检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：郭倩山西医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨低氧诱导因子在神经管畸形中的作用及其可能的机制。首先使用维甲酸建立神经管畸形(NTDs)动物模型,取NTDs胚胎脑组织进行转录组测序,经过生物信息学分析后得到低氧诱导因子HIF3α与基因BNIP3表达发生变化,所以将其作为本次实... 详细信息

目的:探讨低氧诱导因子在神经管畸形中的作用及其可能的机制。首先使用维甲酸建立神经管畸形(NTDs)动物模型,取NTDs胚胎脑组织进行转录组测序,经过生物信息学分析后得到低氧诱导因子HIF3α与基因BNIP3表达发生变化,所以将其作为本次实验的主要研究靶点。其次,通过使用维甲酸体外干预PC12细胞,在细胞水平探讨靶基因HIF3a与BNIP3以及细胞凋亡之间的相互关系,进而揭示其在神经管畸形发生发展过程中的作用和可能的机制。方法:1.在C57BL/6J小鼠怀孕7.5天(E7.5)时通过灌胃将一定量的维甲酸注入小鼠体内,造成胚胎神经管畸形(NTDs)的模型;造模成功后取E10.5天胚胎脑组织进行转录组测序并分析测序结果,发现在神经管畸形的形成过程中低氧诱导因子HIF1a、HIF3a及相关下游基因BNIP3的表达发生了改变。2.通过实时定量聚合酶链反应Real-time PCR检测胚胎脑组织中HIF1a、HIF3a、BNIP3 mRN A表达情况,即对测序结果进行了验证。3.在细胞水平进一步验证,通过使用不同浓度维甲酸(0μM、20μM、40μM)在体外对PC12细胞干预培养,采用Real-time PCR和Western blotting检测靶基因在细胞中的表达变化;4.为研究靶基因变化与细胞凋亡的关系,使用流式细胞仪分别检测不同浓度维甲酸干预后细胞的凋亡情况、产生活性氧的变化以及细胞线粒体膜电位的变化情况;5.为进一步研究HIF3a和BNIP3以及细胞凋亡机制之间的相互关系,通过使用脂质体将化学合成的siRNA转染进PC12细胞干扰HIF3α的表达,抑制了HIF3α表达后,将细胞分为四组,即正常对照组、维甲酸干预组,HIF3αsiRNA细胞转染组和hif3αsirna细胞转染后再加维甲酸干预组,采用real-timepcr和westernblotting检测分析bnip3的表达变化;6.使用流式细胞仪分别检测四组细胞的凋亡情况;7.对四组细胞进行活化的caspase3染色,在荧光显微镜下观察各组caspase3的激活情况。结果:1.使用21mg/kg剂量的维甲酸,小鼠胚胎神经管畸形造模成功,对照组胚胎整体形态完整,轮廓、体节清晰,体积较大,脑部充盈饱满,畸形组胚胎体积较小,体节不明显,常有脑部发育不足或脑膨出,测序分析得到畸形组低氧诱导因子hif1a表达下降,差异无统计学意义,hif3a、bnip3表达升高,差异有统计学意义;***-timepcr检测结果与测序结果一致,畸形组低氧诱导因子hif1α表达下降,差异无统计学意义,hif3α、bnip3表达升高,差异有统计学意义,推测hif3a、bnip3可能与ntds的有关;3.在细胞水平上,通过real-timepcr和westernblotting的结果分析得到,细胞中hif3α、bnip3随着使用维甲酸剂量的加大表达升高,与体内组织中的实验结果一致。4.流式的细胞分析结果显示,使用维甲酸的剂量越大,细胞凋亡越多,产生的活性氧越多,细胞线粒体膜电位越低,表明维甲酸可能是通过上调靶基因表达诱导细胞凋亡。5.通过脂质体转染sirna进pc12细胞,转染效率一般为70%左右,干扰hif3α的表达抑制了bnip3的表达以及维甲酸诱导的bnip3表达的升高;6.流式结果显示,干扰hif3α的表达抑制了维甲酸诱导的细胞凋亡,由此说明,维甲酸诱导的细胞凋亡是通过hif3α调控bnip3实现的。7.维甲酸能够激活caspase3,干扰hif3α能在一定程度上抑制对caspase3的活化。结论:维甲酸诱导HIF3α、BNIP3表达升高并激活caspase3,HIF3α通过调控BNIP3的表达从而影响细胞凋亡。

