检索结果-内蒙古大学图书馆

分子植物育种 2018年第9期16卷 2841-2848页

作者：刘艳琴王一杨静李成云云南生物资源保护与利用国家重点实验室云南农业大学植物保护学院昆明650201

为了研究稻瘟病菌效应蛋白基因功能,本研究构建了稻瘟病菌效应蛋白基因BAS1和BAS4与3×FLAG标签融合的原核表达载体及其与GFP融合的瞬时表达载体。以持有BAS1和BAS4基因的稻瘟病菌株的cDNA为模板,RT-PCR扩增目的基因BAS1和BAS4编码... 详细信息

为了研究稻瘟病菌效应蛋白基因功能,本研究构建了稻瘟病菌效应蛋白基因BAS1和BAS4与3×FLAG标签融合的原核表达载体及其与GFP融合的瞬时表达载体。以持有BAS1和BAS4基因的稻瘟病菌株的cDNA为模板,RT-PCR扩增目的基因BAS1和BAS4编码区,选用p3×FLAG-CMV-10为模板扩增3×FLAG基因,分别将BAS1和BAS4与3×FLAG连接到原核表达载体p GEX-4T-1中,获得原核表达载体p GEX-BAS1-3×FLAG和p GEX-BAS4-3×FLAG,测序结果表明克隆到的BAS1、BAS4和3×FLAG序列及连接方向正确。将构建好的原核表达载体转化到表达感受态细胞Transetta(DE3)中得到转化子,利用IPTG诱导表达原核表达产物,SDS-PAGE电泳结果表明,目的蛋白约为40 kD,与理论值相符。为了进一步研究BAS1和BAS4的亚细胞定位,利用同源重组方法构建了pBWA(V)HS-BAS1-GLosgfph和pBWA(V)HS-BAS4-GLosgfp瞬时表达载体。本研究所构建的BAS1和BAS4与3×FLAG融合的原核表达载体及瞬时表达载体将为进一步研究BAS1和BAS4功能及定位提供一定的实验基础。

关键词：稻瘟病菌原核表达载体瞬时表达载体效应蛋白

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Rubisco小亚基基因片段的亚克隆及其瞬时表达载体的构建

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分子植物育种 2004年第4期2卷 527-530页

作者：麻鹏达周晓馥秦波董春光王兴智东北师范大学遗传与细胞研究所吉林长春130024 吉林师范大学基因工程研究所吉林四平136000

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶位于植物叶绿体中,是绿色植物中含量最丰富的蛋白,它催化CO2固定和光呼吸作用的第一步。从含Rubisco小亚基基因片段的pGR107-rbcS质粒中亚克隆出Rubisco小亚基基因片段,将PCR产物与pGEM-T Easy载体连接,用... 详细信息

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶位于植物叶绿体中,是绿色植物中含量最丰富的蛋白,它催化CO2固定和光呼吸作用的第一步。从含Rubisco小亚基基因片段的pGR107-rbcS质粒中亚克隆出Rubisco小亚基基因片段,将PCR产物与pGEM-T Easy载体连接,用EcoRI酶切鉴定酶切重组载体,利用低溶点胶回收大约300bp大小的Rubisco小亚基基因片段,将其回收片段与pSLJ75515瞬时表达载体连接,用EcoRI酶切鉴定,筛选出阳性重组体,即为pSLJ75515-rbcS瞬时表达载体。本实验为进一步研究Rubisco小亚基基因功能和基因沉默机制奠定了基础。

关键词： Rubisco小亚基基因基因片段亚克隆瞬时表达载体基因构建植物叶绿体

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利用TMV病毒载体在烟草中瞬时表达rPA(Reteplase)

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宁夏大学学报（自然科学版） 2012年第1期33卷 58-61页

作者：雒丽娜王盛宁夏大学生命科学学院宁夏银川750021 宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室宁夏银川750021

构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA(Reteplase)的烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)瞬时表达载体PJL TRBO-rPA,并转入农杆菌GV3101中.利用农杆菌渗滤接种技术在烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana)中进行表达.经SDS-聚... 详细信息

构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA(Reteplase)的烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)瞬时表达载体PJL TRBO-rPA,并转入农杆菌GV3101中.利用农杆菌渗滤接种技术在烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana)中进行表达.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(western blotting)和纤维蛋白琼脂糖平板(fibrin-agarose plate assay,FAPA)法检测分析.结果表明,在烟草中成功地表达出了有活性的rPA.为在植物中生产Reteplase提供了一条可能的途径.

