检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：谭小力王秋叶侯继波王政张志燕陈克平唐应华郑香峰 212013 江苏省镇江市学府路301号

本发明属于基因工程和蛋白质表达领域，涉及一种利用烟草瞬时表达系统表达禽流感病毒血凝素（HA）基因。所述的Re-5疫苗株血凝素（HA）基因，序列如SEQIDNO.1所示。通过基因工程方法，该基因在烟草叶片中表达。发现HA主要在烟草的细胞... 详细信息

标准号: CN102643837A

本发明属于基因工程和蛋白质表达领域，涉及一种利用烟草瞬时表达系统表达禽流感病毒血凝素（HA）基因。所述的Re-5疫苗株血凝素（HA）基因，序列如SEQIDNO.1所示。通过基因工程方法，该基因在烟草叶片中表达。发现HA主要在烟草的细胞间隙表达，三个含目的基因的构建都能表达Re-5疫苗株血凝素（HA）基因，Kozak-HA-6×His-pB2GW7.0(DelateBar)表达载体Re-5疫苗株血凝素（HA）基因的表达量最高。本发明还发现烟草注射Kozak-HA-6×His-pB2GW7.0(DelateBar)表达载体后，Re-5疫苗株血凝素（HA）基因在第六天表达量最高。

关键词：血凝素疫苗株基因表达载体烟草禽流感病毒血凝素基因工程方法瞬时表达系统蛋白质表达基因的表达基因工程目的基因细胞间隙烟草叶注射发现

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一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法、系统及应用

一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法、系统...

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作者：陈太钰毛毳郑婕张扬吴昊黄维峰李传红叶红王兰 512005 广东省韶关市浈江区大学路288号

本发明公开了一种高效的片段组装方法并应用于快速的植物细胞原生质体瞬时表达系统。利用合成生物学的方法在体外构建DNA片段基因表达盒，将纯化后的DNA片段基因表达盒直接进行原生质体转化，实现目的基因瞬时表达。与传统的载体构建及... 详细信息

标准号: CN117683807A

本发明公开了一种高效的片段组装方法并应用于快速的植物细胞原生质体瞬时表达系统。利用合成生物学的方法在体外构建DNA片段基因表达盒，将纯化后的DNA片段基因表达盒直接进行原生质体转化，实现目的基因瞬时表达。与传统的载体构建及原生质体瞬时表达系统相比，本发明避免了构建载体和抽提质粒的繁琐程序，具备耗时短，见效快的特点，并且操作方便，实用性好，可用于高通量高效率基因瞬时表达，是一种非常有应用潜力的基因瞬时表达方法。

关键词：瞬时表达瞬时表达系统基因表达盒植物细胞原生质体原生质体转化合成生物学繁琐程序目的基因片段组装体外构建应用潜力原生质体载体构建基因传统的高通量高效率抽提构建可用质粒耗时应用

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植物中瞬时表达外源基因的新型侵染技术

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遗传 2013年第1期35卷 111-117页

作者：杨丽萍金太成徐洪伟李华周晓馥吉林师范大学生命科学学院四平136000

由于瞬时表达系统的局限性使其不利于规模化生产的应用,本文介绍了一种新型的瞬时表达侵染技术—种子吸收法在植物中进行外源蛋白的表达。利用种子自然吸收来源于TMV病毒载体的农杆菌重悬液在番茄中成功的表达了报告基因GFP,并优化了影... 详细信息

由于瞬时表达系统的局限性使其不利于规模化生产的应用,本文介绍了一种新型的瞬时表达侵染技术—种子吸收法在植物中进行外源蛋白的表达。利用种子自然吸收来源于TMV病毒载体的农杆菌重悬液在番茄中成功的表达了报告基因GFP,并优化了影响基因表达的各种因素,包括菌液重悬液浓度和其他侵染条件。与其它侵染方法相比,该方法具有独特优势,如操作过程简便,有利于外源蛋白的规模化生产,并能够进一步扩大植物生物反应器的宿主范围。我们推测种子吸收法将有利于重组药用蛋白在植物中的工业规模化生产。

关键词：植物生物反应器瞬时表达系统种子吸收法 GFP

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利用植物系统表达重组蛋白的研究进展

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中国生物工程杂志 2010年第2期30卷 109-114页

作者：江莺刘秀明杜美丽朱海林李巍李海燕李校堃吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心长春130118 吉林农业大学中药材学院长春130118 吉林农业大学生命科学学院长春130118

