检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：袁青山东大学

学位级别：博士

该实验室十多年来也在高温致NTD方面作了大量的研究,建立了高温致金黄地鼠NTD的动物模型,并在此基础上利用免疫组化、免疫电镜、原位杂交、图象分析等技术研究了高温致NTD的形态发生机理和组织化学、细胞化学方面的一些变化.在此基础上... 详细信息

该实验室十多年来也在高温致NTD方面作了大量的研究,建立了高温致金黄地鼠NTD的动物模型,并在此基础上利用免疫组化、免疫电镜、原位杂交、图象分析等技术研究了高温致NTD的形态发生机理和组织化学、细胞化学方面的一些变化.在此基础上,该实验研究了高温致畸中热休克蛋白的表达状况,筛选和克隆了与高温致NTD密切相关的基础.结果表明：***70在高温致NTD中有明显的应激性表达,这种应激性表达对胚胎细胞有保护作用,但这种保护作用只能维持胚胎存活而不能避免畸形的发生.2.高温致NTD的发生是一个多基因参与的复杂过程,在这个过程中,某些基因表现为特异性不表达或下调表达,而某些基因则表现为特异性表达或上调表达.特异性不表达或下调表达的基因远多于特异表达或上调表达的基因.N32片段所在基因可能编码金黄地鼠SAP155,而SAP155是mRNA前体剪接过程的必需因子之一,它的低表达会影响多种蛋白质的mRNA前体剪接,造成相应蛋白合成减少或产生异常蛋白,从而导致NTD的发生.

关键词：神经管畸形热休克蛋白 mRNA差异显示剪接体协同蛋白155 剪接因子3b1基因应激性表达

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人类多能干细胞在神经管畸形发生及预防机制研究中的应用

人类多能干细胞在神经管畸形发生及预防机制研究中的应用

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作者：姚琳第二军医大学

学位级别：博士

研究背景神经管畸形（neural tube defects， NTDs）是最常见、最严重的出生缺陷之一。NTDs的发生是由于囊胚期神经管闭合异常所导致的神经管开放。在世界范围内，其发生率仅次于先天性心脏病，而我国的发生率为全世界最高。除致死性NTD... 详细信息

