检索结果-内蒙古大学图书馆

作者： MUHAMMAD ANEES 中国农业科学院

学位级别：博士

西瓜是在世界范围内广泛种植的优质水果之一。作为重要的品质性状,西瓜果肉硬度与果实质地、商品性和货架期等密切相关,并受到细胞结构、细胞壁组成和激素等关键因素的正向或负向调控。鉴于果肉硬度在果实品质中起到的重要作用,通过基... 详细信息

西瓜是在世界范围内广泛种植的优质水果之一。作为重要的品质性状,西瓜果肉硬度与果实质地、商品性和货架期等密切相关,并受到细胞结构、细胞壁组成和激素等关键因素的正向或负向调控。鉴于果肉硬度在果实品质中起到的重要作用,通过基因定位挖掘与果肉硬度相关的调控因子,为西瓜优质育种提供理论与技术支撑。在本研究中,基于198份西瓜种质的全基因组重测序数据,对果肉硬度进行全基因组关联分析（GWAS）,并获得34个与硬度性状显著关联的SNP位点。以果肉硬度低的栽培种西瓜“中果京欣”和果肉硬度高的黏籽西瓜“PI595203”为母本和父本,杂交获得F1,自交后获得F2群体。为了定位到调控西瓜果肉硬度的连锁QTL,对F2群体中每个单株的果肉厚度进行测定,并构建两个极端混池进行BSR-Seq（Bulk-Segregant RNA-Seq）分析。结果共定位到了3个与果肉硬度关联的QTL位点,其中2个位于2号染色体,分别位于35.65–35.66和35.68-37.79 Mb的区间内,1个QTL位于6号染色体10.266-22.864 Mb的区间内,各区间大小分别为0.010 Mb、2.11 Mb和12.60 Mb。基于两个亲本“中果京欣”（CL）和“PI 595203”（CM）在授粉后34天果实的RNA-Seq测序数据鉴定到差异表达基因。对差异表达基因进行富集分析,在细胞壁合成,木葡聚糖代谢途径以及与植物激素信号转导等通路中富集到的与果实发育与成熟相关的差异基因。为了对西瓜果肉硬度的精细定位,将GWAS和BSR-Seq的定位结果进行了联合分析,在6号染色体上获得了包含10个候选基因的重叠候选区域（12776310-12968331）。结合RNA-Seq数据对基因表达水平进行分析时,发现生长素响应蛋白Cla97C06G118630（Aux/IAA）在3个硬果肉的品种中的表达量要显著高于3个软果肉的品种,并结合RT-q PCR分析对候选基因的表达水平进行了验证。通过候选基因的序列比对显示Aux/IAA编码区存在单碱基突变。同时,通过F2群体和自然群体的竞争等位基因特异性PCR（KASP）、基因分型数据集分析表明,Aux/IAA的等位基因变异与西瓜果肉硬度具有强相关性,进一步说明Aux/IAA是西瓜果肉硬度相关的关键候选基因。候选基因Aux/IAA在植物激素信号转导通路中富集,可能参与细胞增大并导致西瓜果肉硬度的降低。硬度低的西瓜果实的ABA含量高于硬度高的果实,随着果实发育成熟,ABA含量随肉硬度的降低而增加。此外,果肉较软的西瓜中Aux/IAA等位基因变异在黏籽西瓜中便已经存在,并在驯化为栽培种西瓜时被固定,表明果肉硬度是与西瓜驯化相关的性状。 Aux/IAA家族基因广泛参与植物发育和成熟。本研究通过对西瓜Aux/IAA家族基因的全基因组鉴定,鉴定出28个Aux/IAA基因。通过系统发育分析,这些基因划分为6个亚簇。这些基因包含高度保守的结构域I、II、III和IV,且启动子分析检测到生长素和ABA应答顺式调控元件。在28个Aux/IAA基因中,RNA-Seq结果显示候选基因Cla97C06G118630（Aux/IAA）在硬果肉野生果实中表达量高于软果肉的栽培品种。此外,软果肉果实中ABA含量高于硬果肉果实。通过细胞学观察,发现软果肉的细胞尺寸较大,而硬果肉的细胞尺寸较小且排列紧凑。同时,相关分析发现了果肉硬度与ABA含量与细胞大小密切相关。 Aux/IAA基因的过表达降低了西瓜真叶中ABA含量和细胞大小,提高了叶片中细胞密度。此外,在西瓜果实中的Aux/IAA基因过表达导致增加了果肉硬度和细胞数量,同时降低了ABA含量和果肉细胞大小。该研究结果将为对西瓜果实果肉的硬度形成提供理论依据,为西瓜品质育种提供技术支撑。

关键词：西瓜果肉硬度基因鉴定全基因组表征瞬时过表达

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本氏烟NbNAC062的克隆及对马铃薯Y病毒侵染的抑制作用

引用

中国农业科学 2021年第19期54卷 4110-4120页

作者：曲潇玲焦裕冰罗健达宋丽云李莹申莉莉杨金广王凤龙中国农业科学院烟草研究所

【目的】马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是危害我国烟草生产的最重要病毒之一,NAC转录因子与植物的抗病、抗逆密切相关,本论文克隆NbNAC062进行生物信息学分析,并研究其在PVY侵染过程中的作用,为烟草抗病毒药剂的开发提供靶标。【方... 详细信息

