检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：张衡内蒙古农业大学

学位级别：硕士

基因瞬时表达在短时间内可以使目的基因进行高效表达或沉默,是常用作研究植物基因功能的重要技术手段。中国石竹花色丰富,建立其基因瞬时过表达体系,可以快速筛选对花色有影响的基因,进而有目标地对花色进行改良。前期我们筛选获得了3... 详细信息

基因瞬时表达在短时间内可以使目的基因进行高效表达或沉默,是常用作研究植物基因功能的重要技术手段。中国石竹花色丰富,建立其基因瞬时过表达体系,可以快速筛选对花色有影响的基因,进而有目标地对花色进行改良。前期我们筛选获得了3个与中国石竹花色有关的查尔酮合成酶(Chalcone Synthase,CHS)基因,其中Dch CHS1(KX893854)对花色影响较大。本研究采用农杆菌介导的方法在中国石竹上建立了基因瞬时过表达体系,并通过构建含Dch CHS1 ORF的p BI121-GUS重组载体对该体系进行了验证,主要结果如下:1.将p BI121-GUS分别转化在农杆菌GV3101和EHA105感受态中,根据侵染后中国石竹离体花苞的绽放率,筛选农杆菌菌株;根据GUS染色程度,筛选适合的农杆菌侵染液浓度。结果表明:农杆菌GV3101侵染后,花苞绽放率为56.67%,比EHA105的高15.84%;农杆菌侵染液OD值在1.4±0.2时,GUS染色效果最明显。因此,采用侵染液浓度为1.4±0.2的GV3101进行侵染时,可获得明显的中国石竹基因瞬时过表达结果。2.构建含Dch CHS1 ORF的重组质粒p BI121-Dch CHS1-GUS,转化到GV3101感受态中,分别侵染白边红芯(White with Red,RW)和双红色(Double Red,RR)两种花色的离体花苞。结果表明:与p BI121-GUS相比,p BI121-Dch CHS1-GUS侵染后,花色均变浅,GUS染色后,花瓣呈现蓝色;分别提取RW和RR未侵染以及侵染后的花瓣DNA,采用Dch CHS1-F/R引物扩增后,在p BI121-Dch CHS1-GUS侵染的花瓣DNA中出现Dch CHS1目的片段,其余均未出现;与侵染p BI121-GUS后花瓣花环的内、外侧相比,p BI121-Dch CHS1-GUS侵染后的花瓣中Dch CHS1的表达量均分别增加1倍以上,CHS酶活性在RW和RR花瓣内、外侧分别增加了3.87%、26.04%和42.66%、8.64%,黄酮含量均分别显著增加,花色苷含量均分别显著降低。表明Dch CHS1已经在中国石竹花瓣中进行了过表达,其编码产生的蛋白具有相关的酶活性。上述结果表明,建立的农杆菌介导的中国石竹基因瞬时过表达体系可行,可用于中国石竹基因功能的验证。

关键词：中国石竹 CHS 报告基因瞬时过表达

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比利时杜鹃类黄酮3-O-糖基转移酶基因的克隆、原核表达及功能分析

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生物工程学报 2025年第2期41卷 881-895页

作者：鄢毅铖吴泽航姜宇航胡高源杨宇杰谢晓鸿吴月燕贾永红浙江万里学院生物与环境学院浙江宁波315100

类黄酮3-O-糖基转移酶是植物花青素糖苷化的关键酶。为研究杜鹃花3GT基因的功能,本研究从红比利时杜鹃中克隆了一个3GT基因开放阅读框(open reading frame,ORF)命名为Rh3GT,分析、测定并验证了该ORF及其编码蛋白的理化性质、表达水平、... 详细信息