研究背景神经管畸形（neural tube defects， NTDs）是最常见、最严重的出生缺陷之一。NTDs的发生是由于囊胚期神经管闭合异常所导致的神经管开放。在世界范围内，其发生率仅次于先天性心脏病，而我国的发生率为全世界最高。除致死性NTDs外，轻型闭合型NTDs不仅将给患儿带来伴随终生的先天残疾及严重的心理缺陷，也会给患儿家庭及社会带来沉重的经济负担。随着孕期叶酸（folic acid，FA）补充的推广，NTDs的流行趋势明显下降，但大规模的研究证实使用FA补充剂后仍有30-50%的NTDs无法预防。另外过量补充FA还可能引起包括新生儿胰岛素抵抗或肥胖在内的一系列非治疗作用，因此FA补充是否应当成为强制饮食添加剂，何种剂量为适宜补充剂量，在国际上引起了广泛的争议。除叶酸缺乏外，一线抗癫痫药物丙戊酸（Valproic acid，VPA）的应用也是NTDs的诱因之一。对小鼠模型的研究提示，VPA可能通过FA代谢途径导致NTDs，并且给予FA补充可能在一定程度上起到保护作用，从而避免NTDs发生。反对使用VPA的学者强调其致畸性对胎儿的严重影响，但是对于部分常见癫痫类型VPA仍然是无法替代的最佳选择。因此很难在妊娠前期或妊娠期更换其他药物，这使VPA在妊娠期的使用陷入进退两难的境地。神经管闭合这一过程始于胚胎第20天，且是贯续发生的发育过程，这使以往的观察研究遇到了很大的困难。同时由于研究对象的特殊性，特别是人类研究存在的伦理问题，使我们无法直接对人类胚胎进行在体实验。此外由于胚胎发育的不可逆性，我们亦无法获知神经管畸形的发生的真实过程，只能通过回顾性分析获得间接的证据。这就使动物模型中获得的信息无法在人类中获得验证。因此如何建立一个人类的NTDs体外研究模型，成为亟待解决的问题。本研究探索利用胚胎干细胞（ES cell）和体细胞来源的诱导多能性干细胞（iPScell）,结合体外神经系定向诱导分化技术，建立人类干细胞来源神经管研究模型。尝试通过不同组别的药物作用实验，了解FA及VPA对神经管形成及神经系发育的作用。同时在此基础上进行药物浓度筛选的初步应用研究，为在人类系统中验证动物模型中所获理论创造条件。第一部分人类多能干细胞来源神经管体外模型建立方法：对人类多能干细胞系H1；H9；iPS4进行培养传代。同时进行神经系分化：去除bFGF，悬浮培养细胞，诱导EB形成；利用神经上皮干细胞（NSC）培养基对EB进行贴壁培养，诱导玫瑰花环样神经管结构（RS）形成,利用NSC标记物进行免疫荧光染色鉴定；利用定向诱导分化技术进行进一步分化：缺省分化大脑皮质大椎体细胞；腹侧尾侧化脊髓前脚运动神经元；神经胶质细胞系定向诱导分化；神经脊系细胞定向诱导分化；对分化获得细胞进行特异性标记物免疫荧光染色鉴定。结果：人类多能干细胞系体外培养传代后仍表达多能转录因子Oct4, Nanog；H1；H9；iPS4均能形成EB；三系均能在诱导条件下形成RS结构，且Pax6，Nestin阳性；定向诱导分化：获得前脑皮质大椎体细胞，Pax6阳性；获得人γ-氨基丁酸能神经元，GABA阳性；获得多巴胺能神经元，TH阳性；获得脊髓前脚运动神经元,ChAT阳性；获得星形胶质细胞，GFAP，S100阳性；获得神经脊细胞，P75，Sox10，SMA阳性。结论：利用三个人类多能干细胞系，通过定向诱导分化，我们首次提出建立人类干细胞来源神经管样结构模型。此模型可以在发育时间，细胞构成，分化潜能上模拟在体神经管的发育过程。它的建立为后续药物浓度筛选提供了条件，为NTDs发生及预防机制研究奠定了基础。第二部分叶酸缺乏及补充对神经管结构形成及神经发育的影响方法：利用第一部分中建立的人类多能干细胞体外神经管分化模型，选择iPS4作为研究对象，使用无FA的PRIM1640培养基作为空白对照组，根据FA梯度分组：0.02uM组，0.2uM组，2uM组，20uM组，80uM组，160uM组。在无FA的PRIM1640培养基中加入相应浓度FA，对iPS4细胞进行分化。分化过程中比较不同FA分组的：EB形成情况；EB中多能标记物Oct4，Nanog和Sox2的mRNA及蛋白质表达水平；RS形成情况；RS中NSCs标记物Pax6及Nestin的mRNA及蛋白质表达水平；远期神经分化率差别；神经胶质细胞分化率差别；神经脊细胞分化率差别。结果：FA缺乏组（0-2uM）：人类诱导多能干细胞分化EB形成率降低（P＜0.05），多能因子表达量下降；RS形成明显减少（P＜0.05）,结构紊乱；NSCs标记物Pax6，Nestin的mRNA，蛋白质表达下调；远期神经元，神经脊分化率呈剂量依赖

关键词：人类多能干细胞 iPS ES 神经管畸形叶酸丙戌酸

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胎儿神经管畸形组织病理学、细胞遗传学、相关基因及神经管畸形再发干预研究

胎儿神经管畸形组织病理学、细胞遗传学、相关基因及神经管畸形再...

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作者：赵晓岚西安交通大学

学位级别：博士

目的研究NTDs胎儿组织病理学和超微病理学改变、细胞遗传学的染色体改变及分子遗传学的基因表达改变,通过增补叶酸干预实验,为探讨NTDs的分子发病机制、对NTDs的早期诊断和防治提供基础资料和方法.方法收集临床确诊为NTDs胎儿和家系资料... 详细信息