【目的】马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是危害我国烟草生产的最重要病毒之一,NAC转录因子与植物的抗病、抗逆密切相关,本论文克隆NbNAC062进行生物信息学分析,并研究其在PVY侵染过程中的作用,为烟草抗病毒药剂的开发提供靶标。【方法】以本氏烟(Nicotiana benthamiana)为材料克隆NbNAC062,利用MEGA、UniProt、SMART、TMHMM Server2.0、Sol Genomics Network、PlantCARE等技术进行生物信息学分析;利用激光共聚焦与实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)明确PVY侵染前后NbNAC062蛋白定位及mRNA表达量变化;基于病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)和过表达技术,构建pTRV::NbNAC062沉默载体与pEarleyGate100::RFP::NbNAC062过表达载体,采用qRT-PCR和Western blot检测NbNAC062在本氏烟中沉默与过表达后,PVY的积累量变化及未折叠蛋白应答(unfolded protein response,UPR)相关基因BiP的表达差异。【结果】NbNAC062编码646个氨基酸,N端28—179 aa为NAC结构域,129—185 aa为DNA结合区域,C末端621—643 aa为疏水跨膜结构,系统进化树与蛋白序列分析表明本氏烟NbNAC062与渐狭叶烟草NaNAC062亲缘关系最近。NbNAC062启动子中包含脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸以及逆境响应相关的多种顺式作用元件。PVY侵染激活NbNAC062从细胞膜转移至细胞核,且诱导NbNAC062上调表达。PVY侵染本氏烟5、7 d,处理组NbNAC062mRNA水平分别为对照组的2.52、1.95倍;PVY侵染3 d,BiP mRNA表达量为对照组的2.39倍,PVY侵染7 d,BiP表达量极显著低于对照组,下调表达56.77%。本氏烟沉默NbNAC062并接种PVY,接种后3、5、7 d,与对照组相比,沉默组PVY CP mRNA上调表达,分别为对照组的2.12、2.41、1.38倍,BiP mRNA表达量则下调,分别下调28.19%、58.11%、10.77%,接种后5、7 d沉默组PVY CP蛋白含量亦显著高于对照组。过表达NbNAC062并接种PVY,接种后24、48、72 h,与对照组相比,过表达组PVY CP mRNA分别下调22.60%、34.51%、36.21%,接种48、72 h,BiP mRNA上调表达,分别为对照组的1.56、1.35倍,过表达组PVY CP蛋白含量亦低于对照组。【结论】NbNAC062属于NAC类膜结合转录因子,可被PVY侵染激活转移至细胞核,可能通过调控UPR相关基因BiP的表达,促进细胞生存,抑制PVY早期侵染。

关键词： NbNAC062 马铃薯Y病毒基因沉默瞬时过表达

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本氏烟转录因子NAC062对马铃薯Y病毒侵染的抑制与应用

本氏烟转录因子NAC062对马铃薯Y病毒侵染的抑制与应用

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作者：曲潇玲中国农业科学院

学位级别：硕士

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是烟草上最具破坏性的病毒之一,NAC转录因子与植物的生长发育及抗病抗逆密切相关,研究NAC062在PVY侵染中的功能,可为抗病毒药剂的研制提供靶标。本文以本氏烟(Nicotiana benthamiana)为材料,探究Nb NAC... 详细信息

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是烟草上最具破坏性的病毒之一,NAC转录因子与植物的生长发育及抗病抗逆密切相关,研究NAC062在PVY侵染中的功能,可为抗病毒药剂的研制提供靶标。本文以本氏烟(Nicotiana benthamiana)为材料,探究Nb NAC062转录因子在PVY侵染中的调控作用并研发抗PVY纳米药剂,主要研究结果如下:1.克隆Nb NAC062,其编码646个氨基酸,N端28～179 aa为NAC结构域,129～185 aa为DNA键合区域,C末端621～643 aa为疏水跨膜域,与渐狭叶烟草Na NAC062亲缘关系最近。Nb NAC062启动子包含植物激素响应元件ABRE、TGACG-motif、CGTCA-motif、as-1以及抗逆作用相关元件DRE、MYB、MYC,暗示Nb NAC062与植物生长发育和抗病抗逆相关。2.构建RFP-Nb NAC062融合蛋白浸润叶片,激光共聚焦显微镜下观察到Nb NAC062定位于细胞膜,PVY侵染激活其从细胞膜转移至细胞核。本氏烟接种PVY后实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测发现:PVY处理组5、7 d其Nb NAC062 m RNA水平显著高于对照组,分别为对照组的2.52倍、1.95倍。蛋白移位和m RNA上调表达均显示Nb NAC062响应PVY侵染。3.构建p TRV-Nb NAC062沉默载体与p Earley Gate100-RFP-Nb NAC062过表达载体,浸润叶片进行病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)和瞬时过表达。接种PVY后q RTPCR和Western Blot检测发现:接种后3、5、7 d,沉默组PVY CP m RNA显著高于空载体TRV00对照组,分别为对照组的2.12倍、2.41倍、1.38倍,免疫球蛋白结合蛋白基因Bi P(immunoglobulinbinding protein gene,Bi P)分别下调表达28.19%、58.11%、10.77%;5～7 d沉默组PVY CP蛋白含量显著高于对照组,PVY-GFP荧光强度也高于对照组。过表达Nb NAC062并接种PVY,接种后24、48、72 h,与对照组相比,过表达组PVY CP m RNA分别下调22.60%、34.51%、36.21%,接种48、72 h,Bi P m RNA上调表达,分别为对照组的1.56倍、1.35倍,过表达组PVY CP蛋白含量亦低于对照组。上述结果显示Nb NAC062对PVY侵染具有抑制作用,可能通过调节Bi P的表达而发挥作用。创制Nb NAC062敲除和过表达材料,正常条件下,播种出苗与野生型无显著差异。4.利用壳聚糖季铵盐(chitosan quaternary ammonium salt,HACC)对Nb NAC062进行包裹,创制纳米药物,以HACC为对照,检测其对PVY侵染的预防作用。本氏烟浸润Nb NAC062-HACC纳米药物或HACC后接种PVY,q RT-PCR检测发现,接种后5、7、9 d,施药组PVY CP m RNA水平分别下调17.41%、47.81%、13.03%。施药组接种PVY-GFP后7～8 d,PVY荧光强度明显暗于对照组,10 d后差异不明显。本研究首次创制Nb NAC062-HACC纳米药物,防效试验显示该药物能抑制PVY初期侵染,后续优化药物制备工艺和施用方法,可用于预防病毒病的发生。综上,Nb NAC062属NAC类转录因子,与植物抗病抗逆密切相关;Nb NAC062可能通过调控Bi P的表达抑制PVY的早期侵染增殖;创制Nb NAC062敲除和过表达材料,可用于抗病抗逆相关研究,丰富种质资源;Nb NAC062-HACC抑制PVY初期侵染和延缓病毒增殖速度,未来可用于PVY的预防。