植物是可以生产不同生物药剂品的成本低廉的生物反应器,综述了稳定转化系统、瞬时表达系统以及叶绿体基因组转化方法,这三种不同的植物表达系统的特点和研究现状,并对其存在的问题及未来的前景进行了分析。

关键词：植物反应器稳定转化系统瞬时表达系统叶绿体转化重组蛋白

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一种基于植物瞬时表达研制新冠病毒重组蛋白疫苗的方法

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中国免疫学杂志 2022年第20期38卷 2512-2516页

作者：王弘瑞赵丽娟房明丽杨明吉林大学基础医学院分子生物学教研室长春130021

目的:探究一种以植物烟草为瞬时表达载体快速且高效研制和表达SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的方法。方法:培育植物烟草,当烟草生长到第6周时,叶片生长到接近手掌大小,可用于下一步的农杆菌渗透。构建包含SARS-CoV-2 S重组质粒的农杆菌。培养... 详细信息

目的:探究一种以植物烟草为瞬时表达载体快速且高效研制和表达SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的方法。方法:培育植物烟草,当烟草生长到第6周时,叶片生长到接近手掌大小,可用于下一步的农杆菌渗透。构建包含SARS-CoV-2 S重组质粒的农杆菌。培养含目的基因的农杆菌,来获得农杆菌渗透液。选择待渗透的目标叶片,用针头轻轻在叶片上刺穿一个小孔,然后将制备好的农杆菌渗透液注入叶片,使其慢慢吸收渗透液。需要从渗透后的烟叶中提取和纯化SARS-CoV-2 S重组蛋白,并进行初步鉴定。对SARS-CoV-2 S重组蛋白进行纯化与鉴定,并对纯化的SARS-CoV-2 S重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果:采用植物烟草成功地表达SARS-CoV-2 S重组蛋白,其分子量约为53.2 kD,Western blot结果显示His-tag抗体可以识别SARS-CoV-2 S重组蛋白。结论:基于植物的瞬时表达系统可作为SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的快速研制方法。

关键词： COVID-19 植物生产疫苗瞬时表达系统本氏烟草农杆菌渗透法

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槟榔原生质体分离及瞬时转化体系的建立

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分子植物育种 2023年第17期21卷 5730-5737页

作者：曹春艳王威杨新奇李东栋海南大学热带作物学院海口570228 海南大学三亚南繁研究院三亚572024

为建立一套稳定高效的槟榔叶肉细胞原生质体分离及瞬时转化方法,本研究采用酶解法以槟榔嫩花苞、嫩叶片、胚状体为实验材料,对影响其原生质体产率、活力及瞬时转化效率的因素进行了研究。结果表明:槟榔花苞在酶解4 h产量和活力最高,产量... 详细信息

为建立一套稳定高效的槟榔叶肉细胞原生质体分离及瞬时转化方法,本研究采用酶解法以槟榔嫩花苞、嫩叶片、胚状体为实验材料,对影响其原生质体产率、活力及瞬时转化效率的因素进行了研究。结果表明:槟榔花苞在酶解4 h产量和活力最高,产量为9.1×10~7个/mL,活力为92%。槟榔原生质体瞬时转化中原生质体/质粒与40%PEG-4000水浴(45℃)30 min、室温PEG孵育40 min的条件下,利用PEG介导法将表达绿色荧光蛋白的质粒P35-EGFP转入槟榔原生质体中,转化效率达到13%。通过共聚焦显微镜观察和荧光定量分析证明,EGFP与MYB108都成功被过表达。该研究建立了槟榔叶肉原生质体的分离及瞬时转化方法,有较好的应用价值。可以用作蛋白质亚细胞定位和基因调控作用的研究,后续还可以被用作验证蛋白质与蛋白质或蛋白质与DNA的互作等研究。

关键词：槟榔(Areca catechu) 原生质体瞬时表达系统亚细胞定位基因功能

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马铃薯Y病毒介导的非洲猪瘟病毒p30蛋白在本氏烟草中的表达

马铃薯Y病毒介导的非洲猪瘟病毒p30蛋白在本氏烟草中的表达

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作者：刘悦吉林农业大学

学位级别：硕士

随着基因工程技术的不断革新,近几年来以植物病毒载体介导的外源基因瞬时表达系统发展比较迅速,其表达速度快、表达量高、安全性好以及可大规模生产,具有广阔的研发前景。非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African sw... 详细信息

