检索结果-内蒙古大学图书馆

中风与神经疾病杂志 1999年第6期16卷 341-343页

作者：赵永波李钰张贵寅关振中哈尔滨医科大学第二临床医学院神经科哈尔滨医科大学第二临床医学院医学遗传学研究室哈尔滨医科大学第二临床医学院心内科

目的构建一种无形成病毒及激活原癌基因可能的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｔＰＡ，以探讨其对纤溶活性影响，方法用分子克隆方法，将人ｔＰＡｃＤＮＡ与真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）重组，并对重组质粒进行ＤＮＡ测序。... 详细信息

目的构建一种无形成病毒及激活原癌基因可能的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｔＰＡ，以探讨其对纤溶活性影响，方法用分子克隆方法，将人ｔＰＡｃＤＮＡ与真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）重组，并对重组质粒进行ＤＮＡ测序。结果重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｔＰＡ经ＫｐｎⅠ和ＸｂａⅠ酶切后，出现了５．４ｋｂ与２．０ｋｂ两个片段；经ＰｓｔⅠ酶切后出现了７８ｂｐ，４１４ｂｐ，６２２ｂｐ，２．０ｋｂ及４．２ｋｂ五个片段；经ＥｃｏＲＩ酶切后，出现了４７２ｂｐ及６．９ｋｂ两个片段；测序结果证明为人全长ｔＰＡｃＤＮＡ。结论该新型表达质粒的构建为探讨基因防治脑梗死等血栓性疾病奠定了基础。

关键词：真核表达载体基因转移血栓形成 tPA

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真核表达载体PcDNA3.0-AIF△1-480构建及其促凋亡活性的研究

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中华肿瘤防治杂志 2013年第11期20卷 806-810页

作者：赵悦肖华卫王乐王丽娟李萌金桂花周侠朱青沧州市中心医院放疗科河北沧州061000 西安交通大学医学院附属第一医院肿瘤内科陕西西安710061

目的:构建AIF截短后只保留羧基端促凋亡结构域的真核表达载体,了解其是否有促凋亡活性作用及其机制。方法:通过PCR方法构建出AIF截短体AIF△1-480的真核表达载体。采用脂质体将该载体瞬时转染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,采用流式细胞技术... 详细信息

目的:构建AIF截短后只保留羧基端促凋亡结构域的真核表达载体,了解其是否有促凋亡活性作用及其机制。方法:通过PCR方法构建出AIF截短体AIF△1-480的真核表达载体。采用脂质体将该载体瞬时转染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,采用流式细胞技术检测其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用,同时采用JC-1流式细胞技术检测其对线粒体膜电位的影响。选取5～7周龄BALB/c雌性裸鼠35只,构建荷瘤裸鼠模型,并在体内实验中检测该载体的促凋亡活性作用。结果:成功构建真核表达载体PcDNA3.0-AIF△1-480,并经酶切鉴定和DNA测序证明。在体外实验中,与对照组相比该载体能够诱导MCF7细胞发生凋亡,对照组、PcDMA3.0组和PcDNA3.0-AIF△1-480组凋亡率分别为0.01%、16.01%和28.55%。同时MCF7细胞转染该载体后能够使线粒体膜电位发生去极化,导致凋亡的发生,对照组、PcD-MA3.0组和PcDNA3.0-AIF△1-480组凋亡率分别为2.26%、60.37%和95.78%。在荷瘤裸鼠模型中,转染该载体后能够抑制肿瘤的生长,至观察终点中位肿瘤体积分别为1 187.2、1 000.0和609.4mm3。结论:截短后只保留羧基端的AIF仍然有促凋亡活性作用,其机制是通过改变线粒体膜电位来发挥促凋亡作用。

关键词：真核表达载体 AIF 凋亡小鼠,裸

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真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达

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中国现代医学杂志 2007年第18期17卷 2211-2214页

作者：陈杰高下朱敏生张文程麻晓峰顾香芳南京大学医学院附属南京市鼓楼医院耳鼻咽喉科江苏南京210008 南京大学模式动物研究所江苏南京210061

目的构建真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,并验证其在HEK293T细胞中的表达。方法从人的全血标本中提取DNA模板,经PCR获得Hath1-cDNA,将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切,酶切产物琼脂糖凝胶电泳,割胶纯... 详细信息