关键词： NbNAC062 马铃薯Y病毒基因沉默瞬时过表达纳米药物

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茶树花青素半乳糖基转移酶的鉴定与分析

茶树花青素半乳糖基转移酶的鉴定与分析

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作者：何旭秋西北农林科技大学

学位级别：硕士

花青苷（Anthocyanin）是植物中特有的一类天然水溶性色素,不仅能赋予植物组织和器官绚丽的颜色,还具有多种生物活性,开发具有高含量花青苷的食品和饮料引起了研究人员的广泛关注。茶[Camellia sinensis（L.）***]是世界上消费最广泛的... 详细信息

花青苷（Anthocyanin）是植物中特有的一类天然水溶性色素,不仅能赋予植物组织和器官绚丽的颜色,还具有多种生物活性,开发具有高含量花青苷的食品和饮料引起了研究人员的广泛关注。茶[Camellia sinensis（L.）***]是世界上消费最广泛的天然饮料之一,一些茶树品种芽叶组织中由于积累高含量的花青苷,而使其新梢呈现紫色。紫芽茶树中的花青苷主要以飞燕草素3-O-半乳糖苷、矢车菊素3-O-半乳糖苷及其酰基化形式存在,但催化花青素3-O-半乳糖苷生物合成的酶尚未见报道。UDP-半乳糖:花青素3-O-半乳糖基转移酶（UDP-galactose:anthocyanidin3-O-galactosyltransferase,UA3GalT）,被认为可能是催化半乳糖基化花青苷生物合成的关键酶。本研究以茶树品种‘陕茶1号’、‘紫娟’、‘紫嫣’以及‘湄潭苔茶’的绿色株系‘51-1’和紫色突变株‘51-2’为研究材料,首先分析了它们的花青苷含量,接着检测了上述5份材料中UA3GalT的酶活,并分析了UA3GalT活性与其花青苷总量的相关性。而后采用同源序列比对的方法从茶树基因组中筛选出一条疑似编码花青素3-O-半乳糖基转移酶的基因CsUGT78A15,并从上述材料中克隆获得该条基因的序列,分别构建其原核表达载体和植物过表达载体,通过酶学分析和瞬时过表达验证研究其生物学功能。主要研究结果如下:1.茶树一芽二叶新梢的花青苷总量分析显示,紫芽样品‘51-2’、‘紫娟’和‘紫嫣’的花青苷总量显著高于绿芽样品‘陕茶1号’和‘51-1’,其高低顺序为:‘紫嫣’>‘紫娟’>‘51-2’>‘51-1’>‘陕茶1号’。采用高效液相色谱法对紫芽样品的花青苷提取液进行分析,共检测出4个主要的色谱峰。通过比对标准品保留时间,鉴定出其中2个色谱峰为矢车菊素3-O-半乳糖苷和飞燕草素3-O-半乳糖苷,这2种花青苷含量在不同样品中的变化趋势与花青苷总量变化趋势一致。2.从5个样品中提取了粗酶,分别以UDP-半乳糖为糖供体、矢车菊素为糖受体进行UA3GalT酶活检测分析。除‘51-1’外,从其余样品中提取的粗酶均具有UA3GalT活性。相关性分析表明,粗酶UA3GalT活性与花青苷总量存在显著的正相关性（r=0.929,p<0.05）,由此说明花青苷的累积与茶树UA3GalT活性密切相关。3.通过同源序列比对的方法,从茶树基因组中筛选出编码花青素3-O-半乳糖基转移酶的候选基因CsUGT78A15。将其分别从以上5个样品中克隆,发现其基因序列在紫芽茶树和绿芽茶树中完全一致。聚类分析和多序列比对分析表明,CsUGT78A15可能编码UA3GalT参与半乳糖基化花青苷的生物合成。定量分析结果表明,CsUGT78A15在紫芽样品中的相对表达量与紫芽样品中花青苷的累积相一致。4.酶学研究表明,以UDP-半乳糖为糖基供体,rCsUGT78A15能够催化矢车菊素、飞燕草素分别合成矢车菊素3-O-半乳糖苷和飞燕草素3-O-半乳糖苷,两种底物的Km值分别为32.64和45.59μM,Vmax值分别为3.29和6.63μM?min-1,kcat值分别为18.61和37.45 min-1,kcat/Km值分别为0.57和0.82 min-1?μM-1,r CsUGT78A15对飞燕草素的催化效率高于矢车菊素。以上结果说明CsUGT78A15在体外具有UA3GalT活性。5.亚细胞定位分析显示CsUGT78A15定位于内质网和细胞核,这与花青素的合成位置一致。瞬时过表达结果显示,过表达CsUGT78A15促进了矢车菊素3-O-半乳糖苷在‘澳洲青苹’成熟果实中的积累,使其果皮呈现明显的粉红色。这说明CsUGT78A15在植物体内也具有UA3GalT活性。

