检索结果-内蒙古大学图书馆

水生生物学报 2014年第5期38卷 876-882页

作者：刘晓丹胡先勤黄剑南翁少萍王文文陈文捷秦真东董星星周洋刘小玲姬伟张学振郭志勋何建国林蠡华中农业大学水产学院水生动物医学系武汉430070 中山大学生命科学学院广州510275 农业部淡水生物繁育重点实验室武汉430070 中国水产科学研究院南海水产研究所广州510300 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心武汉430070

研究采用地高辛原位杂交和免疫荧光检测技术分别检测病毒RNA2和衣壳蛋白在患病赤点石斑鱼Epinephelus akaara稚鱼中分布。地高辛检测结果表明病毒RNA2主要分布在脑、脊髓、视网膜和鳃上;免疫荧光检测结果和地高辛检测结果一致,表明病毒... 详细信息

研究采用地高辛原位杂交和免疫荧光检测技术分别检测病毒RNA2和衣壳蛋白在患病赤点石斑鱼Epinephelus akaara稚鱼中分布。地高辛检测结果表明病毒RNA2主要分布在脑、脊髓、视网膜和鳃上;免疫荧光检测结果和地高辛检测结果一致,表明病毒靶器官主要也是脑、脊髓、视网膜和鳃。肠道中几乎检测不到阳性信号,可能不是病毒的靶器官。因此可以推测神经坏死病毒感染赤点石斑鱼的主要途径是鳃,而不是肠道。

关键词：神经坏死病毒赤点石斑鱼地高辛原位杂交免疫荧光组织分布

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神经坏死病毒MCP重组疫苗对军曹鱼稚鱼的免疫保护

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生物技术通报 2009年第S1期25卷 228-231,241页

作者：苏友禄郭志勋冯娟闫云锋黄剑南中国水产科学研究院南海水产研究所广州510300

用赤点石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因重组蛋白制备成的疫苗,通过腹腔注射免疫军曹鱼稚鱼,实验鱼分为一次免疫组A(A1、A2、A3)和三次免疫组B(B1、B2、B3)及对照组C。结果显示免疫效果与免疫接种的剂量并不是呈线性关系,免疫剂量为50μg... 详细信息

用赤点石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因重组蛋白制备成的疫苗,通过腹腔注射免疫军曹鱼稚鱼,实验鱼分为一次免疫组A(A1、A2、A3)和三次免疫组B(B1、B2、B3)及对照组C。结果显示免疫效果与免疫接种的剂量并不是呈线性关系,免疫剂量为50μg的B2组免疫效果明显好过10μg或100μg的B3组。免疫组死亡率和发病率均比对照组低,其中A2、B2组的相对存活率和相对保护率分别为31%、28%和54%、56%。B2组和对照组的累计死亡率和发病率呈现极显著差异,分别为P<0.01和P<0.04。免疫组间比较,三次免疫组死亡率和发病率均比一次免疫组低。在对存活下来的鱼进行RT-PCR检测,免疫组的阳性率只有60%或80%,而对照组的则高达100%。可见,此重组疫苗对军曹鱼有显著的免疫保护效应,可作为预防神经坏死病毒感染的疫苗。

关键词：神经坏死病毒重组疫苗军曹鱼稚鱼免疫保护力

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谷氨酰胺对斜带石斑鱼GF-1细胞中C-Myc蛋白的表达与神经坏死病毒复制的影响

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水产学报 2020年第9期44卷 1385-1396页

作者：沈海洋卢志杰秦真东赵丽娟李亚男刘春杨光叶成凯潘淦林蠡华南师范大学生命科学学院广东省水产健康安全养殖重点实验室仲恺农业工程学院动物科技学院广东省水环境与水产品安全工程技术研究中心广州市水产病害与水禽养殖重点实验室

为探讨C-Myc表达、谷氨酰胺代谢和神经坏死病毒复制三者之间的关系,本研究首先克隆了斜带石斑鱼鳍条细胞(GF-1)中的C-Myc基因(GF-1-C-Myc),结果显示GF-1-CMyc基因cDNA全长814 bp,开放阅读框(ORF)为285 bp,编码95个氨基酸(aa),有亮氨酸... 详细信息