目的构建真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,并验证其在HEK293T细胞中的表达。方法从人的全血标本中提取DNA模板,经PCR获得Hath1-cDNA,将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切,酶切产物琼脂糖凝胶电泳,割胶纯化,前者回收1065bp片断,后者回收大片断,再将回收的2个片断用T4DNA连接酶连接,转化感受态DH5α细胞,挑选单克隆,提取质粒,将所提取的质粒双酶切鉴定并测序。再将构建成功的pIRES2-DsRed2-Hath1质粒通过脂质体LipofectamineTM2000转染HEK293T细胞,观测其转染情况和目的基因的表达情况。结果成功地构建了真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,该质粒能有效地转染HEK293T细胞,目的基因能有效表达。结论pIRES2-DsRed2-Hath1的构建为Hath1基因转染致聋小鼠的耳蜗的实验奠定了基础。

关键词： Hath1 基因克隆真核表达载体脂质体

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小鼠NGF基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2003年第2期19卷 124-126,129页

作者：宋玫陈绍宗第四军医大学唐都医院整形外科陕西西安710038

目的 :构建小鼠 β NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法 :用基因重组技术 ,将小鼠 β NGF的成熟cDNA序列及其前导序列 ,克隆到真核表达载体 pcDNA3.1+中 ,用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂... 详细信息

目的 :构建小鼠 β NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法 :用基因重组技术 ,将小鼠 β NGF的成熟cDNA序列及其前导序列 ,克隆到真核表达载体 pcDNA3.1+中 ,用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENETM6方法 ,转染NIH 3T3细胞。转染后 72h ,用G4 18筛选阳性克隆并培养至 2 0d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Westernblot分析并观察该上清中NGF对PC12细胞突起生长的作用。结果 :β NGF基因在NIH 3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论 :重组真核表达载体 pcDNA3.1+/NGF构建成功 ,NGF蛋白在NIH 3T3细胞中表达 ,并具有良好的生物学活性。

关键词： β-神经生长因子真核表达载体 NIH3T3细胞系基因转染脂质体FuGENE^TM6

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内皮抑素真核表达载体对移植性卵巢癌的抑制作用

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中华妇产科杂志 2005年第6期40卷 396-399页

作者：魏增涛王晓燕董建春马春红赵东张艳孙汶生山东大学医学院妇产科教研室济南250012 山东大学医学院免疫学研究所济南250012 济南市中心医院病理科

目的探讨脂质体介导的内皮抑素真核表达载体对裸鼠移植性卵巢癌的抑制作用。方法利用已构建的内皮抑素真核表达载体pVAX1sEn,在脂质体介导下转染卵巢癌细胞系3AO细胞,RTPCR技术检测3AO细胞中内皮抑素mRNA的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA... 详细信息

目的探讨脂质体介导的内皮抑素真核表达载体对裸鼠移植性卵巢癌的抑制作用。方法利用已构建的内皮抑素真核表达载体pVAX1sEn,在脂质体介导下转染卵巢癌细胞系3AO细胞,RTPCR技术检测3AO细胞中内皮抑素mRNA的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测3AO细胞上清液中内皮抑素的水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测3AO细胞上清液中的内皮抑素对脐静脉内皮细胞系ECV204细胞的抑制作用。将荷卵巢癌移植瘤裸鼠分为3组,pVAX1sEn治疗组、pVAX1对照组和生理盐水对照组,分别观察3组卵巢癌的生长情况。结果RTPCR技术检测结果显示,在610bp处有一内皮抑素mRNA的特异性条带;ELISA法检测结果显示,pVAX1sEn转染3AO细胞后其上清液中内皮抑素水平为(201±8)ng/ml;MTT法检测结果显示,pVAX1sEn转染3AO细胞后其上清液中的内皮抑素可有效抑制ECV204细胞的生长,最高抑制率为42%。pVAX1sEn治疗组肿瘤体积为(0.85±0.18)cm3,显著小于生理盐水对照组的(1.90±0.28)cm3和pVAX1对照组的(1.78±0.32)cm3(P<0.05)。肿瘤组织HE染色显示,pVAX1sEn治疗组肿瘤细胞坏死明显,而生理盐水对照组及pVAX1对照组肿瘤细胞生长旺盛。结论脂质体介导的pVAX1sEn瘤内注射可有效抑制卵巢癌移植瘤的生长。