关键词：紫芽茶树花青苷 UA3GalT 原核表达瞬时过表达

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AP1/FUL亚家族成员鉴定及PrupeFUL4在桃果实成熟软化中的功能分析

AP1/FUL亚家族成员鉴定及PrupeFUL4在桃果实成熟软化中的功能分析

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作者：张绍宇西北农林科技大学

学位级别：硕士

AP1/FUL为MADS-box转录因子的一个亚家族,在植物生长和发育中起着重要作用。已有研究证实PPERFUL基因可以调控桃果实的核裂过程,但其在桃果实成熟软化过程中的调控机制尚不清楚。本研究首先在桃基因组中鉴定出AP1/FUL亚家族5个成员;然... 详细信息

AP1/FUL为MADS-box转录因子的一个亚家族,在植物生长和发育中起着重要作用。已有研究证实PPERFUL基因可以调控桃果实的核裂过程,但其在桃果实成熟软化过程中的调控机制尚不清楚。本研究首先在桃基因组中鉴定出AP1/FUL亚家族5个成员;然后分析其在不同组织、果实发育不同阶段及不同质地桃果实成熟软化期的表达特性,鉴定出可能参与桃果实成熟软化的AP1/FUL亚家族成员;其次以‘布目早生’为试验材料,通过对果实中PrupeFUL4基因进行瞬时沉默和过表达,从而研究PrupeFUL4基因在桃果实成熟软化过程中的功能;并进一步利用酵母双杂交试验,筛选可能与PrupeFUL4互作的蛋白,探究其与其它转录因子互作调控桃果实成熟软化的机制。主要取得以下研究结果:(1)通过生物信息学分析在桃基因组中鉴定出5个AP1/FUL亚家族成员,系统进化树分析看出Prupe AP1位于eu AP1进化枝,而其他4个成员位于eu FUL进化枝,因此分别命名为Prupe AP1和Prupe FUL1,2,3,4;和其他的FUL-like蛋白一样,AP1/FUL亚家族成员除了具有MADS-box家族保守结构域之外,在C末端具有高度保守的FUL motif(L/MPPMWL),而Prupe AP1蛋白具有不同的C端motif。(2)AP1/FUL亚家族成员的表达具有明显的组织特异性,Prupe AP1主要在花中表达,Prupe FUL1,2,3主要在叶或根中表达,PrupeFUL4主要在果实和花中表达。在不同溶质果实中,PrupeFUL4在果实第二次膨大期和成熟软化期相对表达量均较高,但在果实成熟软化期的表达量不受乙烯调节剂和ABA调节剂处理的影响。(3)病毒介导PrupeFUL4基因沉默,果肉中PrupeFUL4基因相对表达量显著下调,果实软化受到抑制,同时乙烯生物合成相关基因(Prupe ACO1和Prupe ACS2)、ABA生物合成相关基因(Prupe NCED5)以及细胞壁降解相关基因(Prupe PME3、Prupe Lox1、Prupe EXP2、Prupe PG和Prupeα-Man)也受到不同程度的下调。而果实瞬时过表达PrupeFUL4基因后,显著地促进果实软化,同时成熟软化相关基因的相对表达量也受到不同程度的上调。此外,成熟软化相关基因的启动子区均存在Car G-box作用元件,表明PrupeFUL4转录因子可能通过调控成熟软化相关基因的转录来参与调节果实成熟软化进程。(4)通过酵母双杂交筛库试验筛选出可能与PrupeFUL4互作的蛋白。酵母双杂交点对点验证表明,PrupeFUL4与Prupe SEP1、Prupe SEP2、Prupe SEP3、Prupe OFP5、Prupe GL3和Prupe AGL11蛋白存在互作,而这些蛋白与花的发育和果实的成熟密切相关,因此我们认为PrupeFUL4也可以通过与其他转录因子互作形成异源二聚体或者异源多聚体来调控桃果实成熟软化,但其分子调控机制仍需进一步进行研究。

关键词：桃 PrupeFUL4 VIGS 瞬时过表达成熟软化

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桃SPL基因家族的鉴定及PrupeSPL16,17,19在果实成熟软化过程中作用的研究

桃SPL基因家族的鉴定及PrupeSPL16,17,19在果实成熟软化过程中作...