为探讨C-Myc表达、谷氨酰胺代谢和神经坏死病毒复制三者之间的关系,本研究首先克隆了斜带石斑鱼鳍条细胞(GF-1)中的C-Myc基因(GF-1-C-Myc),结果显示GF-1-CMyc基因cDNA全长814 bp,开放阅读框(ORF)为285 bp,编码95个氨基酸(aa),有亮氨酸拉链结构域与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域。实验表达和纯化了GF-1-C-Myc蛋白,并制备其多克隆抗体。采用实时定量PCR技术(qRT-PCR)与免疫印迹法(WB)检测了GF-1-C-Myc基因的表达和神经坏死病毒的复制。结果显示,缺乏谷氨酰胺会同时抑制GF-1-C-Myc基因的表达和神经坏死病毒(NNV)的复制,添加谷氨酰胺可同时促进GF-1-C-Myc的表达和NNV的复制;此外,NNV感染可上调GF-1-C-Myc基因的表达,并显著消耗GF-1细胞培养液中的谷氨酰胺。研究表明,GF-1-C-Myc基因可调控宿主谷氨酰胺代谢,从而有利于神经坏死病毒的复制。本结果为防控NNV的感染提供了参考。

关键词：斜带石斑鱼 C-Myc基因 GF-1细胞神经坏死病毒感染谷氨酰胺

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神经坏死病毒对卵形鲳鲹的致病性及外壳蛋白基因序列分析

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上海海洋大学学报 2010年第4期19卷 482-488页

作者：许海东区又君郭志勋苏友禄王瑞旋中国水产科学研究院南海水产研究所广东广州510300 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

2008年5月,湛江市某网箱养殖场的卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)幼鱼发生大规模死亡,调查发现病鱼呈现体色发黑、反应迟钝、呈螺旋状或旋转游动等典型的病毒性神经坏死症症状,在鱼体没有发现寄生虫或细菌感染,PCR检测发现病鱼感染了鱼类... 详细信息

2008年5月,湛江市某网箱养殖场的卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)幼鱼发生大规模死亡,调查发现病鱼呈现体色发黑、反应迟钝、呈螺旋状或旋转游动等典型的病毒性神经坏死症症状,在鱼体没有发现寄生虫或细菌感染,PCR检测发现病鱼感染了鱼类神经坏死病毒(NNV)。利用已经发表的NNV核酸序列设计引物,克隆外壳蛋白基因并测序,根据同源性比较和系统进化分析,该病毒与斜带石斑神经坏死病毒(ECNNV)碱基相似率达99.2%,属于赤点石斑鱼神经坏死病毒基因型(RGNNV)。同时进行人工感染试验,采用4种方法感染该病毒,累计死亡率均达100%,并对感染样品进行克隆测序鉴定,证明导致此次湛江卵形鲳鲹大规模死亡的病原为神经坏死病毒。

关键词：卵形鲳鲹神经坏死病毒序列分析

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神经坏死病毒反向遗传系统构建及病毒改造

神经坏死病毒反向遗传系统构建及病毒改造

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作者：熊羽华中农业大学

学位级别：硕士

神经坏死病毒（nervous necrosis virus,NNV）属于Betanodavirus病毒属,引起鱼类的病毒性神经坏死（viral nervous necrosis,VNN）,主要侵蚀鱼类的中枢神经系统,使受感染部位出现细胞空泡化病变。神经坏死病毒在全球范围内造成了幼鱼和... 详细信息