随着基因工程技术的不断革新,近几年来以植物病毒载体介导的外源基因瞬时表达系统发展比较迅速,其表达速度快、表达量高、安全性好以及可大规模生产,具有广阔的研发前景。非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引发的一种严重的猪传染性疾病,致死率可达100%,由于病毒的复杂性和多基因型的存在,目前尚未研制出有效的疫苗和药物,给畜牧业发展及动物食品安全造成了巨大的影响,因此,建立快速、准确的ASFV诊断方法可有效预防该疾病的传播。ASFV p30蛋白是早期膜蛋白,在病毒感染早期就高效表达,且能够刺激机体产生高水平的抗体应答,可作为血清学诊断的理想抗原。本研究利用马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)介导的植物瞬时表达系统在本氏烟草中表达p30重组蛋白,并以表达的p30重组蛋白为抗原,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法。结果分析如下:1.本试验通过In-fusion试剂盒将PVY载体质粒与优化后的p30基因进行连接,成功构建了PVY-p30重组病毒质粒,采用摩擦的方式将质粒接种本氏烟草植株。2.本试验对接种后的本氏烟草植株定期进行观察,发现接种后的植株表现出与野生型PVY侵染相同的症状,并对感病的叶片进行检测,RT-PCR分析结果表明p30基因在植物病毒基因组中能够正确转录;间接ELISA分析结果表明在病毒接种第1周时p30重组蛋白已开始表达,接种第5周时重组蛋白表达量最高;Western-blot分析结果显示p30重组蛋白与ASFV猪阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化本氏烟草中表达的p30重组蛋白,Western-blot分析结果表明纯化的p30重组蛋白能够被p30蛋白单克隆抗体特异性识别。3.本试验以纯化的p30重组蛋白作为包被抗原,建立了ASFV抗体间接ELISA检测方法。最佳反应条件为:抗原浓度0.5μg/m L,37℃包被1 h;5%脱脂奶37℃封闭1 h;待检血清稀释度1:400,37℃孵育0.5 h;HRP标记二抗37℃孵育0.5 h;TMB室温避光显色10 min。检测50份ASFV阴性血清确定阴阳性临界值为0.461。对所建立的检测方法进行性能评估,当ASFV阳性血清稀释比例为1:2560时,仍可确定为阳性;本实验建立的方法与猪其他常见病的阳性血清未发生反应,能够特异性地检测ASFV抗体;批内及批间变异系数小于10%;用该方法与ASFV检测试剂盒平行检测214份临床猪血清样品,总体符合率为85.0%。本实验初步以本氏烟草表达的p30重组蛋白为抗原建立的ASFV抗体间接ELISA检测方法具有较高的临床应用价值。

关键词：瞬时表达系统非洲猪瘟病毒 p30蛋白马铃薯Y病毒间接ELISA

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特异性与非特异性超敏反应的激发及应用研究

特异性与非特异性超敏反应的激发及应用研究

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作者：王敏华中农业大学

学位级别：硕士

瞬时表达系统是一种简单快速分析基因功能的方法,在农杆菌上被广泛运用,本研究中将其拓展运用于分泌蛋白胞外表达的模式生物枯草芽孢杆菌上。由avr与R的互作或一些蛋白质激发子诱导产生的超敏反应是植物抗病的一种重要形式,通常伴随着... 详细信息