关键词：维甲酸神经管畸形 HIF3α BNIP3 细胞凋亡

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PMX诱导神经管畸形及其对神经上皮细胞增殖和凋亡的影响

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神经解剖学杂志 2011年第4期27卷 447-452页

作者：关涛王秀伟官臻王建华王国亮朱智强谢秋牛勃山西医科大学生物化学与分子生物学教研室太原030001 首都儿科研究所北京100020

目的:用培美曲塞(pemetrexed,PMX)建立叶酸缺乏的神经管畸形(neural tube defect,NTD)动物模型,并探讨其对神经上皮细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用不同剂量PMX(5、10、15、17.5、20和30 mg/kg)对C57BL/6孕鼠进行干预,筛选最佳造模剂... 详细信息

目的:用培美曲塞(pemetrexed,PMX)建立叶酸缺乏的神经管畸形(neural tube defect,NTD)动物模型,并探讨其对神经上皮细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用不同剂量PMX(5、10、15、17.5、20和30 mg/kg)对C57BL/6孕鼠进行干预,筛选最佳造模剂量。采用磷酸化组蛋白H3(pH3免疫组化的方法以及TUNEL方法)观察胎鼠神经上皮增殖和凋亡情况。结果:随着PMX剂量的增加,小鼠胚胎的吸收胎和畸形率逐渐增加,其中17.5mg/kg体重组的NTD的发生率最高(30.6%),被筛选为最佳造模剂量。pH3免疫组化和TUNEL结果显示,与正常对照组相比,NTD小鼠胚胎神经上皮细胞增殖减少(P<0.05),凋亡增加(P<0.05)。结论:PMX能诱导NTD的发生,其机制可能是因为PMX阻断了叶酸代谢通路并导致神经上皮细胞的增殖抑制和过度凋亡。

关键词：培美曲塞神经管畸形细胞增殖细胞凋亡小鼠

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叶酸缺乏致神经管畸形易感基因双链断裂的表观特征及新易感基因筛选

叶酸缺乏致神经管畸形易感基因双链断裂的表观特征及新易感基因筛...

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作者：李建婷山西医科大学

学位级别：博士

目的:利用高通量测序中的表观组学测序联合转录组学测序技术交互分析研究叶酸缺乏导致神经管畸形(Neural tube defects,NTDs)易感基因发生DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)区域的染色质的表观特征;根据以上NTDs易感基因的表观... 详细信息

目的:利用高通量测序中的表观组学测序联合转录组学测序技术交互分析研究叶酸缺乏导致神经管畸形(Neural tube defects,NTDs)易感基因发生DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)区域的染色质的表观特征;根据以上NTDs易感基因的表观特征进一步筛选新的NTDs易感基因,以期为叶酸缺乏导致NTDs发生提供新的理论支撑与研究基础。方法:1、利用叶酸拮抗剂甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)处理小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)24h后,收集mESCs进行组蛋白修饰H3K4me1、H3K4me3、H3K27me3、H3K27ac以及CTCF的ChIP-seq测序,并利用ChroHMM软件对染色质状态进行表征;2、基于课题组前期研究基础利用超几何算法计算MTX诱导mESCs基因组发生DSB区域的表观修饰特征改变;3、利用MTX处理mESCs 24h后,收集mESCs后提取mRNA后进行转录组的RNA-seq测序,分析NTDs易感基因的转录改变与基因组DSB区域表观修饰改变之间的关系;4、利用MTX处理mESCs 24h后,收集mESCs进行ATAC-seq测序,分析基因组染色质的开放性与DSB发生之间的联系;5、联合生物信息学方法分析MTX诱导NTDs易感基因发生DSB的同时伴随的表观修饰特征,并根据该特征筛选新的NTDs易感基因;6、在人低叶酸NTDs胎儿脑组织中通过Nanostring实验验证以上新筛选的NTDs易感基因的转录改变。结果:1、MTX诱导mESCs基因组的DSB主要发生在基因的启动子和增强子区。2、MTX诱导mESCs基因组活性启动子区发生DSB的同时伴随着染色质表观修饰的改变。3、MTX诱导mESCs基因组活性增强子区发生的DSB可以影响启动子活性。4、MTX诱导mESCs基因组的DSB通过CTCF介导的拓扑异构区改变NTDs易感基因的转录。5、根据以上调控模式共筛选出12个新的NTDs易感基因,其中7个基因在PABPC4、MED13L、TPGS1、FAM208A、SF3B5、BMYC、FAM109A在NTDs标本脑组织中得到验证。结论:1、MTX诱导的基因组启动子区发生DSB后导致基因组该区域染色质结构的改变进而影响NTDs易感基因的表达。2、MTX诱导的基因组远端增强子区发生DSB后影响其与启动子之间的相互作用进而导致基因表达紊乱。3、PABPC4、MED13L、TPGS1、FAM208A、SF3B5、BMYC、FAM109A是NTDs的新易感基因。

