC2a为模板扩增出含有限制性内切酶(XhoⅠ与EcoRⅠ)酶切位点的ASIC2a基因片段与载体pEGFP-N1酶切后连接形成重组质粒pEGFP-N1-ASIC2a,并瞬时转染至HEK293细胞中,利用细胞膜片钳方法观察其表达电流的情况。为进一步明确其亚细胞定位,将质粒EGFPN1-ASIC2a、pDs Red-Monomer-Mem和pDs Red2-ER共同转染至HEK293细胞中。结果 PCR扩增得到正确的ASIC2a基因片段,酶切鉴定和测序证实获得重组质粒pEGFP-N1-ASIC2a,并将其瞬转至HEK293细胞后,成功记录到ASIC2a同聚体电流。然后利用共转染的方法观察到,pEGFP-N1-ASIC2a主要在HEK293细胞内质网表达,细胞膜表达较少。结论重组绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-ASIC2a构建成功,且在HEK293细胞中主要表达于内质网,为下一步研究ASIC2a的功能,特别是为ASIC2a在缺血性神经元损伤中的作用及其机制的研究奠定基础。

关键词： ASIC2a 载体构建真核表达载体绿色荧光蛋白

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真核表达载体pIRES2-EGFP-p16的构建及其在胶质瘤细胞C6内的表达

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中风与神经疾病杂志 2009年第2期26卷 173-175页

作者：李立宏秦怀洲王举磊梁秦川高国栋第四军医大学唐都医院神经外科陕西西安710038

目的构建真核表达载体pIRES2-EGFP-p16,并在神经胶质瘤细胞系C6中进行表达。方法用PCR的方法扩增p16基因,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-p16,经BamHⅠ及XhoⅠ双酶切鉴定并测序。通过脂质体法转染C6细胞,用荧光显微镜检测细胞中增强型绿... 详细信息

目的构建真核表达载体pIRES2-EGFP-p16,并在神经胶质瘤细胞系C6中进行表达。方法用PCR的方法扩增p16基因,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-p16,经BamHⅠ及XhoⅠ双酶切鉴定并测序。通过脂质体法转染C6细胞,用荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,用免疫组化染色的方法检测细胞中p16的表达。结果成功地构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-p16,用脂质体法转染神经胶质瘤细胞C6后,经荧光显微镜和免疫组化染色法检测,可见细胞内有EGFP及p16的表达。结论成功地构建真核表达载体pIRES2-EGFP-p16,并在神经胶质瘤细胞C6中表达,为研究p16对肿瘤的生物学作用以及p16在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础。

关键词： p16 EGFP 真核表达载体胶质瘤细胞C6

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小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建

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南方医科大学学报 2006年第2期26卷 144-149页

作者：沈丽佳方唯意谢思明何滢蒋会勇赵彤南方医科大学南方医院病理科广东广州510515

目的检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法设计寡核苷酸探针,应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2 基因含编码区全长cDNA,克隆入T载体,筛选阳... 详细信息

目的检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法设计寡核苷酸探针,应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2 基因含编码区全长cDNA,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR 获取含mCD99L2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切取所需目的片段,利用分子克隆技术与 pcDNA3．1／MycHis C(+)质粒重组,对产生的重组子进行PCR、双酶切鉴定,并经过测序证实。结果原位杂交方法检测 A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mCD99L2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结果与GenBank提供的已知序列(NM-138309)比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3．1-mCD99L2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99L2基因相应序列比较,100％同源。结论小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在 mCD99L2基因,采用RT-PCR和T-A技术克隆了A20细胞的mCD99L2基因,成功构建了pcDNA3．1-mCD99L2真核表达载体,为下一步探索mCD99L2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。

关键词：淋巴瘤 A20细胞株 mCD99L2 基因克隆真核表达载体

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无标记转Fat-1基因真核表达载体的构建及转基因绵羊细胞系的建立

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生物工程学报 2016年第2期32卷 212-221页

作者：阿力玛朱和平王瑞瑶闫涛苏小虎李璐王丙萍那顺温都乐齐贵春周欢敏内蒙古农业大学生命科学学院内蒙古自治区生物制造重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为了建立无筛选标记基因的转Fat-1基因绵羊细胞系,本研究将PCR克隆得到的Fat-1基因,合成的attB、Loxp序列并克隆入pN1-EGFP框架载体,得到可删除筛选标记基因的pEGFP-N1-Fat-1真核表达载体。体外转录合成phiC31整合酶mRNA并与线性化的pEG... 详细信息