瞬时表达系统是一种简单快速分析基因功能的方法,在农杆菌上被广泛运用,本研究中将其拓展运用于分泌蛋白胞外表达的模式生物枯草芽孢杆菌上。由avr与R的互作或一些蛋白质激发子诱导产生的超敏反应是植物抗病的一种重要形式,通常伴随着多种抗病相关物质的产生,对植物抗病具有重要意义。本研究主要利用农杆菌和枯草芽孢杆菌瞬时表达系统,通过avr4与Cf-4、avr Rxo1与Rxo1和p50与N基因的gene-gene互作激发植物的特异性超敏反应,同时利用来自药用植物半夏基因文库的半夏基因激发植物的非特异性超敏反应,并尝试进行超敏反应的抗病应用研究,探索病害生物防治的新途径。主要完成了以下工作:1、在无抗生素培养条件下测定农杆菌At-p X-avr4与At-p X-Cf-4质粒稳定性,结果显示At-p X-avr4质粒容易丢失而At-p X-Cf-4质粒比较稳定。2、使用几对含有avr和R的菌株处理烟草、玉米、番茄植物叶片并接种多种病原菌,暂未获得显著的抗病效果。3、将avr4基因和来源于半夏基因文库的ptb2-20基因分别扩增构建到植物表达载体p CAMBIA3301上并转化农杆菌,新转化的avr4农杆菌与原始Cf-4农杆菌混合注射烟草叶片时仍能引起明显的特异性超敏反应,新转化的ptb2-20农杆菌也能在烟草叶片上引起非特异性的超敏反应。4、将avr4基因扩增并构建到含有173种信号肽的p BE-S载体库上并转化枯草芽孢杆菌WB800,共获得215个阳性转化子。将这些转化子在普通番茄和Cf-4番茄上注射筛选,其中19个菌株在与Cf-4农杆菌共同作用下能引起普通番茄叶片的坏死,7个菌株能单独引起Cf-4番茄的超敏反应。5、将来源于半夏基因文库的8个ptb基因分别构建到p BE-S载体库上并转化枯草芽孢杆菌WB800,分别获得66～225个不等的8组WB800-p BE-SP mix-ptb阳性转化子,累计约800个菌株。将这些含有ptb基因的枯草芽孢杆菌注射烟草叶片,筛选出一些能稳定引起烟草叶片非特异性超敏反应的菌株。

关键词：瞬时表达系统根癌农杆菌枯草芽孢杆菌特异性与非特异性超敏反应 avr与R互作半夏抗病性

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小立碗藓原丝体的诱导、光合特性及其原生质体的转化

小立碗藓原丝体的诱导、光合特性及其原生质体的转化

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作者：方昊首都师范大学

学位级别：硕士

本硕士学位研究对小立碗藓原丝体的诱导和保持、原丝体的光合生理和原丝体的原生质体的外源基因转化这三方面作了探索,取得了一些进展。小立碗藓是一种苔藓植物,野生型尚未发现有实用意义,但是凭借着高同源重组率成为了研究分子生物学... 详细信息

本硕士学位研究对小立碗藓原丝体的诱导和保持、原丝体的光合生理和原丝体的原生质体的外源基因转化这三方面作了探索,取得了一些进展。小立碗藓是一种苔藓植物,野生型尚未发现有实用意义,但是凭借着高同源重组率成为了研究分子生物学和基因工程的模式植物。转化小立碗藓是用原丝体制备成原生质体进行的;外源基因表达成功后也是用原丝体进行规模培养生产目的产物的。但是国际上迄今还没有对小立碗藓原丝体的生理特点和生长条件进行系统的研究。小立碗藓基因工程的热点是表达外源蛋白,这一领域在国内还是空白。本研究使用添加了酒石酸按(C4H14N2O6)的ppNH4固体培养基,给予持续光照,诱导出小立碗藓原丝体。将诱导出的原丝体液体培养,采取每周更换一次培养液的方法,在一定程度上延缓了原丝体的分化。这为小规模液体培养小立碗藓原丝体提供了新的方法,为下一步基因工程实验做了必要的材料准备。用液相氧电极测定小立碗藓原丝体的光合生理数据表明:最适光强为350μmol/（m2·s）,光强过大,大于600μmol/（m2·s）时有光抑制现象。最适温度是24℃,并且小立碗藓原丝体的光饱和点会随温度的升高而升高,在24℃光饱和点是350μmol/（m2·s）。但是27℃和30℃条件下,直到光强为800μmol/（m2·s）才出现光合放氧的最大值。最适pH值为5.5。苔藓植物生长的基础是光合,这些光合指标的分析,为科研和产业化培养小立碗藓原丝体提供了理论基础。叶绿素荧光技术可深入阐明小立碗藓原丝体光合作用的机制,比较小立碗藓在不同pH条件下和不同碳源下的光合效率。表明,pH5.5时Fv/Fm达到最大值0.68,说明这pH条件下,光能利用到光合作用的效率最高,而这条件下NPQ达到最低值0.2左右,这说明光能向热能转化较少,被更多地应用到光合作用。分别用葡萄糖和蔗糖做碳源培养小立碗藓,而这两种糖对小立碗藓利用光的效率影响不大。本研究探索外源基因在小立碗藓中表达时,用人集落细胞刺激因子（GCSF）作为目的基因。该因子能够刺激粒细胞的生成,在抗癌药使用后白细胞的减少症以及心脑血管系统疾病的治疗中广泛应用。我们研究集体与合作单位合成引物从人体细胞中调出了该基因,曾多次在原核的蓝藻中表达成功。为了在真核的小立碗藓中表达,并分泌到培养液中,本研究设计了新的引物,用PCR技术在G-CSF基因上加了信号肽序列,并调整了两端的酶切位点。在合作者帮助下,我们用pBAtTPme质粒构建载体时,对酶切位点进行了选择,首先尝试了平末端的EcoRV位点:（GAT:ATC）,结果证明质粒和基因片段连接效果很不理想。后又尝试了了PmeⅠ位点,取得成功。为了准备转基因的受体细胞,用2%的崩溃酶处理小立碗藓原丝体,可得到原生质体。用聚乙二醇介导把载体pBAtTPme-GCSF转入原生质体。在含有50ug/ml的氨苄青霉素的ppNH4固体培养基上筛选出转化子,经一个月培养原生质体己再分化成原丝体。转基因的小立碗藓原丝体还需培养一段时间,积累足够的测定材料,待本学位答辩后才能作分子和生理检测。这次小立碗藓原生质体转化成功,填补了我国尚未成功进行苔藓转外源基因的空白。