神经坏死病毒（nervous necrosis virus,NNV）属于Betanodavirus病毒属,引起鱼类的病毒性神经坏死（viral nervous necrosis,VNN）,主要侵蚀鱼类的中枢神经系统,使受感染部位出现细胞空泡化病变。神经坏死病毒在全球范围内造成了幼鱼和成年鱼类的高致病率和高死亡率,极大地影响了海水以及淡水水产养殖业的发展。NNV为无包膜的单链正义双节段RNA病毒,包含基因组RNA1和RNA2以及转录产生的亚基因组RNA3分别编码RNA依赖的RNA聚合酶、衣壳蛋白以及B2蛋白。目前市场上针对神经坏死病毒感染多以预防为主,在水平以及垂直层面进行消毒控制病毒传播和感染,而针对神经坏死病毒的疫苗的研究较少,且主要以灭活疫苗以及衣壳蛋白等构建的亚单位疫苗为主,存在着保护力不够、使用需伴有佐剂等弊端。因此本课题拟对神经坏死病毒进行减毒改造,为后续疫苗的研究提供一种新思路。1、首先构建了一套反向遗传操作系统用于神经坏死病毒的体外拯救,以便于后续的遗传操作实验。本实验基于三套不同启动子策略的NNV包装质粒,摸索了四种不同的拯救方案（T7原核启动子转染B7GG细胞并与SSN-1细胞共培养、CMV真核启动子转染293T细胞、T7原核与CMV真核双启动子转染293T与B7GG混合培养细胞、T7原核启动子转染B7GG细胞）,最终成功建立了一套适合于神经坏死病毒的拯救系统（T7原核启动子转染B7GG细胞）。2、利用建立的反向遗传操作系统对神经坏死病毒B2蛋白进行突变构建NNV病毒致弱毒株,并体外拯救出神经坏死病毒B2蛋白突变株病毒。对B2蛋白突变株病毒进行了病毒增殖曲线的测定,拯救的未突变病毒以及B2蛋白突变株病毒的增殖速度相比于NNV野生毒株更为缓慢,但病毒增殖能力有所降低;在对细胞毒性蛋白Endo-G和抗病毒通路相关蛋白Mx1的荧光定量检测中,拯救的未突变病毒和B2蛋白突变株病毒引起的两种蛋白表达均远低于野生毒株。同时在B2蛋白突变株病毒感染斑马鱼在体实验中,B2蛋白突变株病毒引起的C反应蛋白以及肿瘤坏死因子的表达水平较野生毒株相比降低,同时在转基因斑马鱼在体注射实验中,脑部空洞化病变程度减弱。因此,构建的NNV病毒B2蛋白突变株毒力减弱,有助于后续基于B2蛋白突变株病毒的基因工程疫苗开发。3、另外,根据神经坏死病毒对神经系统的高度嗜性,对病毒的RNA1区段进行改造,在3’端添加了具有神经环路标记功能的标签,以此来尝试将神经坏死病毒开发成鱼类的神经环路示踪病毒。在RNA1区段的3’端使用蛋白linker（GGGGS）添加e GFP的C端短肽（E11）,利用反向遗传操作系统进行病毒体外拯救后,SSN-1敏感系细胞的感染实验、RT-PCR检测以及带有e GFP的N端（G1-10）转基因斑马鱼在体实验均无法检测到病毒。再次使用更加短小的HA标签和首尾不同位置以及不同连接序列的尝试,最终在使用2倍蛋白linker和F2A将HA标签连接在神经坏死病毒的3’尾端两种改造方式中,通过RT-PCR可以检测到病毒RNA依赖的RNA聚合酶的表达,以及细胞免疫荧光实验可以检测到HA标签的表达,同时在转基因斑马鱼在体注射实验中同样可以检测到NNV病毒的存在。综上,我们建立了体外拯救神经坏死病毒的方法,并且成功构建出B2蛋白突变株病毒,一定程度上降低了对宿主的毒性作用;另外确定了使用2倍蛋白linker和F2A在病毒基因组上添加HA短肽的方法,为NNV病毒作为神经环路示踪的研究提供了可能。由于病毒基因组的局限性和拯救系统的不完善,在病毒的拯救效率和增殖能力上与野生毒株相比有一定差距,因此还需进一步的摸索和优化。

关键词：神经坏死病毒反向遗传操作系统 B2蛋白基因工程疫苗环路示踪

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石斑鱼PPAR-δ基因SNP位点和单倍型与抗虹彩病毒和神经坏死病毒抗性的关联

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华南农业大学学报 2023年第3期44卷 391-401页

作者：黄健玲杨子敏王雨欣李鑫帅刘翠瑜陈锦鹏秦启伟杨敏海洋生物资源保护与利用粤港澳高校联合实验室/华南农业大学海洋学院广东广州510642

[目的]获得石斑鱼Epinephelus spp.抗病分子标记,选育石斑鱼抗病品系以解决石斑鱼病害频发的问题。[方法]基于免疫基因PPAR-δ的基因组DNA序列开展单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点筛选,并对这些位点分别进行石... 详细信息

