检索结果-内蒙古大学图书馆

STIM2、TRPC3在人脐静脉内皮细胞外钙敏感受体介导的钙内流和NO生成中的作用

中国应用生理学杂志 2014年第4期30卷 327-332,I0001页

作者：王静钟华赵慧王腊梅庞丽娟孙志萍何芳新疆石河子大学医学院地方病与民族高发病教育部重点实验室新疆石河子832002 新疆石河子大学医学院病理生理教研室新疆石河子832002 沧州高等医学专科学校河北沧州061001 新疆石河子大学医学院病理教研室新疆石河子832002 新疆石河子大学医学院医学机能实验中心新疆石河子832002

目的:研究Ca2+感受蛋白基质相互作用分子2(STIM2)及瞬时型感受器电位3(TRPC3)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞外钙敏感受体(CaR)介导钙内流和NO生成中的作用。方法:1免疫荧光技术检测HUVEC中STIM2和TRPC3的蛋白表达。2利用转染技术将构建... 详细信息

目的:研究Ca2+感受蛋白基质相互作用分子2(STIM2)及瞬时型感受器电位3(TRPC3)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞外钙敏感受体(CaR)介导钙内流和NO生成中的作用。方法:1免疫荧光技术检测HUVEC中STIM2和TRPC3的蛋白表达。2利用转染技术将构建的STIM2干扰质粒(STIM2shRNA)和TRPC3干扰质粒(TRPC3shRNA)分别转染入HUVEC,实时定量RT-PCR和Western blot检测STIM2shRNA、TRPC3shRNA转染后的抑制效率。3取2~5代细胞随机分组:实验组(即精胺+Ca2++shSTIM2-002组和精胺+Ca2++shTRPC3-004组),其余两组分别为对照组(Control组,即精胺+Ca2+组),空质粒组(Vehicle组,即精胺+Ca2++Vehicle组),分别将上述4组细胞与CaR激动剂孵育,各组用荧光探针Fura-2/AM、DAF-FM负载方法同步测定[Ca2+]i和NO生成的变化。结果:1免疫荧光技术检测显示STIM2和TRPC3两者均表达于HUVEC胞浆。2实时定量RT-PCR及Western blot检测结果显示:与Control组相比,shSTIM2-002和shTRPC3-004干扰后,STIM2和TRPC3mRNA的表达均明显降低(抑制率分别为88.2%和74.0%,P<0.05);STIM2和TRPC3蛋白的表达亦明显降低(抑制率分别为79.9%和71.8%)(P<0.05)。3[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值的测定结果显示:与精胺+Ca2+组的[Ca2+]i、NO净荧光强度值相比,精胺+Ca2++ShSTIM2-002组、精胺+Ca2++ShTRPC3-004组及精胺+Ca2++Vehicle组均无显著差异(均P>0.05)。结论:STIM2和TRPC3均未单独参与CaR介导的Ca2+内流和NO的生成过程。

关键词： Ca2+感受蛋白基质相互作用分子2 瞬时型感受器电位3 一氧化氮钙离子人脐静脉内皮细胞

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TRPC1、3在人脐静脉内皮细胞CaR介导Ca2+内流及NO生成中的作用和机制

TRPC1、3在人脐静脉内皮细胞CaR介导Ca2+内流及NO生成中的作用和...

引用

作者：王静石河子大学

学位级别：硕士

目的：1探讨瞬时型感受器电位1、3（TRPC1、3）在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）钙敏感受体（CaR）介导钙离子(Ca2+)内流和一氧化氮（NO）生成的作用和机制。方法：（1）胰蛋白酶消化原代培养HUVEC，倒置显微镜下进行细胞形态学观察及免疫... 详细信息