目的研究NTDs胎儿组织病理学和超微病理学改变、细胞遗传学的染色体改变及分子遗传学的基因表达改变,通过增补叶酸干预实验,为探讨NTDs的分子发病机制、对NTDs的早期诊断和防治提供基础资料和方法.方法收集临床确诊为NTDs胎儿和家系资料,直接从NTDs胎儿本身入手.对NTDs胎儿的活检标本进行HE染色,光镜和电子显微镜观察.采集胎儿和父母的静脉血,进行淋巴细胞培养,染色体显带和核型分析.提取胎儿脑组织细胞总RNA,利用人类cDNA表达谱芯片技术,筛查胎儿脑组织基因表达状况.通过增补叶酸的方法,对有NTDs妊娠史和分娩史的妇女229例实行了干预研究.结论1.组织病理学和超微病理发现,NTDs胎儿在脑和脊髓以及重要脏器如肝、肾等发育有异常,主要表现在发育滞后和某些成分的缺如.2.发现两例无脑胎儿有染色体异常改变,一例为21三体,另一例为二倍体和四倍体嵌合体,表明NTDs与染色体异常有关.***胎儿脑组织cDNA基因表达谱芯片显示有11条上调,22条下调,表明有多个不同类型基因参与.4.叶酸干预试验证明,证实小剂量叶酸有预防NTDs再发作用.

关键词：神经管畸形组织病理学细胞遗传学基因表达谱芯片叶酸干预

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PARD3基因单核苷酸多态性和拷贝数变异与神经管畸形发生的相关性研究

PARD3基因单核苷酸多态性和拷贝数变异与神经管畸形发生的相关性...

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作者：高永辉北京协和医学院

学位级别：博士

研究背景在我国,随着传染性疾病的发病与死亡率显著降低,出生缺陷和遗传病已成为显著问题。神经管畸形(neural tube defects, NTDs)是一种严重的出生缺陷疾病,指在胚胎早期发育过程中神经管闭合不全而导致的神经系统畸形。目前,全世界N... 详细信息

研究背景在我国,随着传染性疾病的发病与死亡率显著降低,出生缺陷和遗传病已成为显著问题。神经管畸形(neural tube defects, NTDs)是一种严重的出生缺陷疾病,指在胚胎早期发育过程中神经管闭合不全而导致的神经系统畸形。目前,全世界NTDs的发病率约为1-2%o。我国是NTDs高发地区,最新统计,NTDs在我国山西省部分地区发病率高达19.94%o,因此,NTDs仍然是影响我国人口素质、危害生命和生活质量的重要公共卫生问题。NTDs是多因素导致的复杂疾病,目前的研究认为NTDs是遗传和环境因素共同作用的结果。叶酸等环境因素在NTDs发生中的作用已引起广泛重视。但是,其遗传机制仍不明确。大量的研究表明,细胞极性的建立过程与NTDs的发生密切相关,其中顶-基底极性蛋白复合体PARD3-PAR6-aPKC具有重要作用,尤其是其核心组分PARD3的作用不容忽视。近期的研究表明PARD3在斑马鱼初级神经胚形成中具有关键作用,它的极性分布对于发育过程中的非对称性分裂,神经细胞轴突的形成和上皮细胞紧密连接的建立是必需的。PARD3缺失导致分裂的神经管上皮细胞不能穿过中线,镜像对称分布失败,异常神经管形成。另外有研究表明PARD3减少导致出现脑水肿,脑脊髓液流动异常等人类NTDs的伴随症状。