关键词：小立碗藓原丝体光合作用叶绿素荧光载体构建瞬时表达系统

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抗纹枯病基因筛选技术的建立及基因消除PCR技术的验证

抗纹枯病基因筛选技术的建立及基因消除PCR技术的验证

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作者：万康康华中农业大学

学位级别：硕士

玉米是世界上最重要的几种农作物之一,是继水稻、小麦和粟之后的第四大种植面积的作物。玉米纹枯病(maize sheath blight)是玉米上的一种非常具有破坏性的病害,通常造成11.0%到40.0%的产量损失,严重时可以达到90%以上。立枯丝核菌(Rhizo... 详细信息

玉米是世界上最重要的几种农作物之一,是继水稻、小麦和粟之后的第四大种植面积的作物。玉米纹枯病(maize sheath blight)是玉米上的一种非常具有破坏性的病害,通常造成11.0%到40.0%的产量损失,严重时可以达到90%以上。立枯丝核菌(Rhizoctonia solani) AG1-IA是引起玉米纹枯病的最主要病原菌。尽管在BLSB(banded leaf and sheath blight)领域已经进行了一些年的研究,但玉米对BLSB的遗传抗性仍然不清楚。玉米抗性育种的主要瓶颈是可用的抗性种子资源有限,而且抗性不持久。本实验采集了武汉地区48科107种植物,通过离体叶片接纹枯菌实验,确定有34科56种植物表现发病严重,14科51种植物表现不发病或轻微发病。根据接病结果,确定了天南星科的半夏和虎掌不能被纹枯菌致病,并成功克隆了半夏(Pinellia pedatisecta)、虎掌(Pinellia ternata)和天麻(Gastrodia elata B1.)的凝集素基因。抗病材料半夏的发现和三种凝集素基因的克隆为下一步如何利用它们来研究抗纹枯病提供了条件。以半夏为抗病材料,构建半夏叶片cDNA文库。利用农杆菌瞬时表达系统和pTRV病毒载体建立了烟草叶片表达外源基因的体系。此技术为一种快速、方便的筛选半夏中抗性基因或抗性相关基因方法,同时也可以用于验证某些功能未知的基因的功能。小麦和大麦白粉病是一种世界性病害,对作物的产量和质量均能造成较大的损失,其病原菌分别为Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt)、Blumeria graminis f. sp. hordei (Bgh)。Bgt、Bgh均为布氏白粉菌种下的八个专化型之一,在进化上二者亲缘关系十分接近,但却有着严格的寄主选择性,这就为研究病原物与植物之间的非寄主互作(包括病原物的寄生专化性和寄主植物的非寄主抗性)提供了良好的研究材料。本实验室建立的R-PCR技术恰好可以对Bgt、Bgh之间的差异做比较分析。利用此技术,我们在Bgt、Bgh的基因组水平上做了差异分析,筛选出了部分较为有意义的基因,对这些基因的进一步分析,可能为揭示二者之间的一系列差异提供一种途径。

关键词：玉米纹枯病半夏凝集素 cDNA文库 pTRV 瞬时表达系统大麦小麦白粉病 R-PCR

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