关键词：真核表达载体内皮抑素抑制作用移植性 3AO细胞酶联免疫吸附实验脐静脉内皮细胞系脂质体介导 PCR技术检测四甲基偶氮唑蓝卵巢癌细胞系生理盐水检测结果 ELISA法肿瘤细胞坏死肿瘤细胞生长 mRNA 对照组上清液

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FGFR3真核表达载体的构建及其在人白血病细胞系K562中的表达

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吉林大学学报（医学版） 2014年第3期40卷 465-470页

作者：许会静杜彤华孙艳李校堃肖业臣吉林大学基础医学院生物化学教研室吉林长春130021 吉林医药学院检验学院临床生物化学检验教研室吉林吉林132013 吉林大学第二医院肿瘤血液内科吉林长春130041

目的:构建成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)真核表达载体MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/purofgfr3-DN,并检测FGFR3蛋白在人白血病细胞系K562中的表达。方法:通过PCR法获得FGFR3全长基因(fgfr3-WT)和截短失活型的FGFR3(fgfr3-DN),经双酶切后与真核表达载体MSCV/puro连接,构建MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组表达质粒。经PCR、双酶切及测序鉴定正确后,脂质体介导转染至人白血病细胞系K562中,经puromycin抗性筛选后,Western blotting法和流式细胞术检测细胞中FGFR3蛋白的表达。结果:PCR法鉴定MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组质粒,2个质粒分别扩增出2 400bp的fgfr3-WT全长基因片段和1 200bp的fgfr3-DN截短型片段,表明成功扩增fgfr3-WT全长基因和1 200bp的fgfr3-DN基因;双酶切MSCV/puro-fgfr3-WT重组质粒,获得2 400bp的目的基因片段;测序显示,fgfr3-WT片段大小为2 400bp,Blast对比分析表明测序结果与GenBank中的FGFR3序列完全一致。fgfr3-DN片段大小与预先设计的序列完全一致,表明成功构建野生型FGFR3和突变失活型FGFR3真核表达载体;Western blotting检测,与对照组(K562-MSCV)比较,MSCV/puro-fgfr3-WT转染组(K562-WT)FGFR3蛋白表达水平增加,表达水平是对照组的10倍以上;MSCV/puro-fgfr3-DN转染组(K562-DN)的截短型的FGFR3(K562-DN)高表达,而对照组和K562-WT转染组则无此片段;流式细胞术检测,K562-WT组有57.5%的细胞高表达FGFR3,K562-DN组有41.5%的细胞高表达FGFR3-DN。结论:成功构建高表达野生型和突变型FGFR3的人白血病细胞系K562。

关键词：受体,成纤维细胞生长因子,3型真核表达载体 K562 细胞系基因转染白血病,粒-单核细胞,慢性

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葡萄糖调节蛋白75基因突变体及其真核表达载体构建

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生理学报 2009年第6期61卷 533-538页

作者：郭纬纬杨玲刘晓宇刘雯左伋复旦大学上海医学院细胞与遗传医学系上海200032

葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein75,Grp75)与细胞内的p53结合抑制其核移位,起到了保护细胞的作用。为研究Grp75和p53的结合与否是如何影响细胞活力,现构建Grp75缺失突变基因的真核表达载体。以SOE-PCR(genesplicing by over... 详细信息

葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein75,Grp75)与细胞内的p53结合抑制其核移位,起到了保护细胞的作用。为研究Grp75和p53的结合与否是如何影响细胞活力,现构建Grp75缺失突变基因的真核表达载体。以SOE-PCR(genesplicing by overlap extension)法得到Grp75缺失突变基因,与pcDNA3.0真核表达载体连接,构建Grp75缺失突变的特异性表达载体pcDNA3.0/Grp75(Δ253-282),经酶切、测序鉴定Grp75缺失突变蛋白表达载体成功构建。用脂质体将pcDNA3.0/Grp75(Δ253-282)转染到PC12细胞株,以1mg/mL浓度的G418筛选出稳定株,并命名为PC12/Grp75(Δ253-282)(+)。半定量RT-PCR和Western blot结果显示PC12/Grp75(Δ253-282)(+)细胞组内Grp75的mRNA和蛋白的表达水平较PC12细胞组增高。对PC12细胞组、PC12/Grp75(Δ253-282)(+)细胞组和PC12/Grp75(+)细胞组(pcDNA3/Grp75真核表达载体已构建)分别缺糖0h、3h、9h、18h和36h,MTT法检测各组细胞活力,Hoechst33324法检测细胞凋亡情况。结果显示PC12/Grp75(+)组细胞活力高于其它两组,PC12/Grp75(Δ253-282)(+)组高于PC12组,差异有统计学意义。Hoechst33324染色后,凋亡细胞的比率与MTT细胞活力检测结果基本一致。Western blot检测三种细胞内p53的表达量,PC12/Grp75(+)细胞内p53蛋白表达量低于另外两组,可能是由于Grp75蛋白量的增多部分抑制了p53的表达,提示Grp75对缺糖诱导细胞凋亡的抑制作用部分与p53的结合有关。以上结果表明Grp75基因的缺失突变在一定程度上降低了细胞的活力。