随着对极性蛋白PARD3在斑马鱼等脊椎动物神经胚形成过程中的作用研究不断深入,PARD3在人类神经胚形成中的作用引起越来越多研究者的重视。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)和拷贝数变异(copy number variation, CNV)是基因组多态性的两种重要形式,它们在人类表型多样性以及人类对疾病的易感性方面具有重要作用。大量的研究显示人类基因组中的SNP和CNV与一些出生缺陷疾病相关。而目前PARD3基因SNP和CNV的研究仅局限于肿瘤和炎症。因此,探讨PARD3基因SNP和CNV与NTDs发生的相关性有可能为NTDs的发病机制研究提供新的线索。目的 1.探讨PARD3基因SNP与中国山西省出生缺陷高发区NTDs发生的相关性。 2.检测PARD3基因全部外显子区CNV情况,探讨PARD3基因外显子区CNV在中国山西省出生缺陷高发区NTDs发生中的作用。方法 1.采用病例对照研究,收集我国山西省出生缺陷高发区NTDs标本224例,对照组为非病理性终止妊娠的正常标本253例。提取脊髓组织DNA,利用MassARRAY分子量阵列分析平台中的iPLEX Gold SNP Genotyping系统,检测PARD3基因上53个SNP位点的基因分型,用SPSS软件和SHEsis软件分析这53个SNP位点及相应单体型与中国山西省出生缺陷高发区NTDs发生的相关性。 2.采用病例对照研究,收集我国山西省NTDs标本168例,对照组为非病理性终止妊娠的正常标本231例。提取脊髓组织DNA,改进MassARRAY分子量阵列分析平台中的iPLEX Gold SNP Genotyping系统,分析PARD3基因上25个外显子的拷贝数,用real-time PCR和普通PCR后常规测序的方法对部分结果进行验证。对有缺失的标本进行组织特异性检测,并初步分析其对PARD3蛋白功能的影响。结果 1.共挑选了PARD3基因上53个SNP进行检测,去掉分型成功率低于90%的2个位点,不符合Hardy-Weinberg平衡的2个位点和微效等位基因频率小于5%的2个位点,共对47个SNP进行了病例-对照关联分析。结果显示,有6个SNP位点(rs2496720, rs2252655, rs3851068, rs118153230, rs10827337and rs12218196)的MAF在病例和对照组有明显差别(P<0.05),这种差别在无脑儿中尤其明显。我们对以上有关联的位点进行了单体型分析,它们共构成了4种常见的单体型,这4种单体型在病例和对照组均有明显差别(P<0.01)。根据表型进行分层分析后显示,有3种单体型(TGTGGT, TACGAC和TACGGT)在无脑儿组和对照组仍然有明显差别(P<0.05)。只有一种单体型(TACGAC)在脊柱裂组和对照组有明显差别(P<0.05),此外,研究还发现"CGTGGT"这种单体型是无脑儿独有的,提示其和无脑儿强烈的相关性。 2.我们对MassARRAY分子量阵列分析平台中的iPLEX Gold SNP Genotyping系统中检测CNV的方法进行了改进,结果表明改进后的方法准确性高,操作简便,适用范围更广。 3.对PARD3基因25个外显子的CNV检测表明,第21和25号外显子病例和对照组均有拷贝数增加,两组无明显差异。第14号外显子病例组有一杂合性缺失,在人类基