关键词：叶酸神经管畸形 DNA双链断裂易感基因表观特征

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5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因与神经管畸形关系的研究

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因与神经管畸形关系的研究

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作者：朱慧萍北京医科大学

学位级别：博士

该研究利用中美预防神经管畸形合作项目采集的外周血标本,检测MTHFR第677位核苷酸的多态性,查明了中国人MTHFR基因型的构成情况并比较南北方差异;检测NTDs患者和对照的基因型,系统地探讨了MTHFR基因与NTDs的关系,并分析了母亲增补叶酸与... 详细信息

该研究利用中美预防神经管畸形合作项目采集的外周血标本,检测MTHFR第677位核苷酸的多态性,查明了中国人MTHFR基因型的构成情况并比较南北方差异;检测NTDs患者和对照的基因型,系统地探讨了MTHFR基因与NTDs的关系,并分析了母亲增补叶酸与MTHFR基因突变在NTDs病因中的相互关系.经试验得出:MTHFR基因是NTDs遗传易感性因素之一.父亲和母亲的基因在后代NTDs遗传易感性中有同样重要的意义,胎儿的纯合突变与NTDs发生有关.用小剂量叶酸增补剂(0.4毫克/天)不能完全拮抗基因的作用.对于有这种遗传易感性的夫妇,女方应在受孕前后期服用加大剂量的叶酸增补剂.

关键词：神经管畸形叶酸 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶遗传易感性遗传标志物分子流行病学

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利用同位素标记相对和绝对定量技术筛查神经管畸形胚胎孕鼠血清差异蛋白质谱

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中国医科大学学报 2019年第4期48卷 315-319,323页

作者：安东袁正伟中国医科大学附属第一医院儿科沈阳110001 中国医科大学附属盛京医院卫生部小儿先天畸形重点实验室沈阳110004

目的筛查神经管畸形相关血清标记物,为阐明神经管畸形的发病机制提供理论依据。方法应用维甲酸在大鼠神经管闭合的关键期(孕10 d,E10)给药,建立脊柱裂大鼠模型,选取致畸早期孕11、13 d (E11、E13)显性脊柱裂胚胎孕鼠和正常胚胎孕鼠血清... 详细信息

目的筛查神经管畸形相关血清标记物,为阐明神经管畸形的发病机制提供理论依据。方法应用维甲酸在大鼠神经管闭合的关键期(孕10 d,E10)给药,建立脊柱裂大鼠模型,选取致畸早期孕11、13 d (E11、E13)显性脊柱裂胚胎孕鼠和正常胚胎孕鼠血清各5例,应用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)和液相色谱质谱鉴定技术分析2组蛋白质,定量信息以蛋白的丰度比差异倍数1.5倍以上(P <0.05)为差异蛋白质。结果质谱共得到谱图157 422张,鉴定出390种蛋白质,发现E11维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白40种,E13维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白26种。结论筛选出致畸早期大量神经管畸形和正常孕鼠血清差异蛋白,差异蛋白通过直接或间接相互作用,促进或抑制神经管畸形的发生与发展。

关键词：神经管畸形同位素标记相对和绝对定量技术蛋白组学

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高温致金黄地鼠神经管畸形差异表达基因的筛选、鉴定及功能研究

高温致金黄地鼠神经管畸形差异表达基因的筛选、鉴定及功能研究

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作者：杨青山东大学

学位级别：博士

神经管形成是胚胎早期发育中的重要事件，是指从神经板出现、卷折形成神经褶到左右神经褶在背侧中线靠拢愈合形成神经管的连续生物学过程。神经管是中枢神经系统发生的原基，神经管的发生和分化是脑和脊髓正常发育的前提。在神经管发育... 详细信息