关键词：人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA(Reteplase) 烟草花叶病毒瞬时表达载体

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紫花苜蓿WRKY转录因子基因的克隆与亚细胞定位

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草业学报 2012年第4期21卷 159-167页

作者：陈婷婷杨青川丁旺康俊梅张铁军张新全四川农业大学草业科学系四川雅安625014 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

WRKY转录因子家族在植物生长发育各个阶段发挥重要作用。本研究运用电子克隆和RT-PCR结合的方法获得1个紫花苜蓿WRKY转录因子家族成员的cDNA序列,命名为MsWRKY56。该序列长1 267bp,包含1个951bp的最大开放阅读框,编码317个氨基酸;构建... 详细信息

WRKY转录因子家族在植物生长发育各个阶段发挥重要作用。本研究运用电子克隆和RT-PCR结合的方法获得1个紫花苜蓿WRKY转录因子家族成员的cDNA序列,命名为MsWRKY56。该序列长1 267bp,包含1个951bp的最大开放阅读框,编码317个氨基酸;构建该基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对编码蛋白进行亚细胞定位研究,结果表明该基因编码蛋白定位于细胞核,符合转录因子的亚细胞定位特征,为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。

关键词：紫花苜蓿 WRKY转录因子基因瞬时表达载体亚细胞定位

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利用GFP／RFP双荧光指示载体鉴定特异性启动子功能

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生物工程学报 2008年第12期24卷 2106-2110页

作者：尹涛秦巧平张上隆刘敬梅陈大明浙江大学园艺系杭州310029 浙江林学院杭州311300 北京市蔬菜研究中心北京100089 Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center at Johns Hopkins USA

在基因表达定位或启动子调控模式的研究中,多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制,使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题,本实验将报告基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(R... 详细信息

在基因表达定位或启动子调控模式的研究中,多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制,使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题,本实验将报告基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率,通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。

关键词：绿色荧光蛋白红色荧光蛋白瞬时表达载体特异性启动子

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ABA诱导的OsDMI3基因的表达分析与亚细胞定位

ABA诱导的OsDMI3基因的表达分析与亚细胞定位

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作者：孙丽丽南京农业大学

学位级别：硕士

脱落酸（abscisic acid, ABA）是一种重要的植物激素,不仅在植物的生长发育中而且还在植物对各种环境胁迫反应中起重要作用。已有研究表明ABA的作用模式与植物细胞中氧化胁迫有关,ABA能够诱导NADPH氧化酶引起活性氧产生及抗氧化基因的表... 详细信息