[目的]获得石斑鱼Epinephelus spp.抗病分子标记,选育石斑鱼抗病品系以解决石斑鱼病害频发的问题。[方法]基于免疫基因PPAR-δ的基因组DNA序列开展单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点筛选,并对这些位点分别进行石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)和神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV)抗性的关联分析。[结果]在SGIV感染的易感组和抗感组样品中共筛查到9个SNP位点,均位于内含子中;多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)的范围为0.177~0.375,其中,SNP-S1(g.940T>A)属于低度多态(PIC<0.25),其余SNP位点属于中度多态(0.25≤PIC<0.50);关联分析结果显示,SNP-S7(g.4595T>A)基因型频率在SGIV易感组和抗感组中存在显著差异分布(P<0.05),SNP-S7的TT和AA这2种纯合子基因型与SGIV抗感性状相关,而AT杂合子基因型与SGIV易感性相关。在RGNNV感染的易感组和抗感组样品中共筛查到8个SNP位点,其中,SNP-N1位于外显子中,属于同义突变,其余SNP均位于内含子中;PIC的范围为0.106~0.317,其中,SNP-N1(g.324G>A)和SNPN2(g.883A>G)属于低度多态(PIC<0.25),其余SNP属于中度多态(0.25≤PIC<0.50);关联分析表明,SNPN5(g.2510C>T)基因型频率在RGNNV易感组和抗感组中存在显著差异分布(P<0.05),SNP-N5的CT基因型与RGNNV抗感性状相关, CC基因型与RGNNV易感性状相关。[结论]本研究在PPAR-δ的基因组DNA序列中分别筛选到与SGIV和RGNNV抗性相关的SNP标记各1个,可以为石斑鱼抗病育种提供技术支持和理论依据。

关键词：石斑鱼虹彩病毒神经坏死病毒 SNP PPAR-δ基因

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神经坏死病毒调控石斑鱼基因表现之研究

神经坏死病毒调控石斑鱼基因表现之研究

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作者：李昱锜国立台湾大学

学位级别：硕士

当病毒侵入宿主后，会利用各种机制去改变宿主基因的表现，造成宿主的某些基因表现量上升或下降，以利病毒在宿主体内繁殖；反之，宿主亦会表现许多基因对抗病毒的侵袭。近年来，由于神经坏死病毒(nervous necrosis virus, NNV)所引发... 详细信息

当病毒侵入宿主后，会利用各种机制去改变宿主基因的表现，造成宿主的某些基因表现量上升或下降，以利病毒在宿主体内繁殖；反之，宿主亦会表现许多基因对抗病毒的侵袭。近年来，由于神经坏死病毒(nervous necrosis virus, NNV)所引发病毒性神经坏死症(viral nervous necrosis disease, VNN disease)对养殖业造成重大损失。以石斑鱼而言，神经坏死病毒造成白身幼苗前高致死率，而此病毒主要感染石斑鱼的神经组织如脑、脊髓和视网膜，并呈现空泡化。为了研究病毒感染白身石斑鱼苗基因表现的变化量，首先建立石斑鱼之噬菌体 cDNA基因库（λ phage cDNA library），转换为质体载体后，挑选6000个选殖株用来构筑基因微阵列晶片（microarray chip）。另外以NNV病毒颗粒、免疫刺激物lipopolysaccharide（LPS）和 poly inosinic:cytidylic 【poly (I:C)】，分别注射白身点带石斑，每天萃取total RNA一共五天，制备杂合探针，借由微阵列分析这些基因在不同刺激物及不同天数之表现变化来筛选受到调控之表现基因。本实验分析NNV感染石斑鱼苗后至少一天具有2倍差异性表现基因，属于促进（up- regulated）表现有361个，而抑制（down-regulated）表现有747个，比LPS注射后（140和359个）或poly(I:C) 注射后（305和452个）的基因数目还多，表示当病毒侵袭，的确会引发较多基因受到病毒调控或是宿主本身表现以对抗病毒感染。将促进表现差异大于2倍和抑制表现大于2.5倍之基因进行序列定序，再利用NCBI 资料库比对分析。扣除重复总共分析出83个NNV病毒感染后具有差异性表现基因，其中52个基因属于促进表现，31个基因属于抑制表现。这些差异性表现的基因群包括：转录，转译，免疫，结构蛋白，蛋白质降解，代谢，运送，连结蛋白（adhesion protein），生合成，紧迫（stress protein），钙离子结合，催化，蛋白酶，细胞周期以及能量合成等。这些分析提供NNV病毒感染石斑鱼苗分子层次的调控表现。