神经管形成是胚胎早期发育中的重要事件，是指从神经板出现、卷折形成神经褶到左右神经褶在背侧中线靠拢愈合形成神经管的连续生物学过程。神经管是中枢神经系统发生的原基，神经管的发生和分化是脑和脊髓正常发育的前提。在神经管发育过程中，多种环境致畸因素可对其产生影响，引发神经管畸形（neural tube defects，NTDs）。神经管畸形是发生率最高、危害也最为严重的一类先天畸形，不仅危及患儿的生命和健康，而且给社会和家庭造成沉重的经济负担。从上个世纪开始，科学家开始检测诱发神经管畸形的各种致畸因子，其中高温是较常见且难以预防和避免的一种环境致畸因素。因此，探讨高温致神经管畸形的发生机理成为实验畸形学中的一个研究热点。近年来，人们从细胞、亚细胞和分子水平对高温致神经管畸形的机理进行了大量的动物实验和细胞培养研究，观察了高温对细胞增殖、凋亡、分化、粘着、类聚、组织诱导和器官发生等方面的影响。研究发现，在神经管形成和分化过程中，某一或某些相关基因的特异表达或特异不表达、上调表达或下调表达都会导致神经管发育异常，引发神经管畸形。高温致神经管畸形的发生是一个多基因参与的复杂过程，这其中有些基因上调表达，有些基因下调表达，而关于这些差异表达基因的系统研究至今仍未见报道。抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）是一种寻找差异表达基因的技术，可以克隆出与驱动子相比在检测子中特异表达和上调表达的基因。应用抑制性消减杂交方法构建的消减cDNA文库具有特异性和均等化两大突出优点。在本项实验中，我们应用抑制性消减杂交技术构建了高温致金黄地鼠神经管畸形的双向消减cDNA文库，从中筛选到了高温致神经管畸形过程中上调表达和下调表达的基因。通过序列测定和同源性比较对这些差异表达基因进行了分析，然后通过Northern杂交方法进一步证实这些基因在高温致神经管畸形过程中的差异表达情况。随后从这些差异表达基因中，挑选在胚胎发育中起重要作用的下调表达基因——Npm1，对其功能进行了体外研究。第一部分高温致金黄地鼠神经管畸形双向消减cDNA文库的构建及鉴定为筛选高温致神经管畸形过程中的差异表达基因，我们首先构建了高温致金黄地鼠神经管畸形双向消减cDNA文库。实验中，我们分别提取高温组和对照组金黄地鼠胚胎神经管组织总RNA，通过SMARTTM cDNA合成的方法反转录得到双链cDNA（ds cDNA）。将酚氯仿纯化后的ds cDNA用RsaI消化，消化后的ds cDNA再次经酚氯仿纯化，并用双蒸水调整浓度至300ng/μl。取纯化后的ds cDNA用于抑制性消减杂交。按PCR-selectTM cDNA subtraction kit说明进行正反两个方向的消减杂交，以高温组ds cDNA做检测子、对照组ds cDNA做驱动子进行消减杂交，构建高温致金黄地鼠神经管畸形正向消减cDNA文库，可从中筛选高温致神经管畸形过程中上调表达的基因。反之，以对照组ds cDNA做检测子、高温组ds cDNA做驱动子进行消减杂交，构建高温致金黄地鼠神经管畸形反向消减cDNA文库，可从中筛选高温致神经管畸形过程中下调表达的基因。将看家基因Gapdh设立为消减杂交实验的对照以检测消减效率。结果，Gapdh的表达丰度在消减杂交结束后明显降低，表明我们的消减效率很高。将消减杂交得到的产物纯化，然后通过T-A克隆的方法将其与T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，铺含氨苄青霉素的LB/X-gal/IPTG平板，构建消减cDNA文库。经蓝白斑初步筛选后，再利用菌落PCR方法进一步鉴定。结果显示，构建的消减cDNA文库中包含150 bp-1 kb的长短不一的差异表达基因片段。这说明我们构建的高温致金黄地鼠神经管畸形双向消减cDNA文库是成功的，可用于筛选差异表达基因。第二部分高温致金黄地鼠神经管畸形差异表达基因的筛选、序列分析及鉴定由于消减cDNA文库中包含的基因信息较多，一般采用随机法挑选文库中的克隆进行测序。本实验中，我们选取经菌落PCR证实插入片段较长的克隆进行测序，并将测序结果通过blastn软件与Genbank数据库中的已知基因进行序列比对和同源性分析。在高温致金黄地鼠神经管畸形反向消减cDNA文库中，我们共筛选到14个下调表达基因，经分析均与已知基因有较高的同源性。这些基因编码的蛋白有核糖体蛋白，参与代谢的酶，翻译及转录因子和其他。随后通过Northern杂交证实了这些基因在高温致畸胚胎神经管中表达水平均明显降低。而在高温致金黄地鼠神经管畸形正向消减cDNA文库中，由于扩增得到的片段普遍较短，