脱落酸（abscisic acid, ABA）是一种重要的植物激素,不仅在植物的生长发育中而且还在植物对各种环境胁迫反应中起重要作用。已有研究表明ABA的作用模式与植物细胞中氧化胁迫有关,ABA能够诱导NADPH氧化酶引起活性氧产生及抗氧化基因的表达,从而提高植物抗氧化防护能力。Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶（CBK）是一种Ser/Thr类蛋白激酶,在动物中,Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶（CaMK）已经被很好的研究,迄今人们已在多种植物中分离出大量CBK家族成员,但大多数植物CBK的功能没有被阐明,已有的研究提示这一激酶可能参与盐、低温、干旱与氧化胁迫的信号转导。因此,鉴定ABA诱导的氧化胁迫信号途径与植物CBK基因的关系,对于揭示ABA信号的细胞和分子机理具有重要的意义。本实验以水稻为研究对象,利用生物信息学和分子生物学相结合的方法,以半定量RT-PCR为主要研究手段对水稻中一条OsCBK基因OsDMI3与ABA和H202的关系进行了研究,并通过构建原生质体瞬时表达载体对其进行亚细胞定位,主要结果如下： 1.用100μmol·L-1 ABA处理4h的时间进程结果显示,OsDMI3基因在水稻叶片和根中的转录水平和对照相比,分别表现为30 min和60 min产生上调表达高峰之后逐渐降低至接近对照水平。用ABA合成抑制剂fluridon（FLU）预处理水稻,研究结果表明：干旱胁迫下,水稻叶片和根中ABA合成受抑制的（FLU处理）与不受抑制的相比,OsDMI3基因的表达均受到了明显的抑制,外源施加ABA恢复后,基本上清除了这种抑制作用。这些结果初步说明ABA可以上调OsDMI3的表达。 2.10mmol·L-1 H2O2处理后,水稻叶片和根中OsDMI3基因的转录水平和对照相比,在4h处理时间均产生两个上调表达高峰;为了确定H202是否参与了ABA诱导的OsDMI3基因在水稻中的转录,本研究应用H202清除剂DMTU和NADPH氧化酶抑制剂DPI浓度分别为100μmol·L-1和10mmol·L-1预处理后的样品较对照样品,结果显示,当ABA处理60min时清除剂和抑制剂预处理对OsDMI3基因的表达并没有明显的抑制。而当ABA处理至60min至90min时,OsDMI3基因在水稻叶片和根中的转录均受到明显抑制。证明了ABA诱导水稻OsDMI3基因表达增强是通过ABA诱导产生的内源H202来起作用的。这些结果初步阐明了在ABA信号途径中ABA、H2O2与植物CBK三者之间的关系,从而为ABA诱导植物细胞抗氧化防护系统的信号转导途径提供了新的证据。 3.通过设计含有酶切位点的引物和PCR方法,从本实验室已保存的水稻OsDMI3基因的模板上扩增完整的基因编码区,并利用DNA重组技术将OsDMI3基因连到含有35S启动子的植物瞬间表达载体pXZP008上,构建了全长基因瞬时表达载体35S-pXZOsDMI3。将表达载体用PEG方法转化玉米原生质体,以黄色荧光蛋白YFP为报告基因,通过激光共聚焦显微镜观察。结果表明OsDMI3主要定位在玉米的细胞质中。为进一步研究ABA诱导的OsDMI3基因表达与ABA诱导的抗氧化防护基因如：Sod4, Cat1及Apx1等表达的关系做准备,为深入了解和丰富ABA信号转导途径网络关系图奠定基础。

关键词： OsDMI3 ABA H2O2 瞬时表达载体 YFP 亚细胞定位

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抗中国南瓜曲叶病毒西葫芦种质筛选及病毒载体开发

抗中国南瓜曲叶病毒西葫芦种质筛选及病毒载体开发

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作者：史思茹山东农业大学

学位级别：硕士

中国南瓜曲叶病毒(squash leaf curl China virus,SLCCNV)侵染葫芦科植物后造成花叶和叶片卷曲等症状,近年来对我国西葫芦产业造成巨大影响。SLCCNV属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomoviruses),通过烟粉虱进行传... 详细信息