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作者：汪先菊西北农林科技大学

学位级别：硕士

桃(Prunus persica(L.)Batsch.)果实耐贮性差,采后极易软化腐烂成为目前桃生产中亟待解决的问题之一,阐明桃果实软化机制,找出关键调控因子,对改良桃果实耐贮性具有重要意义。SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein like)基因在调控植... 详细信息

桃(Prunus persica(L.)Batsch.)果实耐贮性差,采后极易软化腐烂成为目前桃生产中亟待解决的问题之一,阐明桃果实软化机制,找出关键调控因子,对改良桃果实耐贮性具有重要意义。SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein like)基因在调控植物生长发育过程中起重要作用。本研究鉴定了桃SPL基因家族成员,同时分析了SPL家族成员在不同桃品种中的表达特性,此外还利用VIGS(Virus induced gene silence)与瞬时过表达技术研究关键成员PrupeSPL16、PrupeSPL17与PrupeSPL19在桃果实成熟软化中的功能及其作用机制。主要研究结果如下:1、在桃基因组中鉴定出25个PrupeSPL基因家族成员,根据染色体定位依次命名为PrupeSPL1-25,除PrupeSPL16基因缺乏Zn-2结构外,每个PrupeSPL基因都含有一个SBP保守结构域,两个锌指结构和一个核定位信号。2、桃SPL家族成员的表达表现出一定的组织特异性,PrupeSPL16,17在果实中高表达;新梢中PrupeSPL7和PrupeSPL8表达量较高;叶片中PrupeSPL14,15具有较高表达量;绝大部分PrupeSPL成员在根和花中的表达量较低,但在幼果中表达量较高,随着果实的生长发育表达量呈下降趋势,但不同品种间存在一定差异。在果实成熟软化期,PrupeSPL1,3,4,7,8,10,14,15,16,17,19均呈上调表达趋势;而其他PrupeSPL家族成员的表达量较低且稳定。乙烯处理‘秦王’果实,促进PrupeSPL10-20的表达;而乙烯处理‘浅间白桃’果实,显著促进了PrupeSPL1-9,13,19的表达,对其他PrupeSPL家族成员的表达量影响较小。3、PrupeSPL16定位于细胞核与细胞膜,而PrupeSPL17定位于细胞核。病毒诱导果实中PrupeSPL16,PrupeSPL17,PrupeSPL19基因瞬时沉默后,果实软化受到不同程度的抑制,除Pp EXP外,成熟软化相关基因的表达量均下调,且在贮藏后期下调作用更显著。果实中瞬时过表达PrupeSPL16,PrupeSPL17后,果实的凝聚性显著降低,但对果实硬度变化的影响较小,同时在贮藏前期成熟软化相关基因的表达量被显著抑制,而在贮藏后期被显著促进。4、酵母单杂实验结果显示,PrupeSPL16、PrupeSPL17蛋白均可以与Pp ACS2、Pp ACO1启动子互作,而与Pp PG2和Pp EIN1的启动子均不互作。本研究对桃PrupeSPL基因家族进行了系统的分析,为进一步研究SPL基因与其他调控果实成熟基因在桃果实发育及成熟软化过程中的功能特性奠定了重要基础。

关键词：桃成熟软化 PrupeSPL VIGS 瞬时过表达

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草莓FaMYB11基因调控果实类黄酮代谢的研究

草莓FaMYB11基因调控果实类黄酮代谢的研究

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作者：杨华丽四川农业大学

学位级别：硕士

草莓(Fragaria×ananassa Duch)属蔷薇科草莓属植物,其具有果实颜色鲜艳、肉质细嫩、营养丰富和富含类黄酮物质等特点,深受消费者喜爱。草莓的类黄酮代谢调控的研究一直是草莓研究的热点。草莓FaMYB11基因可以调控草莓类黄酮代谢,... 详细信息

草莓(Fragaria×ananassa Duch)属蔷薇科草莓属植物,其具有果实颜色鲜艳、肉质细嫩、营养丰富和富含类黄酮物质等特点,深受消费者喜爱。草莓的类黄酮代谢调控的研究一直是草莓研究的热点。草莓FaMYB11基因可以调控草莓类黄酮代谢,但其中的机理尚不清晰。本研究以栽培草莓‘红颜’为材料,通过荧光定量、过表达和酵母双杂交等技术对FaMYB11进行研究,来探究FaMYB11调控草莓果实类黄酮化合物代谢途径的机制。得到的结果如下:1.以栽培草莓‘红颜’为材料,克隆得到了FaMYB11基因,经生物信息学分析后得到其CDS区927 bp,编码一个含308个氨基酸的多肽,预测其蛋白质分子量为34.9k D,等电点为6.35,不含信号肽和跨膜结构。亚细胞定位结果显示,FaMYB11定位于细胞核中。2.对FaMYB11的启动子进行克隆,得到启动子2218 bp,生物信息学分析显示,该启动子含有多个MYB和MYC结合位点,还有多个光响应元件,以及真菌触发子响应元件和低温响应元件。3.运用实时荧光定量技术分析FaMYB11基因在各个组织中的表达量,结果显示:FaMYB11在草莓各组织中均有表达,在功能叶中的表达量最高,而在果实发育过程中,处于白果期的果实中FaMYB11表达量最高,进入转色期后果实中的FaMYB11表达量下降。4.构建FaMYB11过表达载体,在白果期的‘红颜’果实中进行瞬时过表达,结果显示果实中的花青素和原花青素的含量显著提高;荧光定量分析显示,过表达FaMYB11基因使类黄酮代谢途径中的的结构基因F3’H,ANR,LAR得表达量都极显著增加,对PAL,CHS,CHI,F3H,OMT等类黄酮代谢的结构基因无显著影响。5.为验证FaMYB11蛋白与类黄酮代谢相关转录因子的互作关系,构建FaMYB11酵母载体,将其转入酵母中进行验证。酵母双杂交结果显示,FaMYB11蛋白可以FaEGL3、FaGL3蛋白互作。6.构建FaMYB11-p GEX原核表达载体,在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达,结果显示,目的蛋白大小约为62.5 k Da,经SDS-PAGE发现重组蛋白大部分以包涵体的形式存在,用GST树脂柱对上清进行纯化,得到了纯化的FaMYB11融合蛋白。综合上述结果,本实验发现FaMYB11通过调节结构基因F3’H,ANR,LAR的表达来调控草莓类黄酮代谢途径。同时发现FaMYB11蛋白与FaEGL3,FaGL3存在互作,为后续构建稳定转基因植株、EMSA等实验对FaMYB11基因的功能进行进一步的研究以阐明其对草莓类黄酮代谢的调控机理奠定了基础。