关键词：高温神经管畸形神经干细胞抑制性消减杂交 RNA干扰凋亡金黄地鼠

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人类神经管畸形发生机理的研究

人类神经管畸形发生机理的研究

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作者：仇肇珺中国科学院大学

学位级别：博士

神经管畸形是复杂的中枢神经系统先天性缺陷。无脑儿和脊柱裂是神经管畸形两种最常见和最严重的表型。中国神经管畸形的发病率非常高，但不同的地区发病率差别很大。山西吕梁地区的神经管畸形发病率高达199.7/10000，是全球神经管畸形... 详细信息

神经管畸形是复杂的中枢神经系统先天性缺陷。无脑儿和脊柱裂是神经管畸形两种最常见和最严重的表型。中国神经管畸形的发病率非常高，但不同的地区发病率差别很大。山西吕梁地区的神经管畸形发病率高达199.7/10000，是全球神经管畸形发病率最高的地区。多个营养干预研究都表明孕妇在孕前和孕后早期内强化B族维生素叶酸就可以预防至少一半的新生儿神经管畸形。但神经管畸形的致病机理原理至今未明。众多的研究揭示环境因素和遗传相互作用共同导致了神经管畸形的发生。本研究旨在探寻遗传与环境的相互作用如何影响新生儿神经管畸形的病理。\n 我们成功地在现场收集了中国山西吕梁地区神经管畸形胎儿和配对的正常对照胎儿的组织样品。随后我们选取符合芯片实验要求的样品的总RNA进行了全基因组表达谱芯片实验。经过综合分析，我们发现在只有在脊髓组中畸形同正常的胎儿相比存在着295个显著表达差异的基因。在这些差异表达的基因中，101个基因表达上调，194个基因表达下调。我们依据差异表达基因构建了的蛋白质相互作用的网络。网络中大部分上调的基因的功能富集于对损伤的反应，下调的主要基因的功能是神经系统发育。\n 我们发现同正常胎儿相比，神经管畸形胎儿的胆固醇生物合成通路的8个基因表达显著地下调。调节基因SIRT2的表达下调是这8个胆固醇合成代谢调节基因表达量降低的原因。实时定量PCR实验和免疫印迹实验都显示胆固醇合成的相关基因不仅在RNA水平表达下降，蛋白水平上表达也是下降的。脊髓组织的免疫组化实验表明在神经管畸形胎儿中胆固醇合成代谢组成蛋白IDI1和MVD以及调节蛋白SIRT2和SREBP2的定位有比较明显的改变。IDI1，SIRT2和SREBP2的趋势是畸形同正常相比进核数显著增加，MVD是畸形中进核而正常无进核现象。该结果表明胆固醇合成通路相关蛋白的组织定位在神经管畸形胎儿中也有不正常改变。\n 在细胞水平上干扰叶酸代谢可以降低SIRT2的表达。比较CHO/dhFr-细胞与CHO细胞的蛋白表达情况显示在细胞的叶酸代谢受到干扰的情况下胆固醇合成调节蛋白SIRT2和SREBP2的蛋白水平表达显著降低。我们分析HT-29细胞叶酸消耗的表达谱数据也显示在低叶酸培养的的条件下，SIRT2的表达显著降低。\n 通过这些研究，我们发现在在脊髓中神经管畸形胎儿同正常对照胎儿相比胆固醇生物合成相关基因表达明显降低，并且发现了导致降低的关键蛋白SIRT2。本研究首次在人类的早期胚胎发育过程将神经管畸形和胆固醇生物合成代谢异常紧密联系在一起，为下一步阐明胆固醇生物合成在早期胚胎神经管发育中的关键作用奠定了基础。

关键词：神经管畸形胆固醇生物合成代谢发生机理调节基因 SIRT2蛋白

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大鼠神经管畸形胚胎期神经元缺损机制及羊膜腔内骨髓间充质干细胞移植治疗潜能的研究

大鼠神经管畸形胚胎期神经元缺损机制及羊膜腔内骨髓间充质干细胞...