类黄酮3-O-糖基转移酶是植物花青素糖苷化的关键酶。为研究杜鹃花3GT基因的功能,本研究从红比利时杜鹃中克隆了一个3GT基因开放阅读框(open reading frame,ORF)命名为Rh3GT,分析、测定并验证了该ORF及其编码蛋白的理化性质、表达水平、酶学功能等生物学特性。结果表明,Rh3GT全长993 bp,编码330个氨基酸;编码蛋白为亲水稳定的弱酸性蛋白,隶属糖基转移酶家族(GT-B型),PSPG box结构域中第44位为谷氨酰胺(Q);系统进化分析发现比利时杜鹃Rh3GT与越橘Vc3GT和黑果越橘Vm3GT的亲缘关系最近;Rh3GT在根中几乎不表达,在茎、叶、花中均有表达,且在盛开期花瓣中表达量最高;花瓣瞬时过表达Rh3GT后发现其总花青苷积累也显著增加;Rh3GT重组蛋白在大肠杆菌BL21中成功表达,并以包涵体形式存在,大小约为36 kDa,与理论预测值接近;高效液相色谱检测发现,经过变性纯化和稀释复性后的Rh3GT重组蛋白可催化矢车菊素和UDP-葡萄糖合成矢车菊素3-O-葡萄糖苷,表明表达的蛋白具有3GT活性。本研究为深入探讨杜鹃花花青苷生物合成分子调控机制提供了基础数据,并为潜在的杜鹃花分子育种提供了理论支持。

关键词：比利时杜鹃类黄酮3-O-糖基转移酶表达分析瞬时过表达原核表达

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本氏烟NbNAC062的克隆及对马铃薯Y病毒侵染的抑制作用

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中国农业科学 2021年第19期54卷 4110-4120页

作者：曲潇玲焦裕冰罗健达宋丽云李莹申莉莉杨金广王凤龙中国农业科学院烟草研究所

【目的】马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是危害我国烟草生产的最重要病毒之一,NAC转录因子与植物的抗病、抗逆密切相关,本论文克隆NbNAC062进行生物信息学分析,并研究其在PVY侵染过程中的作用,为烟草抗病毒药剂的开发提供靶标。【方... 详细信息

【目的】马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是危害我国烟草生产的最重要病毒之一,NAC转录因子与植物的抗病、抗逆密切相关,本论文克隆NbNAC062进行生物信息学分析,并研究其在PVY侵染过程中的作用,为烟草抗病毒药剂的开发提供靶标。【方法】以本氏烟(Nicotiana benthamiana)为材料克隆NbNAC062,利用MEGA、UniProt、SMART、TMHMM Server2.0、Sol Genomics Network、PlantCARE等技术进行生物信息学分析;利用激光共聚焦与实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)明确PVY侵染前后NbNAC062蛋白定位及mRNA表达量变化;基于病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)和过表达技术,构建pTRV::NbNAC062沉默载体与pEarleyGate100::RFP::NbNAC062过表达载体,采用qRT-PCR和Western blot检测NbNAC062在本氏烟中沉默与过表达后,PVY的积累量变化及未折叠蛋白应答(unfolded protein response,UPR)相关基因BiP的表达差异。【结果】NbNAC062编码646个氨基酸,N端28—179 aa为NAC结构域,129—185 aa为DNA结合区域,C末端621—643 aa为疏水跨膜结构,系统进化树与蛋白序列分析表明本氏烟NbNAC062与渐狭叶烟草NaNAC062亲缘关系最近。NbNAC062启动子中包含脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸以及逆境响应相关的多种顺式作用元件。PVY侵染激活NbNAC062从细胞膜转移至细胞核,且诱导NbNAC062上调表达。PVY侵染本氏烟5、7 d,处理组NbNAC062mRNA水平分别为对照组的2.52、1.95倍;PVY侵染3 d,BiP mRNA表达量为对照组的2.39倍,PVY侵染7 d,BiP表达量极显著低于对照组,下调表达56.77%。本氏烟沉默NbNAC062并接种PVY,接种后3、5、7 d,与对照组相比,沉默组PVY CP mRNA上调表达,分别为对照组的2.12、2.41、1.38倍,BiP mRNA表达量则下调,分别下调28.19%、58.11%、10.77%,接种后5、7 d沉默组PVY CP蛋白含量亦显著高于对照组。过表达NbNAC062并接种PVY,接种后24、48、72 h,与对照组相比,过表达组PVY CP mRNA分别下调22.60%、34.51%、36.21%,接种48、72 h,BiP mRNA上调表达,分别为对照组的1.56、1.35倍,过表达组PVY CP蛋白含量亦低于对照组。【结论】NbNAC062属于NAC类膜结合转录因子,可被PVY侵染激活转移至细胞核,可能通过调控UPR相关基因BiP的表达,促进细胞生存,抑制PVY早期侵染。