为了建立无筛选标记基因的转Fat-1基因绵羊细胞系,本研究将PCR克隆得到的Fat-1基因,合成的attB、Loxp序列并克隆入pN1-EGFP框架载体,得到可删除筛选标记基因的pEGFP-N1-Fat-1真核表达载体。体外转录合成phiC31整合酶mRNA并与线性化的pEGFP-N1-Fat-1载体共转染绵羊胎儿皮肤成纤维细胞,G418筛选得到表达绿色荧光的单克隆,再利用pET-28a-His-NLS-TAT-Cre质粒诱导Cre重组蛋白表达,将纯化后的Cre穿膜肽转导表达绿色荧光的单克隆细胞,将荧光淬灭的细胞系扩繁,提取基因组DNA,进行PCR及测序鉴定,得到无标记转Fat-1基因绵羊胎儿皮肤成纤维细胞系,为生产无筛选标记基因的转基因绵羊奠定基础。

关键词： Fat-1基因真核表达载体筛选标记 phiC31整合酶

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真核表达载体介导的ICOSIg基因在大鼠脂肪间充质干细胞中表达的实验研究

真核表达载体介导的ICOSIg基因在大鼠脂肪间充质干细胞中表达的实...

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作者：耿洁天津医科大学

学位级别：硕士

目的干细胞疗法作为一种新的治疗技术,在器官移植领域具有极佳的应用前景,其中以间充质干细胞（mesenchymal stromal cells,MSCs）为主的治疗手段得到了大力发展。除了修复组织损伤外,MSCs还能定向迁移到组织损伤部位,并具有独特的免疫... 详细信息

目的干细胞疗法作为一种新的治疗技术,在器官移植领域具有极佳的应用前景,其中以间充质干细胞（mesenchymal stromal cells,MSCs）为主的治疗手段得到了大力发展。除了修复组织损伤外,MSCs还能定向迁移到组织损伤部位,并具有独特的免疫抑制特性,是靶向基因治疗的理想载体。可诱导共刺激分子（inducible co-stimulator,ICOS）作为CD28的同系物,其所提供的共刺激信号是T细胞免疫应答反应中不可缺失的一环。ICOS不在幼稚T细胞上表达,其表达水平在T细胞激活时迅速上调,且在静息记忆T细胞上组成型表达。ICOS共刺激信号可增强效应T细胞的活化、调节T细胞的功能及增强T细胞依赖性体液反应等。我们拟融合大鼠ICOS的胞外基因片段与人免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig）G Fc段基因,构建出的ICOSIg融合蛋白可通过竞争抑制阻断ICOS共刺激信号。本研究旨在通过基因工程技术将ICOSIg融合蛋白基因转导入大鼠脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stromal cells,ADSCs）,构建含ICOSIg基因的真核表达载体,探讨其能否在大鼠ADSCs中表达,并与大鼠异基因T淋巴细胞共培养,检测其是否抑制T淋巴细胞增殖。为进一步研究免疫耐受机制提供实验基础。方法 1.基因克隆:使用密度梯度离心法将大鼠的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）分离,按照TRIzol试剂盒说明提取PBMCs总核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）,并将RNA逆转录获得互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid,c DNA）,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增大鼠ICOS胞外区。另以真核表达载体p Igplus为模板,PCR扩增人IgG Fc段编码序列。IgG Fc片段酶切,再次琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段。 2.构建重组质粒:将酶切后的IgG Fc片段连接到真核细胞表达载体pcDNA3.1（+）,热休克法转化DH5α感受态大肠杆菌,培养后碱裂解法小量提取质粒。对酶切后质粒进行琼脂糖凝胶电泳,测序验证重组质粒构建成功。 3.构建真核表达载体:连接酶切后重组质粒pcDNA3.1（+）/IgG Fc与酶切后ICOS片段,将产物经热休克法转化DH5α感受态大肠杆菌,培养后碱裂解法小量提取质粒。质粒产物进行酶切,琼脂糖凝胶电泳,并测序鉴定真核表达载体构建成功,命名为pcDNA3.1（+）/ICOSIg。 ***分离培养:取雄性Lewis大鼠单侧腹股沟脂肪垫,进行ADSCs原代细胞提取和传代培养。 ***细胞表面抗原检测:应用流式细胞仪检测ADSCs细胞表面抗原, ***多向诱导分化:通过成脂、成骨、成胰岛样细胞诱导分化及染色鉴定ADSCs多向分化的潜能。 7.重组质粒转染ADSCs细胞:使用Amaxa高效电转仪通过预先设定的程序将真核表达载体pcDNA3.1（+）/ICOSIg质粒转染入大鼠ADSCs。培养结束后应用流式细胞仪对细胞表面标志物进行鉴定。 ***的表达分析:使用RIPA裂解液处理ADSCs并提取总蛋白。提出的蛋白使用免疫印迹法（Western blot）检测。 9.混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）:分别制备BN大鼠、Lewis大鼠脾细胞混悬液,使用尼龙毛柱法分离T淋巴细胞。在BN大鼠T淋巴细胞悬液加入丝裂霉素C（25μg/m L）作为刺激细胞,Lewis大鼠T淋巴细胞作为反应细胞。分为5组加入96孔板中,A组:反应细胞+刺激细胞组;B组:反应细胞+刺激细胞+ADSCs（2×10～3/孔）组;C组:反应细胞+刺激细胞+ADSCs-ICOSIg（2×10～3/孔）组;D组:反应细胞+刺激细胞+ADSCs-ICOSIg（2×10～4/孔）组;E组:反应细胞+刺激细胞+ADSCs-ICOSIg（2×10～5/孔）组。每组设3个复孔,并在37℃,5%CO2条件下常规培养。4天后,采用MTT比色法测定T淋巴细胞增殖程度。结果 1.成功构建pcDNA3.1（+）/ICOSIg,酶切后的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳后条带清晰、单一无拖带现象,且大小与目的基因大小一致,提示插入基因正确。选取经酶切鉴定正确的重组质粒中的插入片段测序,结果与Gen Bank上公布的目标序列一致,表明构建重组质粒的插入基因正确。 ***经传代培养后形态均一,主要呈长纺锤形,增长速度稳定。流式细胞分析ADSCs表面分子标志物显示,大于95%的细胞表达C