关键词： PARD3 神经管畸形单核苷酸多态性拷贝数变异相关性研究

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妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形及其机理的实验研究

妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形及其机理的实验研究

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作者：高青山东大学

学位级别：博士

流行病学调查和动物实验都证明,妊娠糖尿病或孕期持续性高血糖可引起胚胎发育畸形,神经管畸形的发生率最高,但对其发生机理的研究报道甚少,因而对于妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形的发生机理至今尚不很清楚,由发生机理为基础的预防和治疗... 详细信息

流行病学调查和动物实验都证明,妊娠糖尿病或孕期持续性高血糖可引起胚胎发育畸形,神经管畸形的发生率最高,但对其发生机理的研究报道甚少,因而对于妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形的发生机理至今尚不很清楚,由发生机理为基础的预防和治疗方面的研究也受到了极大限制。本文在国家自然科学基金和山东省自然科学基金的支持下,对妊娠糖尿病引起胚胎神经管畸形的发生机理进行了比较深入的研究。实验分为三个部分进行: 第一部分妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形的动物模型的建立:以小鼠为实验动物,用腹腔注射链脲霉素的方法将雌性小鼠制成糖尿病鼠。将雌性糖尿病小鼠与雄性健康小鼠合笼交配,孕11.5天时剖腹取胎,解剖显微镜下检查胚胎神经管畸形的外部表征;经固定、切片、染色后,光镜下检查神经管畸形的内部表征。结果发现,糖尿病孕鼠的胚胎中有16%左右神经管未闭合并出现神经管畸形的外部表征,而正常孕鼠同龄胚胎的神经管几乎全部闭合。第二部分妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形发生机理的在体实验:在成功建立了妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形动物模型的基础上,本部分进行了发生机理的在体实验。神经管是中枢神经系统脑和脊髓的原基,神经组织来自神经管壁上的神经上皮,神经细胞和神经胶质细胞由神经上皮细胞即神经上皮干细胞增殖分化而来。在脑和脊髓的发育过程中,既有神经上皮干细胞的有序增殖,也有神经上皮干细胞的有序凋亡,这种有序的细胞增殖和凋亡不仅受着特定基因时空有序表达的调控,也受着环境因素的影响。神经管发育相关基因的突变或表达异常,环境有害因素的出现,都会引起神经上皮干细胞增殖和凋亡过程的异常变化,从而导致神经管畸形的发生。本实验应用原位末端标记、BrdU标记、DAPI染色等技术方法,检测了糖尿病孕鼠胚胎神经管神经上皮干细胞的增殖和凋亡状况。实验结果显示:糖尿病孕鼠胚胎神经管神经上皮干细胞的增殖数目明显低于正常对照组,差异十分显著(P＜0.01);细胞凋亡数明显高于正常对照组,差异十分显著(P＜0.01)。第三部分妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形发生机理的体外实验:本课题第二部分的在体实验的结果显示,神经上皮干细胞的过度凋亡和增殖受阻是糖尿病致胚胎神经管畸形的重要机制。但是,胚胎神经管的神经上皮干细胞的增殖和凋亡过程受到胚胎和母体内多种因素的影响,高血糖只是其中一个影响因素。为了排除高血糖之外其它因素可能的影响,我们进行了体外实验,利用体外培养神经上皮干细胞的方法,检测高浓度糖这一单一因素对细胞增殖和分化的影响。具体做法是:将神经干细胞分别培养于生理糖培养基和高糖培养基中,为排除高糖培养基所引起的渗透压变化的影响,还设立了与高糖培养基等渗但有效葡萄糖浓度仍为生理糖浓度的对照组。应用BraU标记方法测定了培养细胞的增殖情况,用MTT法检测了培养细胞的代谢和增殖活性,用原位末端标记(TUNEL)方法检测了培养细胞的凋亡情况,用Western blot技术检测了凋亡相关基因Caspase-3的活化情况。实验结果显示:高糖培养下的神经干细胞,与生理糖浓度培养下的神经干细胞相比:①其BrdU阳性细胞数明显减少,差异十分显著(P＜0.01),且排除了渗透压影响的可能性,表明高浓度糖可抑制神经干细胞的增殖;②MTT检测的OD值明显降低,差异十分显著(P＜0.05),且排除了渗透压影响的可能性,表明高浓度糖可降低神经干细胞的代谢和增殖活性;③原位末端标记检测的细胞凋亡数明显增多,差异十分明显(P＜0.01),且排除了渗透压影响的可能性,表明高浓度糖可导致神经干细胞过度凋亡;④Western blot检测到活化的Caspase-3的表达量明显增多,并与作用时间成正相关,表明高浓度糖引起的神经干细胞过度凋亡是通过激活Caspase-3而实现的。综合上述三个部分的实验可以得出如下结论:妊娠糖尿病可引起胚胎神经管畸形,高血糖的这种致畸作用是通过抑制神经上皮干细胞的增殖和代谢、促进神经上皮干细胞的凋亡而实现的。

关键词：妊娠糖尿病神经管畸形发生机理小鼠

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5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因与神经管畸形关系的研究

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因与神经管畸形关系的研究

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作者：朱慧萍北京医科大学

学位级别：博士

该研究利用中美预防神经管畸形合作项目采集的外周血标本,检测MTHFR第677位核苷酸的多态性,查明了中国人MTHFR基因型的构成情况并比较南北方差异;检测NTDs患者和对照的基因型,系统地探讨了MTHFR基因与NTDs的关系,并分析了母亲增补叶酸与... 详细信息

该研究利用中美预防神经管畸形合作项目采集的外周血标本,检测MTHFR第677位核苷酸的多态性,查明了中国人MTHFR基因型的构成情况并比较南北方差异;检测NTDs患者和对照的基因型,系统地探讨了MTHFR基因与NTDs的关系,并分析了母亲增补叶酸与MTHFR基因突变在NTDs病因中的相互关系.经试验得出:MTHFR基因是NTDs遗传易感性因素之一.父亲和母亲的基因在后代NTDs遗传易感性中有同样重要的意义,胎儿的纯合突变与NTDs发生有关.用小剂量叶酸增补剂(0.4毫克/天)不能完全拮抗基因的作用.对于有这种遗传易感性的夫妇,女方应在受孕前后期服用加大剂量的叶酸增补剂.