关键词： NbNAC062 马铃薯Y病毒基因沉默瞬时过表达

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葡萄热激蛋白VvDnaJ05与VvDnaJ26基因的克隆和功能分析

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农业生物技术学报 2023年第3期31卷 488-499页

作者：陈天池徐涛沈乐意罗英杰刘婷婷贾永红吴月燕浙江万里学院生物与环境学院宁波大学植物病毒研究所

葡萄(Vitis vinifera)在栽培过程中常常会遭受众多环境胁迫，了解葡萄植株对胁迫的抗逆机制是当前葡萄栽培技术研究的热点。在众多与抗逆相关的蛋白中，DnaJ蛋白作为热激蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70)的分子伴侣，在植物生理... 详细信息

葡萄(Vitis vinifera)在栽培过程中常常会遭受众多环境胁迫，了解葡萄植株对胁迫的抗逆机制是当前葡萄栽培技术研究的热点。在众多与抗逆相关的蛋白中，DnaJ蛋白作为热激蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70)的分子伴侣，在植物生理生化及胁迫响应过程中发挥重要作用。本研究以DnaJ基因家族中克隆得到的VvDnaJ05 (GenBank No. OQ102602)和VvDnaJ26 (GenBank No. OQ108519)为研究对象，对其在不同组织、不同激素处理和不同逆境胁迫下的表达量进行了测定；同时构建了过表达和互作载体，对其蛋白功能与互作情况进行了验证。结果显示，VvDnaJ05全长共计822 bp，编码273个氨基酸；VvDnaJ26为1 254 bp，编码417个氨基酸。VvDnaJ05和VvDnaJ26分别在果皮和种子中呈高表达状态。VvDnaJ05和VvDnaJ26启动子区均存在激素响应元件，两者在茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)和水杨酸(salicylic acid, SA)处理下表达量均出现明显变化。VvDnaJ05和VvDnaJ26在盐、弱光胁迫和热胁迫下表达量出现明显变化，特别是在热胁迫处理下，热胁迫(35℃)处理6 h后两者的表达量相比于处理前均显著升高(P<0.05)。经瞬时过表达VvDnaJ05和VvDnaJ26处理的烟草(Nicotiana tabacum)植株，相比于空载处理组，丙二醛和过氧化氢的含量显著降低(P<0.05)，耐热性明显更强。亚细胞定位显示，VvDnJ05定位于细胞质和细胞核中，VvDnaJ26则定位在细胞质中。酵母双杂交实验显示，VvDnaJ05和VvDnaJ26蛋白不存在互作情况。以上结果表明，VvDnaJ05和VvDnaJ26各自发挥其生物学功能并在葡萄抗逆境胁迫过程中发挥重要作用。本研究初步阐明了VvDnaJ的潜在功能，为后续DnaJ蛋白的深入研究及抗逆性葡萄品种选育提供理论参考。

关键词：葡萄 DnaJ蛋白逆境胁迫瞬时过表达

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紫丁香SoDXR基因克隆及其在单萜类物质合成中的功能分析

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西北植物学报 2024年第6期44卷 912-919页

作者：杨艺慧邹吉睿马波冷平生胡增辉吴静北京农学院园林学院北京102206 城乡生态环境北京实验室北京102206

[目的]探究1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因在紫丁香单萜类物质合成中的作用,为紫丁香花香分子育种提供有效的基因资源和理论基础。[方法]以紫丁香花瓣为材料,克隆了SoDXR基因,并对其进行生物信息学和亚细胞定位分析、不同... 详细信息