关键词：神经坏死病毒点带石斑

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神经坏死病毒CNPgg2108株的分离鉴定及其单克隆抗体的制备

神经坏死病毒CNPgg2108株的分离鉴定及其单克隆抗体的制备

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作者：张志琪中国海洋大学

学位级别：硕士

神经坏死病毒(nervousnecrosisvirus，NNV)是一种世界范围内流行、严重危害多种海水和淡水鱼类的病原。本文从山东省烟台市某养殖场的患病珍珠龙胆石斑鱼（Epinepheluslanceolatus♂×***♀）幼鱼体内分离获得了一株NNVCNPgg2018株... 详细信息

神经坏死病毒(nervousnecrosisvirus，NNV)是一种世界范围内流行、严重危害多种海水和淡水鱼类的病原。本文从山东省烟台市某养殖场的患病珍珠龙胆石斑鱼（Epinepheluslanceolatus♂×***♀）幼鱼体内分离获得了一株NNVCNPgg2018株，运用组织病理检查，透射电镜（TEM）观察，逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测，系统进化分析等方法对其进行了鉴定，并通过回归感染实验分析了CNPgg2108株的毒力特性。人工合成偶联血蓝蛋白（KLH）的NNV衣壳蛋白多肽，以其为免疫原，运用杂交瘤技术筛选出一株可稳定分泌抗NNV单克隆抗体的杂交瘤细胞株NNV-CP-3D11，并通过体内诱生法，获得了大量抗NNV的单克隆抗体3D11。本文为后续建立NNV的快速检测方法、深入探讨NNV感染的分子机制提供了一定的理论基础。具体研究内容与结果如下：　　1、神经坏死病毒CNPgg2018株的分离与鉴定：从山东省烟台市某养殖场采集到患病珍珠龙胆石斑鱼幼鱼，通过组织病理检查、TEM观察、RT-PCR检测、细胞分离培养、全基因组扩增、系统发育分析等，分离获得一株病毒，并对其进行鉴定。结果显示，患病石斑鱼视网膜及脑组织中存在大量空泡化病变。TEM观察发现，患病幼鱼视网膜和浓缩的病毒液中均存在大量直径25nm左右，呈二十面体的病毒粒子。RT-PCR结果显示，仅使用针对NNV的特异性引物可扩增出大小约255bp的特异性条带，经BLAST比对分析，扩增产物与GenBank中公布的多株NNVRNA2基因有极高相似性。接种组织匀浆液后，SSN-1和GB细胞出现了典型的细胞病变效应（CPE）。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）图谱显示，该病毒有明显的2条蛋白带。克隆获得其RNA1与RNA2序列，基于RNA2的系统进化树结果表明，该毒株与15株已报道的NNV聚为一支，均属于石斑鱼神经坏死病毒型（RGNNV）。综合实验结果可以确认该病毒为一株基因型为RGNNV型的神经坏死病毒，并将其命名为CNPgg2018株。　　2、抗神经坏死病毒单克隆抗体的制备及特性分析：根据CNPgg2018衣壳蛋白氨基酸序列，利用生物信息学软件分析二级结构，预测B细胞线性表位，构建三级模型，筛选到理想肽段序列并送至生物公司合成。用偶联KLH的NNV衣壳蛋白多肽免疫Balb/C小鼠，采用杂交瘤技术和体外诱生法制备单克隆抗体。通过间接酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫印记实验（Westernblotting）、间接免疫荧光实验（IFAT）和免疫组织化学（IHC）等技术对抗体特性进行分析。结果表明，经筛选和克隆后，获得1株稳定分泌抗NNV单克隆抗体的杂交瘤细胞株NNV-CP-3D11，体外诱生后，获得了大量抗NNV的单克隆抗体3D11。ELISA结果显示，单抗3D11可与偶联KLH的NNV衣壳蛋白多肽和浓缩的病毒液均发生特异性反应。Westernblotting结果显示，单抗3D11可特异性识别NNV衣壳蛋白天然蛋白。IFAT结果显示，单抗3D11可与NNV感染48h后的部分SSN-1细胞发生反应，产生较强的绿色荧光信号，且荧光信号主要分布于细胞质中。IHC结果显示，单抗3D11可特异性识别感染组织中的NNV。综上所述，获得了一株稳定分泌抗NNV单克隆抗体的杂交瘤细胞株NNV-CP-3D11和大量抗NNV的单克隆抗体3D11。