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作者：魏晓伟中国医科大学

学位级别：博士

目的：\n 神经管畸形(Neural tube defects，NTDs)是最常见、最严重的中枢神经系统先天性畸形，世界范围内发生率为0.5％-20％，但目前尚无良好治疗方法。脑积水、下肢功能障碍以及尿便失禁依然是严重的术后神经系统后遗症，这主要... 详细信息

目的：\n 神经管畸形(Neural tube defects，NTDs)是最常见、最严重的中枢神经系统先天性畸形，世界范围内发生率为0.5％-20％，但目前尚无良好治疗方法。脑积水、下肢功能障碍以及尿便失禁依然是严重的术后神经系统后遗症，这主要是由于神经损伤后修复极其困难造成的。我们前期的的研究证明支配肛门外括约肌和肛提肌的脊髓运动与感觉神经元以及支配直肠的副交感神经元在NTDs大鼠胚胎期便存在明显发育异常。因此，研究NTDs神经元发育损伤的机制，然后在神经出现不可逆损伤之前给予治疗，为神经管畸形的早期治疗提供基础，对减少出生缺陷、提高人口素质具有极其重要的意义。\n 方法：\n 1、动物模型建立与标本收集\n 成熟未孕Wistar大鼠雌雄比例5∶1午夜合笼，次日晨8-9时阴道涂片，显微镜下见到精子记为embryonic day0(E0)。E10天已孕雌鼠随机分为全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, atRA)致畸组和正常对照组两组。用橄榄油将atRA溶解成40mg/ml的混悬液，atRA致畸组以150mg/kg剂量经胃管灌入，对照组给予等体积的橄榄油。分别于E11，E12，E13，E15和E18时剖宫取出胎鼠，解剖显微镜下辨认畸形，4％多聚甲醛固定或取出胎鼠脊髓，-80℃保存。\n 2、细胞凋亡、细胞增殖与细胞分化的染色分析\n 全胚胎TUNEL染色\n 胚胎固定后脑室打孔，10μg/ml的蛋白激酶K，37℃孵育7 min-15min。含0.3％曲拉通x-100的磷酸盐缓冲液(0.3％ Triton x-100 in phosphate-buffered saline，PBST)冲洗后于含0.3％曲拉通x-100的枸橼酸钠溶液中冰浴3h，胚胎在TUNEL反应液中37℃避光孵育2.5 h-3.5h。然后将胚胎置入过氧化物酶标记的抗FITC抗体(POD)溶液中4℃过夜，最后DAB显色，反应3-10min，镜下观察。\n 切片TUNEL染色\n 胚胎石蜡切片脱蜡复水，15μg/ml蛋白酶K37℃孵育10min并于含0.1％曲拉通-x的枸橼酸钠溶液中冰浴2min; TUNEL混合液中37℃避光反应1.5h; DAPI复染，镜下观察，激光共聚焦显微镜采集结果图像。\n 免疫荧光染色\n 胚胎石蜡切片进行脱蜡、复水，或者冰冻切片置于PBS浸泡5min，然后没入枸橼酸钠进行热抗原修复;10％血清封闭，室温30min;一抗4℃，过夜;罗丹明或488标记的荧光二抗IgG，室温2.5h; DAPI复染，镜下观察，激光共聚焦显微镜采集结果图像。\n 3、Real-time quantitive reverse-transcription PCR(qRT-PCR)检测脊髓组织神经元发育相关microRNAs(miRNAs)的表达\n (1)提取总RNA:按照ambion的mirVana miRNA Isolation Kit说明进行RNA抽提，采用两步加A法、特异性stem-loop RT引物法两种方法进行real-time PCR。\n 两步加A法:\n (1)反转录:RNA加A尾后采用40μl反应体系反转录(5×prime script buffer,8μl; Prime script RT enzyme,1μl; RT primer,2μl; Total RNA,29),37℃孵育15min,85℃5 sec终止反应。\n (2) real-time PCR反应:调整cDNA浓度为500 ng/μl，20μl反应体系(SYBRRPremix Ex TaqTM(2×),10μl; PCR primer(5μM),2μl; H2O,5.6μl; ROXⅡ,0.4μl;eDNA，1μl)，反应条件为:Stage1预变性:95℃30 sec; Stage2 PCR反应:95℃5 sec，60-61℃30 sec，40个循环;Stage3融解曲线分析:95℃0 sec，60-61℃15sec，95℃20 sec。每个样本行3个平行孔重复实验，采用2-△△Ct的方法分析目的基因的相对表达量。\n Stem-loop RT引物法进一步分析miR-9*和miR-124a的表达\n (1)反转录:采用15μl反应体系反转录(100mMDntp，0.15μl; MultiCribeTMReverse Transcriptase,1.00μl; Reverse Transcription Buffer(10×),1.50μl; RNaseInhibitor,0.19μl; RT primer(5×),3.00μl; Raase F