[目的]探究1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因在紫丁香单萜类物质合成中的作用,为紫丁香花香分子育种提供有效的基因资源和理论基础。[方法]以紫丁香花瓣为材料,克隆了SoDXR基因,并对其进行生物信息学和亚细胞定位分析、不同花发育时期和器官组织中的qRT-PCR表达分析以及探究其在金鱼草花瓣中异源瞬时过表达后的功能。[结果]SoDXR基因全长为1425 bp,编码474个氨基酸,编码的蛋白具有保守的DXP_reductoisom结构域,与桂花和油橄榄的相似性高达95%。亚细胞定位显示该蛋白主要定位于质体,与软件预测结果一致。伴随着开花,SoDXR表达水平呈先升高后降低的趋势,在初开期最高,其在各个器官组织中均有表达,花瓣中表达量最高,茎中表达量最低。瞬时过表达表明,SoDXR基因的表达水平显著高于对照,促进了主要单萜成分罗勒烯和月桂烯的释放,释放量分别增加了15.03倍和4.83倍。[结论]SoDXR基因正调控紫丁香单萜类物质的合成,表明DXR基因在花香次级代谢物合成中起到重要作用。

关键词：紫丁香萜类化合物 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶瞬时过表达

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广藿香锌指蛋白基因PatGIS2调控广藿香醇生物合成

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基因组学与应用生物学 2022年第7期41卷 1521-1529页

作者：王西林陈秀珍黄慧玲吴带娣王小兵詹若挺陈立凯广州中医药大学中药学院岭南中药资源教育部重点实验室广州510006 仲恺农业工程学院农业与生物学院广州510225 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心茂名525000

广藿香醇(Patchouli alcohol)是广藿香特异的代谢倍半萜类成分,具有很好的神经保护、抗流感病毒等生物活性,是评价广藿香药材及广藿香油质量的指标成分。广藿香植物中法尼基焦磷酸在广藿香醇合酶(Patchouli alcohol synthase,PatPTS)催... 详细信息

广藿香醇(Patchouli alcohol)是广藿香特异的代谢倍半萜类成分,具有很好的神经保护、抗流感病毒等生物活性,是评价广藿香药材及广藿香油质量的指标成分。广藿香植物中法尼基焦磷酸在广藿香醇合酶(Patchouli alcohol synthase,PatPTS)催化下直接合成广藿香醇等倍半萜。本研究以PatPTS基因启动子为诱饵,由酵母单杂筛选鉴定到1个与之结合的新蛋白PatGIS2。其序列含有多个CCHC锌指结构,基序为CX_(2)CX_(4)HX_(4)C,属于CCHC锌指家族。应用RT-qPCR检测发现PatGIS2在成熟叶、老叶以及木质茎中表达量最高,原生质体亚细胞定位检测PatGIS2主要定位于细胞核。在广藿香原植物中瞬时过表达PatGIS2基因,发现PatGIS2表达上调导致PatPTS表达量显著下降约40.34%,瞬时过表达PatGIS2的叶片广藿香醇含量为2.10 mg/g,相比对照(3.40 mg/g)降低了33.39%。综上结果表明PatGIS2的功能主要是通过直接结合并降低PatPTS的启动子活性,抑制PatPTS的基因表达,从而负调控广藿香醇的生物合成。

关键词：广藿香醇 GIS PatPTS 瞬时过表达转录调控

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中国樱桃CpMADS47基因调控果实成熟软化的功能分析

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四川农业大学学报 2024年第6期42卷 1186-1194页

作者：田泰刘一璇王杨玥琨黄凤庭杨帅威王浩张静何文陈清王小蓉王燕四川农业大学园艺学院成都611130 四川农业大学农业生物信息教育部重点实验室成都611130

【目的】探究中国樱桃CpMADS47基因的生物学特性及其在果实成熟软化中的作用。【方法】克隆获得与中国樱桃果实质地相关的MADS-box基因CpMADS47,进行生物信息学分析,异源瞬时过表达草莓果实进行功能验证。【结果】中国樱桃CpMADS47属SEP... 详细信息

【目的】探究中国樱桃CpMADS47基因的生物学特性及其在果实成熟软化中的作用。【方法】克隆获得与中国樱桃果实质地相关的MADS-box基因CpMADS47,进行生物信息学分析,异源瞬时过表达草莓果实进行功能验证。【结果】中国樱桃CpMADS47属SEP1/2-like基因,CDS区全长741 bp,编码246个氨基酸。CpMADS47蛋白与蔷薇科物种的亲缘关系较近。瞬时过表达草莓果实表明,CpMADS47通过促进草莓果实硬度降低、花青素苷积累、细胞壁成分解聚和ABA合成从而介导果实的成熟软化。【结论】中国樱桃CpMADS47基因能够促进果实成熟软化,为后续中国樱桃果实质地品质改良奠定理论基础和提供基因资源。