关键词：草莓 FaMYB11基因瞬时过表达酵母双杂交蛋白纯化

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喜树转录因子ORA1在喜树碱合成中的应用

喜树转录因子ORA1在喜树碱合成中的应用

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作者：许金鸽大连工业大学

学位级别：硕士

喜树碱（Camptothecin,CPT）是喜树中重要的次生代谢产物,其衍生物作为抗肿瘤药物,在临床中被大众认可。喜树碱主要从喜树叶片和果实中提取,由于其在植株组织中含量较低,因此,只有大量的供应原料,才能够应对庞大的市场需求。转录因子作... 详细信息

喜树碱（Camptothecin,CPT）是喜树中重要的次生代谢产物,其衍生物作为抗肿瘤药物,在临床中被大众认可。喜树碱主要从喜树叶片和果实中提取,由于其在植株组织中含量较低,因此,只有大量的供应原料,才能够应对庞大的市场需求。转录因子作为药用植物次生代谢产物的重要调控因子一直倍受关注。研究表明,长春碱与喜树碱都属于萜类吲哚生物碱,两者存在着一些共同的代谢途径;此外,有研究显示,在长春花中存在ORCA（Octadecaniod-derivative Responsive Catharanthus AP2-domain protein）类转录因子对长春碱的生物合成具有显著的促进作用,其通过作用于上游途径关键酶基因,进而促进长春质碱的生物合成。然而,喜树中ORA类转录因子鲜有报道,因此,克隆该类转录因子,并研究其在喜树中的功能以及最终应用其提高其喜树碱的积累具有重要意义。本文首先利用同源序列比对,在喜树转录组数据库中找到与ORCA高度同源的一个转录因子,并将之命名为ORA1;利用分子生物学手段从喜树叶片中克隆该ORA1,构建过表达载体p BI121GD-ORA1和低温诱导表达载体rd29A::ORA1。系统发育分析结果表明,ORA1的蛋白质结构域处和长春花中ORCA蛋白质和拟南芥基因组中几个ERF基因的蛋白质序列同源性很高,且它们的结构域处非常保守。一级、二级结构以及三级结构预测结果显示,ORA1蛋白分子式为C1209H1924N346O374S4,由249个氨基酸组成,大小为27.4 KDa;ORA1蛋白质蛋白质总长的61.04%为无规则卷曲,α-螺旋和延伸链分别占23.29%和12.05%;三级结构预测所得模型与二级结构预测结果相符。然后,通过农杆菌介导瞬时转化手段,在喜树叶片中瞬时过表达该目的基因ORA1。利用高效液相色谱测定p BI121GD-ORA1,组成型过表达ORA1对喜树叶片中喜树碱合成量影响,结果显示,喜树碱合成量提升了68%。同时,利用Real Time PCR技术测定ORA1组成型过表达及低温诱导表达（0 h、24 h和48 h）喜树叶片中喜树碱合成途径关键酶基因的转录水平。结果显示,ORA1组成型过表达后,Ca7DLGT、Ca G8O、Ca7DLS、Ca CYC1和Ca STR分别上调至对照组的19.0、4.2、2.0、4.9和25.0倍,对合成途径上游关键酶基因的影响尤为显著,同时对茉莉酸（JA）响应基因Ca JR3和JA合成基因Ca AOC2有促进作用。此外,我们发现,在低温诱导瞬时过表达ORA1喜树叶片中,经24 h的4℃低温诱导后,实验组与对照组相比,喜树碱合成途径上游关键酶基因的表达均有所上调,如Ca G8O、Ca7DLS、Ca7DLGT、Ca CYC1和Ca STR分别提高为0 h的6.8、10.38、6.68、7.7和23.95倍,JA合成关键酶基因Ca AOC2上调了4.04倍,JA信号响应基因Ca JR3上调为对照组的4.85倍。上述结果表明,在喜树叶片中过表达ORA1会促进喜树碱合成上游途径中的Ca STR、Ca G8O和Ca7DLS等基因的表达量上调,进而促进喜树碱合成,同时ORA1与JA信号相关。本研究,成功克隆了喜树中的转录因子ORA1,并利用其在喜树中进行瞬时过表达,成功提高了喜树碱合成的积累量。并初步确定其可能通过促进JA合成及其信号转导,进而促进喜树碱合成上游途径关键酶基因Ca STR、Ca CYC1和Ca7DLS等的表达上调,最终促进喜树碱的生物合成。本文为研究转录因子ORA1调控喜树碱合成的分子机制提供了数据支持,同时为利用喜树中转录因子最终调控喜树碱的合成提供新的研究策略。

关键词：喜树碱合成转录因子ORA(Octadecaniod-derivative Responsive AP2-domain) 低温诱导瞬时过表达茉莉酸

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转录因子CaERF-1与CaERF-2调控喜树碱的生物合成

转录因子CaERF-1与CaERF-2调控喜树碱的生物合成

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作者：韩玉乾大连工业大学

学位级别：硕士

喜树碱(Camptothecin,CPT)及其衍生物能够很好地抑制肿瘤细胞的增殖,因此广泛应用于临床癌症疾病的治疗。但喜树碱在喜树中天然合成量低,无法满足市场需求。因此,深入研究喜树碱的生物合成调控模式尤为重要。喜树碱的生物合成受多种因... 详细信息