关键词：鱼病学神经坏死病毒单克隆抗体体外诱生法

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石斑鱼神经坏死病毒RNA干扰的转染条件优化与效果分析

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华南农业大学学报 2011年第2期32卷 93-98页

作者：黄桂菊喻达辉柳明潘俐玲王晓宁曾令兵龙华农业部海水养殖生态与质量控制重点开放实验室中国水产科学研究院南海水产研究所广东广州510300 农业部淡水鱼类种质资源与生物技术重点开放实验室中国水产科学研究院淡水生态与健康养殖重点开放实验室中国水产科学研究院长江水产研究所湖北荆州434000

克隆了石斑鱼神经坏死病毒（Nervous necrosis virus,NNV）的衣壳蛋白（Major capsid protein,MCP）基因序列并构建了绿色荧光蛋白（EGFP）基因与MCP基因的融合真核表达载体pEGFP-MCP,设计了3对针对MCP基因序列的小片段干扰性RNA（Small... 详细信息

克隆了石斑鱼神经坏死病毒（Nervous necrosis virus,NNV）的衣壳蛋白（Major capsid protein,MCP）基因序列并构建了绿色荧光蛋白（EGFP）基因与MCP基因的融合真核表达载体pEGFP-MCP,设计了3对针对MCP基因序列的小片段干扰性RNA（Small interfering RNA,siRNA）序列（NNV-001、NNV-002、NNV-003）,开展了转染方法、转染剂量与转染效果的研究,用脂质体转染法将pEGFP-MCP和不同剂量的siRNA共转染导入黑头呆鱼肌肉（FHM）细胞.结果表明,用无血清培养基转染、4-6 h后换液的转染方法,比不换液、只将转染混合物代替同体积培养基的转染方法效率高;当质粒的转染量为50、70、100和150 ng时,100 ng的转染量为最合适;在pEGFP-MCP与siRNA共转染组,3对siRNA序列都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中NNV-002效果最好.当siRNA终浓度为200 nmol/L时,显示出了较好的沉默效果.

关键词：石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因 RNA干扰

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斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因shRNA干扰载体的构建及效果评价

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水产学报 2012年第3期36卷 343-349页

作者：黄桂菊陈健光喻达辉曾令兵龙华中国水产科学研究院南海水产研究所农业部海水养殖生态与质量控制重点开放实验室中国水产科学研究院长江水产研究所农业部淡水鱼类种质资源与生物技术重点开放实验室中国水产科学研究院长江水产研究所淡水生态与健康养殖重点开放实验室

利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)]。化学合成这些序列,并退火连接为双链干... 详细信息

利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)]。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA-124、pshRNA-896和pshRNA-NNV。然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-time RT-PCR检测CP基因mRNA的表达水平变化。结果表明,在pEGFP-CP与shRNA干扰载体共转染组,pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV的荧光抑制效率分别为47%、68%、51%。3种shRNA干扰载体都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中pshRNA-896干扰效率最好。Real-time RT-PCR检测表明,干扰质粒pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV对pEGFP-CP基因的沉默效率分别约为60%、96%和55%,与对照组相比差异显著(P<0.05)。研究表明,靶向斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因的shRNA干扰载体构建成功,为进一步运用RNA干扰技术进行CP基因的功能研究奠定了基础。

关键词：斜带石斑鱼神经坏死病毒 CP基因 shRNA干扰载体

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