关键词：中国樱桃 CpMADS47 果实成熟软化生物信息学分析瞬时过表达

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西瓜果肉硬度候选基因的鉴定与功能验证

西瓜果肉硬度候选基因的鉴定与功能验证

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作者： MUHAMMAD ANEES 中国农业科学院

学位级别：博士

西瓜是在世界范围内广泛种植的优质水果之一。作为重要的品质性状,西瓜果肉硬度与果实质地、商品性和货架期等密切相关,并受到细胞结构、细胞壁组成和激素等关键因素的正向或负向调控。鉴于果肉硬度在果实品质中起到的重要作用,通过基... 详细信息

西瓜是在世界范围内广泛种植的优质水果之一。作为重要的品质性状,西瓜果肉硬度与果实质地、商品性和货架期等密切相关,并受到细胞结构、细胞壁组成和激素等关键因素的正向或负向调控。鉴于果肉硬度在果实品质中起到的重要作用,通过基因定位挖掘与果肉硬度相关的调控因子,为西瓜优质育种提供理论与技术支撑。在本研究中,基于198份西瓜种质的全基因组重测序数据,对果肉硬度进行全基因组关联分析（GWAS）,并获得34个与硬度性状显著关联的SNP位点。以果肉硬度低的栽培种西瓜“中果京欣”和果肉硬度高的黏籽西瓜“PI595203”为母本和父本,杂交获得F1,自交后获得F2群体。为了定位到调控西瓜果肉硬度的连锁QTL,对F2群体中每个单株的果肉厚度进行测定,并构建两个极端混池进行BSR-Seq（Bulk-Segregant RNA-Seq）分析。结果共定位到了3个与果肉硬度关联的QTL位点,其中2个位于2号染色体,分别位于35.65–35.66和35.68-37.79 Mb的区间内,1个QTL位于6号染色体10.266-22.864 Mb的区间内,各区间大小分别为0.010 Mb、2.11 Mb和12.60 Mb。基于两个亲本“中果京欣”（CL）和“PI 595203”（CM）在授粉后34天果实的RNA-Seq测序数据鉴定到差异表达基因。对差异表达基因进行富集分析,在细胞壁合成,木葡聚糖代谢途径以及与植物激素信号转导等通路中富集到的与果实发育与成熟相关的差异基因。为了对西瓜果肉硬度的精细定位,将GWAS和BSR-Seq的定位结果进行了联合分析,在6号染色体上获得了包含10个候选基因的重叠候选区域（12776310-12968331）。结合RNA-Seq数据对基因表达水平进行分析时,发现生长素响应蛋白Cla97C06G118630（Aux/IAA）在3个硬果肉的品种中的表达量要显著高于3个软果肉的品种,并结合RT-q PCR分析对候选基因的表达水平进行了验证。通过候选基因的序列比对显示Aux/IAA编码区存在单碱基突变。同时,通过F2群体和自然群体的竞争等位基因特异性PCR（KASP）、基因分型数据集分析表明,Aux/IAA的等位基因变异与西瓜果肉硬度具有强相关性,进一步说明Aux/IAA是西瓜果肉硬度相关的关键候选基因。候选基因Aux/IAA在植物激素信号转导通路中富集,可能参与细胞增大并导致西瓜果肉硬度的降低。硬度低的西瓜果实的ABA含量高于硬度高的果实,随着果实发育成熟,ABA含量随肉硬度的降低而增加。此外,果肉较软的西瓜中Aux/IAA等位基因变异在黏籽西瓜中便已经存在,并在驯化为栽培种西瓜时被固定,表明果肉硬度是与西瓜驯化相关的性状。 Aux/IAA家族基因广泛参与植物发育和成熟。本研究通过对西瓜Aux/IAA家族基因的全基因组鉴定,鉴定出28个Aux/IAA基因。通过系统发育分析,这些基因划分为6个亚簇。这些基因包含高度保守的结构域I、II、III和IV,且启动子分析检测到生长素和ABA应答顺式调控元件。在28个Aux/IAA基因中,RNA-Seq结果显示候选基因Cla97C06G118630（Aux/IAA）在硬果肉野生果实中表达量高于软果肉的栽培品种。此外,软果肉果实中ABA含量高于硬果肉果实。通过细胞学观察,发现软果肉的细胞尺寸较大,而硬果肉的细胞尺寸较小且排列紧凑。同时,相关分析发现了果肉硬度与ABA含量与细胞大小密切相关。 Aux/IAA基因的过表达降低了西瓜真叶中ABA含量和细胞大小,提高了叶片中细胞密度。此外,在西瓜果实中的Aux/IAA基因过表达导致增加了果肉硬度和细胞数量,同时降低了ABA含量和果肉细胞大小。该研究结果将为对西瓜果实果肉的硬度形成提供理论依据,为西瓜品质育种提供技术支撑。