关键词：葡萄糖调节蛋白75 缺失突变真核表达载体细胞活力

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真核表达载体pEGFP-C2-GATA-4的构建及其在P19细胞中的表达

真核表达载体pEGFP-C2-GATA-4的构建及其在P19细胞中的表达

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作者：王巍河北医科大学

学位级别：硕士

目的:移植不同来源的干细胞以修复梗死的心肌组织、改善心功能已成为目前研究的热点。虽然人们已成功地将非心源性的干细胞(如胚胎干细胞、造血干细胞和骨骼肌卫星细胞等),移植至梗死的心肌区域并观察到它们分化成心肌样细胞,但是对于... 详细信息

目的:移植不同来源的干细胞以修复梗死的心肌组织、改善心功能已成为目前研究的热点。虽然人们已成功地将非心源性的干细胞(如胚胎干细胞、造血干细胞和骨骼肌卫星细胞等),移植至梗死的心肌区域并观察到它们分化成心肌样细胞,但是对于这一横向分化的具体机制所知甚少。目前移植技术的发展,体内外调控干细胞向心肌定向分化的因素和作用机制的探讨均提示:通过移植干细胞再生心肌以治疗心肌梗死疾病已经具有一定的理论基础而且拥有广阔的应用前景。目前尚需进一步研究明确干细胞向心肌细胞的定向分化调控因素与机制,以提高干细胞的心肌分化,加速干细胞安全可靠地应用于临床。 GATA-4是胚胎期心脏发生发育过程中起重要作用的转录因子,参与心脏前体细胞的分化、心脏的环化、房室分隔、传导系统及成熟心脏正常功能的维持。GATA-4主要通过其特有的锌指结构在胚胎发育过程中发挥重要作用,当GATA-4基因发生缺失或突变时就会引起各种心脏疾病。GATA-4因子是心脏前体细胞的最早期标志之一,对于心脏发育是必不可少的。GATA-4因子首先在心前期中胚层中表达,随后在心内膜和心肌中表达。GATA-4因子调节心肌细胞的发生、分化以及心肌前体细胞形成线状心管。GATA-4的表达对心肌细胞标志物的转录和表达至关重要。P19胚胎癌细胞(embryonal carcinoma cells,EC)经诱导可分化为包括心肌在内的多种细胞,在P19细胞向心肌分化的过程中,其细胞发育相关基因的表达及电生理特性与正常小鼠心肌发育过程相似,且该细胞易于进行基因操作,是研究心肌细胞发育的良好体外模型。为进一步研究转录因子GATA-4在心脏发育及心肌分化中的作用,本研究构建了含有小鼠GATA-4编码框的pEGFP-C2-GATA-4真核表达载体,并在P19细胞中瞬时表达成功,为进一步研究心特异转录因子的功能及调控机制奠定基础。方法: 1以真核表达质粒pEFSA-GATA-4为模板,PCR扩增得到小鼠GATA-4基因片段,将目的片段亚克隆到pEGFP-C2载体,卡那霉素筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定正确。2将重组质粒pEGFP-C2-GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞,以免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA-4-EGFP融合蛋白在P19细胞中的表达。结果: 1经PCR获得1325bp的产物,经酶切、DNA测序,确定所扩增片段为GATA-4基因cDNA,进而成功筛选出表达载体pEGFP-C2-GATA-4。2转染后的P19细胞中通过免疫细胞化学,RT-PCR,Western blot等方法分别从基因和蛋白水平证明P19细胞中有GATA-4基因的表达。结论:获得编码GATA-4的基因片段,并成功构建了其真核表达载体pEGFP-C2-GATA-4。在其转染的P19细胞中有GATA-4基因表达。GATA-4基因cDNA真核表达载体的成功构建以及在P19细胞中的表达的特点显示了极具意义的潜在应用价值。心脏发育的转录调控是个极其复杂的过程,是一个多种转录调控因子参与的联合协同运作的网络系统,而GATA-4因子在其中扮演关键的角色。GATA-4因子不仅调控心脏结构基因的表达,而且还调控许多其它转录调控因子的表达。由GATA-4因子出发我们可以绘制出一份复杂的心脏发育转录调控网络,不仅可以增进我们对心脏发育分子调控机制的认识,还可以增进对心脏疾病发病机制的认识,使心脏疾病早期干预和基因治疗成为可能,为根治心脏疾病提供了一条切实有效的途径。