关键词：脂肪间充质干细胞可诱导共刺激分子受体 Fc 基因融合质粒真核表达载体

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真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP-MC1R的构建及在羊驼毛囊干细胞中的表达

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河北农业大学学报 2015年第3期38卷 86-90页

作者：白瑞王振华尹志红弓慧敏于志慧庞全海山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 山西医科大学晋祠学院山西太原030025

旨在构建含有MC1R基因的pcDNA3.1(+)真核重组表达载体,为进一步研究MC1R的生物学功能奠定基础。应用RT-PCR技术从羊驼皮肤cDNA文库中扩增MC1R基因全长cDNA,然后通过双酶切将MC1R基因全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),然后采用脂... 详细信息

旨在构建含有MC1R基因的pcDNA3.1(+)真核重组表达载体,为进一步研究MC1R的生物学功能奠定基础。应用RT-PCR技术从羊驼皮肤cDNA文库中扩增MC1R基因全长cDNA,然后通过双酶切将MC1R基因全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),然后采用脂质体法转染体外培养的羊驼毛囊干细胞后,通过G418筛选培养,建立稳定的转染体系,直接荧光观察pcDNA3.1/MC1R融合蛋白在细胞中的分布定位,并通过Western Blot方法检测MC1R在羊驼毛囊干细胞中的表达。结果表明,成功构建了pcDNA3.1/MC1R重组表达载体,并且发现试验组的毛囊干细胞中表达MC1R蛋白显著高于空白组(P<0.05)。成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.1/MC1R,且MC1R基因在羊驼毛囊干细胞中获得表达。

关键词：羊驼黑素皮质激素受体1 毛囊干细胞真核表达载体转染

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真核表达载体介导的ICOSIg基因在大鼠脂肪间充质干细胞中表达的实验研究

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天津医药 2020年第8期48卷 711-714页

作者：耿洁刘涛姜锦李光黄志伟王玉亮天津医科大学研究生院 300070 天津医科大学第二医院检验科天津市泌尿外科研究所天津市第一中心医院器官移植中心天津市第一中心医院口腔科天津医科大学基础医学院遗传学系

目的构建含可诱导共刺激分子(ICOS)融合蛋白(ICOSIg)基因的真核表达载体,探讨其能否在大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)中表达。方法克隆编码大鼠ICOS的胞外片段,将其与编码人免疫球蛋白IgG Fc段的基因融合,构建ICOSIg融合基因及其分泌型真... 详细信息

目的构建含可诱导共刺激分子(ICOS)融合蛋白(ICOSIg)基因的真核表达载体,探讨其能否在大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)中表达。方法克隆编码大鼠ICOS的胞外片段,将其与编码人免疫球蛋白IgG Fc段的基因融合,构建ICOSIg融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1(+)/ICOSIg。经测序鉴定后转染ADSCs,Western blot法检测ICOSIg在ADSCs中的表达。结果经测序鉴定验证pcDNA3.1(+)/ICOSIg质粒构建成功,且能在ADSCs中成功表达。结论ICOSIg在ADSCs中成功表达,为进一步研究免疫耐受机制提供了实验基础。

关键词：间充质基质细胞受体,Fc 基因融合质粒可诱导共刺激分子真核表达载体脂肪间充质干细胞

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真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

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郑州大学学报（医学版） 2005年第4期40卷 586-587页

作者：何炜张朝章茜赵国强董子明郑州大学基础医学院生理学教研室郑州450052 郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州450052 郑州大学基础医学院病理生理学教研室郑州450052

目的:构建含MAGE-1基因的重组真核表达质粒。方法:用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至pGEM-T载体,测序证实基因碱基序列无误后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒。结果与... 详细信息

目的:构建含MAGE-1基因的重组真核表达质粒。方法:用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至pGEM-T载体,测序证实基因碱基序列无误后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒。结果与结论:RT-PCR获得长度为927bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3.1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1-MAGE-1构建成功。

关键词： MAGE—1 pcDNA3.1(+) 真核表达载体

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