喜树碱(Camptothecin,CPT)及其衍生物能够很好地抑制肿瘤细胞的增殖,因此广泛应用于临床癌症疾病的治疗。但喜树碱在喜树中天然合成量低,无法满足市场需求。因此,深入研究喜树碱的生物合成调控模式尤为重要。喜树碱的生物合成受多种因素影响,转录因子作为其中尤为重要的一个因素,具有显著调控植物次生代谢产物合成的功能。AP2/ERF(APETALA2/ethylene-response factor)家族转录因子是植物最大转录因子家族之一,之前的研究主要集中于其调控植物的生长发育,近几年来逐渐向调控植物次生代谢产物合成方向过渡。此外,研究证明,植物激素-脱落酸(abscisic acid,ABA)是植物生化防御系统中一种重要的信号分子,不仅调控植物非生物胁迫应答,而且对生物胁迫也具有很强的调控作用。AP2/ERF家族中的转录因子ORA47(octadecanoid-responsive AP2/ERF-domain transcription factor 47)能够结合ABA信号途径负调控因子ABI2的启动子中的顺式作用元件,通过调控ABA的生物合成,从而调控植物的次生代谢过程。本文从拟南芥AP2/ERF家族转录因子ORA47出发,通过同源相似性分析,从喜树转录组数据库中成功找出并克隆了与ORA47同源性最高的两个转录因子CaERF-1、CaERF-2,随后建立了组成型启动子和诱导型启动子的过表达体系,通过农杆菌瞬时转化技术侵染至喜树叶片,检测喜树碱的积累及喜树碱合成途径中关键酶基因的表达情况。首先,成功实现了CaERF-1、CaERF-2在喜树叶片中组成型瞬时过表达,且过表达后喜树碱的积累量提高1倍;喜树碱合成途径关键酶基因CaCYC1与CaG8O的相对表达量显著提高。其中,CaERF-2过表达后,喜树碱合成上游途径酶基因CaG8O相对表达量提高了约14倍,CaCYC1表达量提高了约27倍,调控效果十分显著。推测CaERF-1、CaERF-2通过调控途径关键酶基因CaCYC1与CaG8O表达量进而促进喜树碱的合成。第二,成功实现了由诱导型启动子rd29A驱动CaERF-1、CaERF-2在喜树叶片中的瞬时表达。经低温诱导后,转录因子CaERF-1、CaERF-2基因表达量明显升高,其中CaERF-1表达量提升了约2倍,CaERF-2表达量提升了约6倍。并且CaERF-1诱导过表达后,喜树碱合成途径上游关键酶基因Ca7DLS表达量上调了约9倍,ABA的转运蛋白基因CaABAT表达量上调了约3倍;CaERF-2诱导过表达后,喜树碱合成途径上游关键酶基因CaG8O表达量提升了约52倍,CaABAT表达量亦提升了约50倍。由此我们推测,转录因子CaERF-1、CaERF-2可能通过参与植物激素ABA的信号途径,调控植物激素ABA的合成,从而间接调控喜树碱的合成。第三,进一步分析了ABA与CaERF-1、CaERF-2的联系。浓度为20 mg/m L的ABA溶液对野生型喜树叶片进行浸泡处理0～4 h后,发现几乎所有喜树碱生物合成途径相关生物酶基因的表达量在2 h内显著增高。与此同时,两个转录因子CaERF1、CaERF2的基因表达量也明显上调。表明ABA能在一定程度上激活某些与喜树碱合成相关转录因子的活性,调控喜树碱合成代谢途径关键酶的表达,从而促进喜树碱的合成。第四,通过生物信息学分析,确定转录因子CaERF1、CaERF2均隶属于转录因子AP2/ERF家族,均含有一个AP2保守结构域,有很好的亲水性。并且多级结构预测显示它们主要由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链组成,可能参与激素信号转导和胁迫响应应答。并且CaERF-1比CaERF-2具有更好的稳定性,表明在调控植物次生代谢途径中,CaERF-1可能发挥更加稳定的作用。我们对其结构和功能的预测,对接下来解析其参与信号转导的具体机制奠定了良好的基础。综上所述,本文成功克隆了喜树中AP2/ERF家族转录因子CaERF1与CaERF2,并证实CaERF1与CaERF2可能通过两种途径调控喜树碱的生物合成。一种是CaERF-1与CaERF-2过表达激活了ABA信号通路,与ABA合成途径关键酶的顺式作用元件结合,调控ABA的合成,从而间接调控喜树碱的合成;另一种是外源激素ABA的信号会直接激活转录因子的活性,通过调控喜树碱合成上游途径关键酶基因CaCYC1、CaG8O等的表达,最终促进喜树碱的生物合成。这两种调控模式使调控网络变得更加的多元化。为后续揭示具体的调控位点与调控模式奠定了良好的基础。

关键词：喜树碱转录因子调控 CaERF-1与CaERF-2 脱落酸瞬时过表达

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‘红绵蜜柚’生长素诱导相关基因CgPCNT115的克隆及功能分析

‘红绵蜜柚’生长素诱导相关基因CgPCNT115的克隆及功能分析

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作者：李根四川农业大学

学位级别：硕士

‘红绵蜜柚’(Citrus grandis（L.）***.‘Hongmianmiyou’)是近年从‘琯溪蜜柚’(***（L.）***.‘Guanximiyou’)芽变株系中选育的优良蜜柚新品种,具有汁多化渣、酸甜适中、丰产性好等优点。在四川产区常用枳（Poncirus trifoliata）... 详细信息