中国南瓜曲叶病毒(squash leaf curl China virus,SLCCNV)侵染葫芦科植物后造成花叶和叶片卷曲等症状,近年来对我国西葫芦产业造成巨大影响。SLCCNV属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomoviruses),通过烟粉虱进行传播。选育抗病品种是防治植物病毒病最经济有效的方法,抗病品种筛选是选育抗病品种的重要环节。植物病毒具有利用寄主细胞复制而不整合到寄主基因组的优点,双生病毒拷贝水平高,被广泛利用到基因工程中。本研究通过对山东潍坊西葫芦分离物SLCCNV WF-zucchini的全基因组进行分析,成功构建SLCCNV侵染性克隆,并利用SLCCNV侵染性克隆筛选抗SLCCNV的西葫芦种质。同时对SLCCNV病毒载体进行开发,构建了SLCCNV瞬时表达载体、基因沉默载体及基因编辑载体。具体结果如下:(1)获得SLCCNV WF-zucchini分离物的全基因组序列,明确了SLCCNV WF-zucchini分离物与NCBI上其他分离物的系统进化关系。PCR扩增获得SLCCNV WF-zucchini分离物的DNA-A和DNA-B,测序获得其全基因组序列。对SLCCNV WF-zucchini分离物的DNA-A和DNA-B进行系统发育分析,结果表明,SLCCNV WF-zucchini分离物的DNA-A与山东潍坊寿光SLCCNV-SDSGC黄瓜分离物遗传距离较近,DNA-B与山东淄博SLCCNV-SDZBZ西葫芦分离物遗传距离较近,DNA-A和DNA-B均与印度、柬埔寨、马来西亚、印度尼西亚、越南等地的SLCCNV亲缘关系较远。(2)构建SLCCNV侵染性克隆并分析其在多种植物上的侵染性。构建了SLCCNV侵染性克隆:p CB1.4SL-A和p CB1.5SL-B,二者共浸润接种西葫芦,8天后,系统叶片出现花叶和叶片卷曲等症状,侵染效率为100%。为了分析SLCCNV WF-zucchini分离物在不同植物上的侵染性,共接种了西葫芦、甜瓜、西瓜、黄瓜、本氏烟、番茄、白菜、萝卜和辣椒9种植物各一个品种,通过症状观察和PCR检测,判断其在不同植物上的侵染性。在西葫芦和甜瓜上出现明显的花叶和叶片卷曲的症状,同时造成了甜瓜植株矮化。PCR检测表明,在西葫芦、甜瓜、西瓜、黄瓜和本氏烟中可以检测到目的条带,在番茄、白菜、萝卜和辣椒中未检测到目的条带。综上所述,SLCCNV WF-zucchini分离物在大部分的葫芦科植物和部分茄科植物上具有侵染性。(3)筛选抗SLCCNV的西葫芦种质。在西葫芦上用农杆菌浸润接种的方法接种SLCCNV侵染性克隆。共接种46种西葫芦种质,根据其发病率来筛选西葫芦抗病种质。实验结果表明,共有14个西葫芦种质表现为高抗。(4)构建SLCCNV瞬时表达载体,提高目的蛋白在葫芦科植物中的表达量。将LIR、Ca MV 35S promoter-目的基因-NOS terminator、SIR、AC3-AC2-AC4-AC1-LIR依次连接到p Cambia1300载体上,构建SLCCNV瞬时表达载体。在本氏烟上分别表达GFP和Fluc,通过其荧光看出GFP和Fluc的蛋白表达量均大于对照组。在本氏烟、普通烟、西葫芦和甜瓜上根据其荧光和Western blot结果表明,SLCCNV瞬时表达载体可以提高目的蛋白在葫芦科植物中的表达量。同时P19可以进一步提高目的蛋白的表达量。(5)构建SLCCNV基因沉默载体,在甜瓜和西葫芦中沉默PDS基因。将SLCCNV侵染性克隆p CB1.4SL-A中的AV1蛋白用甜瓜和西葫芦的PDS保守序列:Cu PDS替换,得到基因沉默载体p CB1.4SL-A-Cu PDS。将p CB1.4SL-A-Cu PDS和p CB1.5SL-B共浸润接种甜瓜和西葫芦,浸润接种21天后,甜瓜和西葫芦出现明显的白化现象。通过RT-q PCR检测其沉默效率,在甜瓜上沉默效率为83.2%,在西葫芦上沉默效率为69.6%。(6)构建SLCCNV基因编辑载体,实现对本氏烟PDS基因的编辑。用SLCCNV瞬时表达载体分别表达Sp Cas9和本氏烟PDS的向导RNA(g RNA)得到基因编辑载体p C1300-SLC-35S-Sp Cas9和p C1300-SLC-35S-Nb-g RNA(HinfⅠ)。二者共浸润接种后4-6天,提取本氏烟接种叶片植物总DNA,PCR扩增本氏烟PDS基因发生编辑的区域(本氏烟内源基因PDS基因编辑区域带有HinfⅠ酶切位点),用限制性内切酶HinfⅠ进行酶切,将未切开的部分连接p MD18-T载体测序。测序结果表明12个测序样品中有2个样品发生了基因编辑。用同一SLCCNV瞬时表达载体表达Sp Cas9和本氏烟PDS的g RNA,