目的：1探讨瞬时型感受器电位1、3（TRPC1、3）在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）钙敏感受体（CaR）介导钙离子(Ca2+)内流和一氧化氮（NO）生成的作用和机制。方法：（1）胰蛋白酶消化原代培养HUVEC，倒置显微镜下进行细胞形态学观察及免疫细胞化学法测Ⅷ因子对其进行抗原鉴定。（2）用钙池操纵的钙离子通道（SOC）阻滞剂和/或受体操纵钙离子通道（ROC）阻滞剂分别和/或联合孵育细胞，采用Western blotting技检测TRPC1和TRPC3蛋白的表达。（3）免疫细胞化学技术检测TRPC1、TRPC3蛋白表达及定位。（4）利用转染技术将构建的TRPC1RNA、TRPC3RNA干扰质粒（TRPC1shRNA、TRPC3shRNA）转染入HUVEC中，实时定量RT‐PCR和Western blotting检测TRPC1shRNA、TRPC3shRNA转染后的抑制效率。（5）取2～5代细胞随机分组：实验组(即精胺+Ca2++shTRPC1组和精胺+Ca2++shTRPC3‐004组)，其余两组分别为对照组(Control组，即精胺+Ca2+组)，空质粒组(Vehicle组，即精胺+Ca2++Vehicle组)，分别将上述4组细胞与CaR激动剂（SOC和ROC均激活）、ROC模拟剂TPA及CaR负性变构调节剂Calhex231（激活ROC、阻断SOC）、PKC抑制剂Ro31‐8220和经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6976（阻断ROC、激活SOC）孵育，各组用荧光探针DAF‐FM、Fura‐2/AM负载方法同步测定NO生成和[Ca2+]i的变化。（6）实验数据用均数±标准误表示，组间比较用单因素方差分析，均数间的比较采用t检验或卡方检验。所有数据采用SPSS17.0统计软件包进行分析，以p<0.05表示差异有统计学意义。结果：（1）细胞形态学与免疫细胞化学法测Ⅷ证实原代培养的细胞为HUVEC。（2） HUVEC经SOC阻滞剂和/或ROC阻滞剂分别和/或联合处理后，TRPC1和TRPC3蛋白的表达检测结果显示：各加药组与Control组(精胺+Ca2+组)相比，均无统计学意义（P>0.05）。（3）免疫细胞化学技术检测显示：TRPC1和TRPC3蛋白表达于胞浆，两者共定位于胞浆。（4） Westernng blotting检测结果显示：与Control组相比，shTRPC1和shTRPC3‐004干扰后，TRPC1和TRPC3蛋白的表达均降低（抑制率分别为83.4%和71.8%）(p<0.05)，实时定量PCR检测结果显示：与Control组相比，shTRPC1和shTRPC3‐004干扰后，TRPC1和TRPC3mRNA的表达均降低（抑制率分别为39.0%和74.0%）(p<0.05)。（5）[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值的测定结果如下：与精胺+Ca2+组的[Ca2+]i （△ratio=7.54±0.18）、NO净荧光强度值（846.39±68.13）相比，精胺+Ca2++ShTRPC1组（△ratio=5.73±0.15）、（137.82±14.22）均明显降低（p<0.05）；而精胺+Ca2++Vehicle组（△ratio=7.66±0.13）、（724.96±20.72）；精胺+Ca2++ShTRPC3‐004组（△ratio=7.37±0.12）、（794.685±20.60）没有显著差异（p＞0.05）。与Calhex231+TPA+精胺+Ca2+组的[Ca2+]i（△ratio=4.64±0.07）、NO净荧光强度值（176.20±14.13）相比，Calhex231+TPA+精胺+Ca2++ShTRPC1组（△ratio=2.67±0.07）、（58.65±5.05）均明显降低（p<0.05）；而Calhex231+TPA+精胺+Ca2++Vehicle组（△ratio=4.43±0.14）、（175.31±16.89）；Calhex231+TPA+精胺+Ca2++ShTRPC3‐004组（△ratio=4.51±0.12）、（150.71±6.08）没有显著差异（p＞0.05）。与与Ro31‐8220+精胺+Ca2+组的[Ca2+]i （△ratio=6.03±0.05）、NO净荧光强度值（214.96±7.83）相比， Ro31‐8220+精胺+Ca2++ShTRPC1组（△ratio=3.41±0.09）、（57.97±7.14）均明显降低（p<0.05）；而Ro31‐8220+精胺+Ca2++Vehicle组（△ratio=5.90±0.03）、（207.34±10.2）； Ro31‐8220+精胺+Ca2++ShTRPC3‐004组（△ratio=5.90±0.0

关键词：瞬时型感受器电位1 瞬时型感受器电位3 一氧化氮钙离子人脐静脉内皮细胞

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