关键词：神经管畸形叶酸 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶遗传易感性遗传标志物分子流行病学

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高温致金黄地鼠神经管畸形的上调表达基因筛选及其鉴定

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解剖学杂志 2007年第2期30卷 196-199页

作者：杨青高英茂李少玲山东大学医学院组织胚胎学教研室济南250012

目的:筛选高温致金黄地鼠神经管畸形的上调表达基因,探讨其分子生物学机制。方法:通过抑制性消减杂交技术获得消减产物,转化大肠杆菌DH5α,构建高温致金黄地鼠胚胎神经管畸形的消减cDNA文库;联合蓝白斑和菌落PCR方法筛选含插入片段的阳... 详细信息

目的:筛选高温致金黄地鼠神经管畸形的上调表达基因,探讨其分子生物学机制。方法:通过抑制性消减杂交技术获得消减产物,转化大肠杆菌DH5α,构建高温致金黄地鼠胚胎神经管畸形的消减cDNA文库;联合蓝白斑和菌落PCR方法筛选含插入片段的阳性克隆,进行测序和同源性分析,并经Northern杂交技术检测基因的表达。结果:成功构建高温致金黄地鼠胚胎神经管畸形的消减cDNA文库,其中2个克隆插入片段的基因序列与小鼠磷酸甘油酸酯激酶(Pgk-1)同源。Northern杂交证实该基因在高温致畸胚胎神经管的表达较其在同龄正常胚胎神经管明显升高。结论:Pgk-1的上调表达可能与高温致神经管畸形密切相关。

关键词：神经管畸形高温抑制性消减杂交基因金黄地鼠

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培美曲塞诱导神经管畸形动物模型及其机制的研究

培美曲塞诱导神经管畸形动物模型及其机制的研究

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作者：赵婕山西医科大学

学位级别：博士

研究目的：本研究利用抗叶酸代谢药培美曲塞(PMX)对C57BL/6J孕鼠进行药物干预,通过对孕鼠胚胎形态学观察及其他指标的检测,筛选出最佳的给药剂量和时间,建立叶酸代谢障碍的C57BL/6J小鼠胚胎神经管畸形(neural tube defects, NTDs)动物... 详细信息