关键词：中国南瓜曲叶病毒侵染性克隆西葫芦抗病种质筛选瞬时表达载体基因沉默载体基因编辑载体

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玉米胚乳特异性启动子的克隆与表达分析

玉米胚乳特异性启动子的克隆与表达分析

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作者：汪瀚宇四川农业大学

学位级别：硕士

玉米胚乳中存在着大量与淀粉合成酶、醇溶蛋白合成酶、谷蛋白合成酶相关的基因,并且有部分受胚乳特异性启动子调控,只在胚乳中特异性表达。随着转基因技术的快速发展及转基因研究领域的不断扩大,对组织特异性启动子的研究逐步受到重视... 详细信息

玉米胚乳中存在着大量与淀粉合成酶、醇溶蛋白合成酶、谷蛋白合成酶相关的基因,并且有部分受胚乳特异性启动子调控,只在胚乳中特异性表达。随着转基因技术的快速发展及转基因研究领域的不断扩大,对组织特异性启动子的研究逐步受到重视。本研究旨在从玉米自交系18-599红中克隆淀粉合成酶基因ZMGBSS,谷蛋白基因ZMGT1、SC3以及醇溶蛋白基因ZEIN、BN15D14A的启动子GBSS, GT, SC, ZEIN, BN,对其表达的组织特异性及外界诱导因素进行分析,构建了这些启动子的瞬时表达载体,利用基因枪法通过转化胚乳,分析其启动活性。研究结果如下：1、利用高保真酶KODFx从玉米自交系18-599红基因组DNA成功克隆出2000bp左右的胚乳特异性启动子GBSS, GT, SC, ZEIN, BN序列,并对克隆片段进行回收测序。将测序结果与NCBI上B73的基因组信息比对,其相似性分别为97%、99%、99%、97%和99%。2、提取玉米自交系18-599红授粉15天后的胚乳和胚以及出苗10天后的根和叶的RNA,反转录成cDNA,以18s rRNA作为内参对ZMGBSS, ZMGT1、SC3、 ZEIN, BN15D14A基因进行半定量PCR分析,结果表明,ZMGBSS和ZEIN在胚乳的表达量明显高于在其他组织。而ZMGT1、SC3、BN15D14A没有表现出明显的组织特异性。3、通过荧光实时定量PCR对基因ZMGBSS、ZMGT1、SC3、ZEIN, BN15D14A受外源激素诱导后的表达进行分析,结果表明,ABA诱导可导致基因ZMGBSS和ZEIN的表达量明显提高。蔗糖诱导可导致基因ZMGT1和BN15D14A的表达量明显提高。4、构建了启动子GBSS、GT、SC、ZEIN和BN的瞬时表达载体,即pGBSS-Luc、 pGT-Luc、pSC-Luc、pZEIN-Luc和pBN-Luc,同时构建了瞬时表达载体pUbi-Luc作为对照,构建了瞬时表达载体pUbi-Gus作为内参,内参对照主要用来消除不同转化所导致的差异。将内参载体与目的载体按照质量比为1：4的比例混合,基因枪转化,转化材料为4小时预处理过后的授粉15天后18-599红的胚乳。结果表明,启动子GBSS、ZEIN和BN的启动活性相对高于SC和BN,但均明显低于组成型启动子Ubiquitin。5、在外源因素诱导表达分析中,转化受体材料分别为葡萄糖、蔗糖、ABA和GA诱导4h后的胚乳,利用基因枪转化法,按照内参载体与目的载体以1：4的比例混合进行转化,结果表明,受到ABA诱导的启动子GBSS、ZEIN活性有明显提高,受到蔗糖诱导的启动子GT、BN活性也有一定的提高,但启动子SC却表现为受所有供试处理抑制。