关键词：西瓜果肉硬度基因鉴定全基因组表征瞬时过表达

来源：评论

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棉花凝集素类受体蛋白激酶基因GhLecRK1响应棉蚜危害的功能分析

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南方农业学报 2024年第7期55卷 2116-2125页

作者：何华楚龙燕李建平张建民于永浩武汉生物工程学院园林园艺学院湖北武汉430415 长江大学农学院湖北荆州434000 广西作物病虫害生物学重点实验室广西南宁530007

【目的】克隆棉花(Gossgpium hirsutum)凝集素类受体蛋白激酶(LecRK1)基因GhLecRK1,分析其在响应棉蚜危害中的功能,为培育棉花抗蚜新品种提供理论参考。【方法】在棉蚜诱导的棉花叶片全转录组测序数据分析基础上,克隆响应棉蚜危害的GhLe... 详细信息

【目的】克隆棉花(Gossgpium hirsutum)凝集素类受体蛋白激酶(LecRK1)基因GhLecRK1,分析其在响应棉蚜危害中的功能,为培育棉花抗蚜新品种提供理论参考。【方法】在棉蚜诱导的棉花叶片全转录组测序数据分析基础上,克隆响应棉蚜危害的GhLecRK1基因,并对其序列进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR检测GhLecRK1基因在棉蚜诱导下的表达模式,运用瞬时过表达技术研究其在棉花对棉蚜防御响应中的功能。【结果】GhLecRK1基因开放阅读框(ORF)长度1233 bp,编码410个氨基酸残基,理论等电点(pI)8.36,预测蛋白质分子量45948 Da,由具有1个α-甘露糖凝集素结合结构域、1个S-糖蛋白结构域(SLG)和1个纤溶酶原/苹果/线虫结构域(PAN)组成,属G型凝集素类受体蛋白激酶。同源序列比对分析结果表明,GhLecRK1与其他植物的G型LecRLKs序列具有高度相似性(94.39%)。系统发育分析结果表明,GhLecRK1与Gossypium raimondii的Gr012449778.1亲缘关系最近。在棉蚜取食诱导后24、48和72 h的棉花植株的子叶、根、茎中GhLecRK1基因的表达量均有不同程度上调,但是仅有子叶在棉蚜取食24 h时GhLecRK1基因相对表达量显著上调(P<0.05,下同)。选择性和非选择性试验结果显示,瞬时过表达GhLecRK1基因棉花上棉蚜的数量均少于WT植株和pMD植株,且在取食48 h时过表达GhLecRK1基因棉花上棉蚜蜜露的分泌量显著减少。【结论】GhLecRK1基因响应棉花对棉蚜的防御反应,GhLecRK1基因过量表达后可增强棉花对棉蚜的抗性。

关键词：棉花 GhLecRK1基因抗蚜性瞬时过表达

来源：评论

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本氏烟转录因子NAC062对马铃薯Y病毒侵染的抑制与应用