研究目的：本研究利用抗叶酸代谢药培美曲塞(PMX)对C57BL/6J孕鼠进行药物干预,通过对孕鼠胚胎形态学观察及其他指标的检测,筛选出最佳的给药剂量和时间,建立叶酸代谢障碍的C57BL/6J小鼠胚胎神经管畸形(neural tube defects, NTDs)动物模型；采用微阵列比较基因组杂交技术(aCGH)检测PMX诱导NTDs模型基因组拷贝数变异；应用全基因组表达谱芯片技术检测PMX诱导NTDs模型的基因表达谱,筛选可能的PMX引起NTDs的致病基因；初步探讨PMX对NTDs发生发展的影响及相关发病机制的研究。研究方法：本研究中将7-8周健康雌性C57BL/6J小鼠随机分两组受孕,给药实验组于孕7.5(E7.5)天腹腔注射PMX,摸索适当的给药剂量并建立神经管畸形动物模型,正常对照组按体重注射同等剂量的生理盐水。在孕11.5(E11.5)天,颈椎离断处死实验组和正常对照组孕鼠,取胚胎于在解剖显微镜下观察胚胎神经管畸形的外部特征；经固定、切片、染色后,光镜下观察畸胎情况及神经管形态改变；高效液相色谱法首先测定PMX干预孕鼠的不同时间点的叶酸及代谢产物水平；ELISA方法检测PMX诱导的E7.5天胚胎组织叶酸水平；测定胚胎组织的二氢叶酸还原酶(DHFR)活性；RT-PCR法检测胚胎组织叶酸代谢途径关键酶的基因表达水平。应用高分辨微阵列比较基因组杂交技术检测PMX诱导小鼠NTDs模型基因组拷贝数变异,经过生物信息学UCSC比对并应用RT-PCR分析；应用全基因组表达谱芯片技术高通量筛选出在NTDs小鼠胚胎中异常表达的基因,并对这些差异表达基因进行GO分析,对所筛选出的Ptch1基因、Endog基因进行T-PCR方法进行验证。体外实验检测PMX对小鼠胚胎干细胞氧化应激损伤；应用单细胞凝胶电泳方法检测PMX对小鼠胚胎干细胞的DNA损伤的影响。研究结果： ***具有明显的胚胎致畸性,可导致孕鼠子宫明显充血、淤血,大体外观可见吸收胎、胎鼠发育迟缓及NTDs形态表现,HE染色可见NTDs胎鼠后脑泡未闭合。 2.E7.5天注射PMX后,在4、12小时孕鼠血中叶酸明显高于正常,24、96h接近于正常水平：5-FoTHF变化不大,5-MeTHF,,SAM, SAH四个指标表现不同程度的降低,在24h开始慢慢恢复,但96h仍低于正常水平,具有统计学意义p＜0.05。,同时PMX明显降低实验组的胚胎组织叶酸水平。DHFR活性在4-8小时后降到最低,仅为正常小鼠胚胎组织的15%,随后DHFR的活性开始恢复,但是在PMX注射24小时后,DHFR活性仍然低于正常水平。实验组小鼠胚胎组织结果显示实验组小鼠胚胎组织亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和腺苷酸合酶(TS)的mRNA表达水平低于对照组小鼠胚胎组织(p＜0.05)。 3.应用高分辨微阵列比较基因组杂交技术(Array comparative genomic hybridization, aCGH)对NTDs小鼠胚胎基因组拷贝数变异(Copy numbervariations,CNVs)进行检测,结果显示共筛选出313个拷贝数变异片段,包含101个变异基因。在表达谱中筛选出的差异表达基因共165个,表达上调的基因有96个,表达下调的基因有69个。这些与正常组织表达有差异基因包括代谢相关基因；发育相关基因；信号转导相关基因；转录相关基因；物质转运相关基因；应激相关基因；离子转运相关基因；细胞凋亡相关基因；细胞增殖相关基因；细胞分化相关基因；细胞粘附相关基因；细胞周期相关基因等。其中RT-PCR验证结果与表达谱芯片结果一致(p＜0.05)。 4.单细胞凝胶电泳结果显示PMX对小鼠胚胎干细胞DNA有损伤,并且有剂量依赖性。随着PMX浓度的增加,DNA拖尾越明显；同时造成小鼠胚胎干细胞的氧化应激损伤。结论： ***能成功的诱导C57BL/6J小鼠胚胎NTDs,是一种接近人类的NTDs的动物模型。 2.抗叶酸代谢药PMX可以抑制小鼠叶酸及其相关产物的代谢,NTDs胚胎发生基因组拷贝数变异。 ***1基因的上调和Endog基因表达的下调在PMX致NTDs的发生过程中发挥重要作用,可能是PMX致NTDs发生的候选基因。 4.体外实验中,PMX可以损伤小鼠胚胎干细胞DNA,造成小鼠氧化应激损伤,使胚胎干细胞发生凋亡,最终使神经管不能发生正常闭合,而导致神经管畸形的发生。

关键词：培美曲塞神经管畸形叶酸代谢高效液相色谱 DNA损伤氧化应激

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五子衍宗丸对ATRA诱导的神经管畸形防治作用初探

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中成药 2014年第5期36卷 1054-1056页

作者：樊慧杰柴智解军王永辉周然山西中医学院山西太原030024 山西医科大学山西太原030001

目的初步研究五子衍宗丸对全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)诱导的神经管畸形(neural tube defects,NTDs)的防治作用,并筛选出五子衍宗丸防治NTDs的最佳给药方式。方法 BALB/c雄鼠和雌鼠以1∶2比例合笼,有阴栓者为孕鼠。将11... 详细信息