‘红绵蜜柚’(Citrus grandis（L.）***.‘Hongmianmiyou’)是近年从‘琯溪蜜柚’(***（L.）***.‘Guanximiyou’)芽变株系中选育的优良蜜柚新品种,具有汁多化渣、酸甜适中、丰产性好等优点。在四川产区常用枳（Poncirus trifoliata）作为‘琯溪蜜柚’的砧木,而课题组在推广栽培‘红绵蜜柚’时发现,以枳为砧木时嫁接苗表现出接穗叶片黄化甚至死亡现象,以香橙（***）为砧木时嫁接苗生长势良好,‘琯溪蜜柚’以枳为砧木同样可以正常生长发育。针对该现象,基于课题组前期转录组研究数据显示,CgPCNT115基因与生长素诱导相关,它可能与枳砧‘红绵蜜柚’幼苗黄化密切相关。生长素诱导蛋白PCNT115在许多植物中已经鉴定,其涉及的生理生化过程较多,但相关功能及机理并不清楚,因此,本研究以‘红绵蜜柚’为材料,克隆CgPCNT115基因及启动子序列,与‘琯溪蜜柚’克隆序列进行了比较分析。同时,对CgPCNT115在不同嫁接组合、叶片不同发育时期、不同组织中的表达特性进行了测定与分析;并对CgPCNT115基因在不同浓度的外源生长素（IAA）及生长素运输抑制剂三碘苯甲酸（TIBA）处理下的响应特性进行了探究;瞬时过表达叶片对其功能进行了初步研究。主要结果如下:（1）‘红绵蜜柚’CgPCNT115基因的克隆以‘红绵蜜柚’为材料,以‘琯溪蜜柚’为对照,从gDNA中克隆得到CgPCNT115基因及其启动子,基因序列均为1772 bp,但内含子区域存在一些单碱基差异;启动子序列均为2122 bp,且序列完全一致。CgPCNT115属于醛酮还原酶家族（AKRs）,含有两个跨膜结构区;基于序列比对和系统树构建表明,柚CgPCNT115基因与甜橙(***（L.）Osbeck)遗传关系最近,其次是克里曼丁橘（***）;启动子序列中存在一个转录起始位点及核心启动子区域,含有一些特殊的顺式作用元件,如热胁迫响应元件、激素响应的元件、MYB特异性结合元件等。（2）CgPCNT115的表达特性CgPCNT115基因表达量在不同嫁接组合中均随着叶片的发育总体呈上升的趋势,在PhaseⅣ（叶片SPAD值为60±5）时,枳砧‘红绵蜜柚’CgPCNT115基因表达量极显著低于两个对照（枳砧‘琯溪蜜柚’、香橙砧‘红绵蜜柚’）。CgPCNT115基因在枳砧‘红绵蜜柚’果肉中表达量最低,在花中表达量最高;其次在果实的果皮、海绵层及果肉中表达量相对较低,在茎段、花及叶中表达量较高。（3）CgPCNT115的响应特性对枳砧‘红绵蜜柚’新梢叶片进行3个浓度（50、100、200 mg·L-1）的外源IAA及TIBA处理,通过半定量及实时荧光定量实验结果显示:CgPCNT115的表达量在两种处理下8 h内均出现了快速响应的过程,表现为先升高后降低的趋势;50 mg·L-1的IAA及TIBA处理响应均为最快,且相同浓度下IAA处理的响应速度要略快于TIBA处理。因此,CgPCNT115对于各浓度的IAA及TIBA处理均存在短时间急剧上调的表达特性,该基因对于IAA含量变化是存在灵敏的响应机制;同时,相比于外源IAA处理,TIBA处理具有响应的滞后性。（4）CgPCNT115功能的初步研究CgPCNT115基因通过枳砧‘红绵蜜柚’叶片瞬时过表达发现,注射后5 d开始出现黄化表型;总叶绿素及总类胡萝卜素含量均在注射后5 d开始出现显著下降;通过HPLC法测定其内源激素,发现GA3含量自注射后3 d开始直到注射后7 d显著高于对照;通过对内源IAA响应及信号转导关键基因（CgARF、CgAUX/IAA、CgGH3以及CgSAUR）进行表达量测定,发现除CgAUX/IAA外,其余均出现显著下调,通过相关性分析后发现,均为显著或极显著负相关。因此,CgPCNT115基因对于叶绿素及类胡萝卜素含量、GA3合成方面可能具有一定调控作用,同时对IAA响应途径存在着负调控作用。上述研究表明,CgPCNT115基因及其启动子在‘红绵蜜柚’与‘琯溪蜜柚’中相对保守;CgPCNT115在枳砧‘红绵蜜柚’PhaseⅣ时表达量较低,在茎段、花及叶中表达量较高,在果实的果皮、海绵层及果肉中表达量相对较低;在外源IAA及TIBA处理下CgPCNT115基因均出现短时间内表达上调的响应特性;将CgPCNT115基因在枳砧‘红绵蜜柚’叶片中瞬时过表达,注射后5 d开始出现黄化表型,总叶绿素、总类胡萝卜素及GA3含量均出现下降,IAA响应及信号转导关键基因中CgARF、CgGH3以及CgSAUR均出现下调;综上,CgPCNT115基因可能参与并竞争IAA的响应及信号转导、IAA与GA3的互作以及IAA调控

关键词： ‘红绵蜜柚’ CgPCNT115 IAA 植物内源激素瞬时过表达

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