关键词：玉米胚乳特异启动子瞬时表达载体基因枪转化

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拟南芥ats1A基因启动子和ats2B基因启动子的克隆及其功能分析

拟南芥ats1A基因启动子和ats2B基因启动子的克隆及其功能分析

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作者：王利军西北农林科技大学

学位级别：硕士

近年来利用植物作为生物反应器生产目的产品成就瞩目,正成为基因工程研究中新的热点.借助于高活性特异表达的启动子提高外源基因的表达量,以及使外源基因只在特定的发育阶段在特定的组织或器官中表达,成为植物生物反应器研究的关键技术... 详细信息

近年来利用植物作为生物反应器生产目的产品成就瞩目,正成为基因工程研究中新的热点.借助于高活性特异表达的启动子提高外源基因的表达量,以及使外源基因只在特定的发育阶段在特定的组织或器官中表达,成为植物生物反应器研究的关键技术之一.Rubisco即核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(E.C.4.1.1.39.),是叶绿体中光合CO<,2>固定的关键酶也是叶绿体中含量最为丰富的蛋白,约占叶片可溶性蛋白的50%以上.ats1A基因和ats2B基因是拟南芥中编码Rubisco小亚基的两个基因,这两个基因位于细胞核中,对它们的调控元件、启动子活性和组织特异性的研究,为外源基因在植物中的特异高效表达提供一种新的途径.另外,利用叶绿体转运信号肽将外源基因产物定位到叶绿体中可提高其积累水平,因而也是提高外源基因表达量的一种有效策略.该研究利用PCR克隆了拟南芥ats1A基因启动子和ats2B基因启动子(均包含叶绿体的转运信号肽),并对其序列进行了分析,然后将ats1A基因启动子(包含叶绿体的转运信号肽)构建植物瞬时表达载体p18T-Gus,通过瞬时表达对其活性进行了分析.通过以上研究工作,得到的主要研究结果如下:***方法克隆到了ats1A基因和ats2B基因的5′端上游片段(包含启动子部分和叶绿体转运肽),并分别构建了克隆载体p18T1a和p18T2b.2.用植物顺式作用元件数据库分别对ats1A基因启动子和ats2B基因的启动子区的DNA顺式作用元件进行了分析.3.将ats1A基因启动子连接在Gus报告基因的上游,构建了瞬时表达载体p18T1a-gus.4.通过基因枪法将瞬时表达载体p18T1a-gus分别导入到烟草的叶片,茎段,根段进行瞬时表达,Gus的组化染色分析表明,ats1A基因启动子能够启动外源基因在烟草叶片中高效表达,ats1A基因启动子是进行植物生物反应器研究的一个良好的候选启动子.

关键词：拟南芥基因启动子克隆外源基因叶绿体转运肽瞬时表达载体植物生物反应器顺式作用元件信号肽高效表达烟草叶片启动子活性构建基因表达量组织特异性元件数据库可溶性蛋白组化染色有效策略特异表达

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坏死病毒属两种病毒外壳蛋白在本生烟中的定位

坏死病毒属两种病毒外壳蛋白在本生烟中的定位

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中国植物病理学会2009年学术年会

作者：张艳敬韩成贵于嘉林李大伟中国农业大学农业生物技术国家重点实验室

＜正＞病毒编码的蛋白在侵染植物过程中执行不同的功能,病毒蛋白的功能往往与其在寄主细胞内的定位相关。研究病毒蛋白在寄主细胞内的定位可以推测其在侵染过程中的作用。近年的研

关键词：本生烟坏死病毒外壳蛋白基因定位瞬时表达载体

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