本氏烟转录因子NAC062对马铃薯Y病毒侵染的抑制与应用

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作者：曲潇玲中国农业科学院

学位级别：硕士

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是烟草上最具破坏性的病毒之一,NAC转录因子与植物的生长发育及抗病抗逆密切相关,研究NAC062在PVY侵染中的功能,可为抗病毒药剂的研制提供靶标。本文以本氏烟(Nicotiana benthamiana)为材料,探究Nb NAC... 详细信息

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是烟草上最具破坏性的病毒之一,NAC转录因子与植物的生长发育及抗病抗逆密切相关,研究NAC062在PVY侵染中的功能,可为抗病毒药剂的研制提供靶标。本文以本氏烟(Nicotiana benthamiana)为材料,探究Nb NAC062转录因子在PVY侵染中的调控作用并研发抗PVY纳米药剂,主要研究结果如下:1.克隆Nb NAC062,其编码646个氨基酸,N端28～179 aa为NAC结构域,129～185 aa为DNA键合区域,C末端621～643 aa为疏水跨膜域,与渐狭叶烟草Na NAC062亲缘关系最近。Nb NAC062启动子包含植物激素响应元件ABRE、TGACG-motif、CGTCA-motif、as-1以及抗逆作用相关元件DRE、MYB、MYC,暗示Nb NAC062与植物生长发育和抗病抗逆相关。2.构建RFP-Nb NAC062融合蛋白浸润叶片,激光共聚焦显微镜下观察到Nb NAC062定位于细胞膜,PVY侵染激活其从细胞膜转移至细胞核。本氏烟接种PVY后实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测发现:PVY处理组5、7 d其Nb NAC062 m RNA水平显著高于对照组,分别为对照组的2.52倍、1.95倍。蛋白移位和m RNA上调表达均显示Nb NAC062响应PVY侵染。3.构建p TRV-Nb NAC062沉默载体与p Earley Gate100-RFP-Nb NAC062过表达载体,浸润叶片进行病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)和瞬时过表达。接种PVY后q RTPCR和Western Blot检测发现:接种后3、5、7 d,沉默组PVY CP m RNA显著高于空载体TRV00对照组,分别为对照组的2.12倍、2.41倍、1.38倍,免疫球蛋白结合蛋白基因Bi P(immunoglobulinbinding protein gene,Bi P)分别下调表达28.19%、58.11%、10.77%;5～7 d沉默组PVY CP蛋白含量显著高于对照组,PVY-GFP荧光强度也高于对照组。过表达Nb NAC062并接种PVY,接种后24、48、72 h,与对照组相比,过表达组PVY CP m RNA分别下调22.60%、34.51%、36.21%,接种48、72 h,Bi P m RNA上调表达,分别为对照组的1.56倍、1.35倍,过表达组PVY CP蛋白含量亦低于对照组。上述结果显示Nb NAC062对PVY侵染具有抑制作用,可能通过调节Bi P的表达而发挥作用。创制Nb NAC062敲除和过表达材料,正常条件下,播种出苗与野生型无显著差异。4.利用壳聚糖季铵盐(chitosan quaternary ammonium salt,HACC)对Nb NAC062进行包裹,创制纳米药物,以HACC为对照,检测其对PVY侵染的预防作用。本氏烟浸润Nb NAC062-HACC纳米药物或HACC后接种PVY,q RT-PCR检测发现,接种后5、7、9 d,施药组PVY CP m RNA水平分别下调17.41%、47.81%、13.03%。施药组接种PVY-GFP后7～8 d,PVY荧光强度明显暗于对照组,10 d后差异不明显。本研究首次创制Nb NAC062-HACC纳米药物,防效试验显示该药物能抑制PVY初期侵染,后续优化药物制备工艺和施用方法,可用于预防病毒病的发生。综上,Nb NAC062属NAC类转录因子,与植物抗病抗逆密切相关;Nb NAC062可能通过调控Bi P的表达抑制PVY的早期侵染增殖;创制Nb NAC062敲除和过表达材料,可用于抗病抗逆相关研究,丰富种质资源;Nb NAC062-HACC抑制PVY初期侵染和延缓病毒增殖速度,未来可用于PVY的预防。

关键词： NbNAC062 马铃薯Y病毒基因沉默瞬时过表达纳米药物

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