目的初步研究五子衍宗丸对全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)诱导的神经管畸形(neural tube defects,NTDs)的防治作用,并筛选出五子衍宗丸防治NTDs的最佳给药方式。方法 BALB/c雄鼠和雌鼠以1∶2比例合笼,有阴栓者为孕鼠。将110只孕鼠随机分为正常组、模型组、五子衍宗丸先给组、五子衍宗丸和ATRA同时干预组、五子衍宗丸后给组,后3组又各分为五子衍宗丸高(4.20 g/kg)、中(2.10 g/kg)、低(1.05 g/kg)剂量3个亚组。孕11 d时处死各组孕鼠,解剖取出子宫,显微镜下分离胚胎,光镜鉴定神经管畸形,计算发生率。结果与正常组比较,除五子衍宗丸高剂量先给组的差异无统计学意义(P>0.05),其余各组均有统计学差异(P<0.05)。与模型组比较,五子衍宗丸中、高剂量先给组,五子衍宗丸中、高剂量和ATRA同时干预组神经管畸形发生率显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);但是五子衍宗丸中、高剂量后给组和五子衍宗丸低剂量各组神经管畸形发生率的差异无统计学意义(P>0.05)。分别与五子衍宗丸中、高剂量和ATRA同时干预组比较,五子衍宗丸中、高剂量先给组神经管畸形发生率的差异无统计学意义(P>0.05)。分别与五子衍宗丸中剂量先给、同时给予组比较,五子衍宗丸高剂量先给、同时给予组神经管畸形发生率的差异无统计学意义(P>0.05)。结论五子衍宗丸对ATRA诱导的神经管畸形有防治作用;本实验中4.20 g/kg五子衍宗丸预先给药是防治神经管畸形的最佳给药方式。

关键词：五子衍宗丸神经管畸形肾主生殖

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人类神经管畸形患者携带编码基因TCOF1稀有变异A491G影响核糖体生物合成

人类神经管畸形患者携带编码基因TCOF1稀有变异A491G影响核糖体生...

引用

作者：程海琴山西医科大学

学位级别：硕士

目的:功能性破坏性稀有变异是指某一基因突变可导致该基因功能发生改变,同时它在个人中的发生频率是非常低的。稀有变异在复杂疾病的研究中扮演着重要的角色。神经管畸形是一种多因素多基因的先天性复杂疾病,表现包括无脑儿、脊柱裂、... 详细信息

目的:功能性破坏性稀有变异是指某一基因突变可导致该基因功能发生改变,同时它在个人中的发生频率是非常低的。稀有变异在复杂疾病的研究中扮演着重要的角色。神经管畸形是一种多因素多基因的先天性复杂疾病,表现包括无脑儿、脊柱裂、脑膨出等。Treacle为一种核仁蛋白,参与核糖体DNA的转录、核糖体生物合成。在其编码基因Tcof1基因敲除小鼠模型中发现颅面发育畸形和无脑儿表型。本研究的目的是在人类神经管畸形是否存在功能破坏性TCOF1基因稀有变异。方法:本研究针对来自中国北方人群NTD样本及对照样本胚胎组织提取DNA进行TCOF1的靶向基因组测序。将测序所得的稀有变异与Genome1000、db SNP、NHLBI Exome Sequencing Project(ESP)进行比对,稀有变异进行生物信息学分析,和通过比对稀有变异对氨基酸的影响和稀有变异位点保守性分型进行生化进化特征分析,筛选TCOF1基因突变位点。Origene公司订购TCOF1基因野生型和突变型质粒。通过质粒转染构建细胞模型,观察野生型和突变型TCOF1质粒转染效率,检测野生型和突变型的m RNA水平及Treacle蛋白表达。利用免疫荧光检测野生型和突变型质粒对核仁分裂的影响是否存在差异。利用real-time PCR方法比较野生型和突变型RNA45S5表达变化,用统计软件SPSS16.0分析结果。利用ALLPrep DNA/RNA/Protein Mini试剂盒和考马斯亮蓝方法检测在以DNA为参照下野生型和突变型总蛋白的变化。结果:(1)21.2%人类NTD患者携带TCOF1基因新发稀有变异,2.5%携带错义突变;(2)用统计软件SPSS16.0分析结果TCOF1基因稀有变异富集在NTDs的无脑儿表型;(3)TCOF1基因A491G变异影响其蛋白和m RNA的表达,进而导致核仁分裂现象存在差异;(4)TCOF1 A491G变异影响RNA45S5的合成,从而影响总蛋白的合成。结论:人类NTD患者富集TCOF1基因稀有变异。TCOF1基因稀有变异富集在无脑儿表型。TCOF1 A491G可能是导致NTD合并颅面部畸形的致病突变。

关键词：神经管畸形无脑儿 TCOF1 核糖体生物合成

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