关键词：神经管畸形细胞增殖凋亡机制胚胎期神经元缺损机制骨髓间充质干细胞移植治疗

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DDX3和DDX5在环磷酰胺致大鼠神经管畸形神经上皮细胞中的表达变化

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解剖学杂志 2017年第4期40卷 369-372,411页

作者：王箐王巧真刘永新张雅雯马晓君赵春艳杜红梅陈燕春潍坊医学院人体解剖学教研室潍坊261053 潍坊医学院组织学与胚胎学教研室潍坊261053

目的:探讨RNA解旋酶DDX3和DDX5在环磷酰胺致大鼠神经管畸形神经上皮细胞中的表达及与神经管畸形发生之间的关系,为阐明神经管畸形发生的分子机制提供实验依据。方法:选取不同时间点环磷酰胺致神经管畸形模型组和对照组大鼠石蜡切片,应... 详细信息

目的:探讨RNA解旋酶DDX3和DDX5在环磷酰胺致大鼠神经管畸形神经上皮细胞中的表达及与神经管畸形发生之间的关系,为阐明神经管畸形发生的分子机制提供实验依据。方法:选取不同时间点环磷酰胺致神经管畸形模型组和对照组大鼠石蜡切片,应用免疫荧光组织化学显色法检测神经上皮细胞中DDX3和DDX5的表达变化。结果:与对照组相比,模型组大鼠神经管神经上皮细胞中DDX3和DDX5阳性表达在环磷酸胺处理后4 h无改变,8、12、24 h均升高,48 h则降低,差异均有统计学意义。结论:环磷酰胺导致大鼠胚胎神经管神经上皮细胞中DDX3和DDX5表达异常,提示DDX3和DDX5可能参与了神经管畸形的发生。

关键词：环磷酰胺神经管畸形 RNA解旋酶 DDX3 DDX5 大鼠

来源：评论

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维甲酸致神经管畸形中牡蛎拮抗神经细胞凋亡的实验研究

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中国儿童保健杂志 2013年第5期21卷 494-496页

作者：马永臻山东医学高等专科学校山东临沂276000

【目的】探讨维甲酸(retinoic acid,RA)致神经管畸形(neural tube defects,NTDs)中牡蛎拮抗神经细胞凋亡的分子机制。【方法】建立NTDs模型并给予牡蛎拮抗,观察神经细胞的凋亡情况及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax与Caspase-3表达的变化。【结... 详细信息

【目的】探讨维甲酸(retinoic acid,RA)致神经管畸形(neural tube defects,NTDs)中牡蛎拮抗神经细胞凋亡的分子机制。【方法】建立NTDs模型并给予牡蛎拮抗,观察神经细胞的凋亡情况及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax与Caspase-3表达的变化。【结果】1)RA组神经管上皮细胞凋亡指数明显高于对照组,牡蛎组凋亡指数明显低于RA组(P<0.05)。2)RA组神经上皮细胞Bcl-2的表达明显低于对照组,牡蛎组Bcl-2的表达明显高于RA组(P<0.05)。3)RA组Bax与Caspase-3的表达均明显高于对照组,牡蛎组Bax与Caspase-3的表达明显低于RA组(P<0.05)。【结论】牡蛎可以拮抗RA引起的神经上皮细胞过度凋亡,其机理可能是通过上调Bcl-2的表达和下调Bax与Caspase-3的表达实现的。

关键词：神经管畸形 Bcl-2 Bax Caspase-3

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