关键词：转录因子 GATA-4 真核表达载体克隆表达心肌瞬时转染

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人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

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中华肿瘤杂志 2008年第3期30卷 179-183页

作者：王峰王留兴王瑞林樊青霞赵培荣郑州大学第一附属医院肿瘤内科 450052

目的构建人微管不稳定蛋白基因（stathmin）真核表达载体，研究其对食管癌细胞EC9706的作用。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增stathmineDNA，克隆至pMD18-T载体并酶切鉴定后，亚克隆至pEGFP—C2真核表达载体。将测序鉴定正... 详细信息

目的构建人微管不稳定蛋白基因（stathmin）真核表达载体，研究其对食管癌细胞EC9706的作用。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增stathmineDNA，克隆至pMD18-T载体并酶切鉴定后，亚克隆至pEGFP—C2真核表达载体。将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞，G418筛选获得稳定转染的细胞株。通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达，采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白（EGFP）和stathmin融合蛋白的表达。选取稳定转染的细胞株，采用细胞计数法绘制细胞生长曲线，采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态，平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性。结果RT—PCR扩增获得450bp的eDNA编码序列；克隆至pMD18-T载体，经酶切鉴定后获反向插入质粒；亚克隆至pEGFP—C2载体后，经酶切与测序鉴定，重组载体pEGFP—stathmin构建成功。重组载体和空载体转染EC9706细胞，G418筛选获得稳定转染的细胞株。通过荧光显微镜观察到，转染细胞中呈现绿色荧光；经Western blot证实，重组载体表达46000的融合蛋白。与空载体转染细胞相比，转染重组载体的EC9706细胞形态变大，增殖速度减慢，细胞分裂阻滞于G2／M期，细胞克隆形成数减少，裸鼠体内成瘤性降低（P〈0．05）。结论构建的真核表达载体pEGFP—stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达，并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性。

关键词：人stathmin基因真核表达载体 EC9706细胞

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羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建、表达及其免疫原性

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病毒学报 2008年第2期24卷 133-137页

作者：陈轶霞才学鹏景志忠丁军涛王颖蒙学莲张燕贾万忠乔军闫鸿斌房永祥陈国华骆学农中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

通过PCR方法扩增全长P32基因和截去跨膜区的P32基因(MP32),将其分别克隆到真核表达载体pcDNA3·1(+)和已插入CpG序列的pcDNA3·1-CpG中,构建pcDNA3·1-P32、pcDNA3·1-CpG-P32和pcDNA3·1-CpG-MP32质粒;用脂质体法... 详细信息

通过PCR方法扩增全长P32基因和截去跨膜区的P32基因(MP32),将其分别克隆到真核表达载体pcDNA3·1(+)和已插入CpG序列的pcDNA3·1-CpG中,构建pcDNA3·1-P32、pcDNA3·1-CpG-P32和pcDNA3·1-CpG-MP32质粒;用脂质体法转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)试验验证其表达效果;经肌肉免疫注射健康BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测抗体;在免疫后的第3、5周取免疫小鼠的脾细胞,用流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞亚群。结果所构建的真核表达载体在BHK-21细胞中都能表达P32蛋白;免疫小鼠血清在免疫第2周后均能检测到羊痘特异性IgG抗体;免疫组小鼠脾脏CD4+T细胞数目和CD4+/CD8+T细胞比值明显高于对照组。结果提示,所构建的真核载体可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,并能刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答。

关键词：羊痘病毒 P32基因真核表达载体表达免疫原性

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