检索结果-内蒙古大学图书馆

诊断学理论与实践 2013年第6期12卷 654-657页

作者：程凯王建东石群立南京大学医学院/南京军区南京总医院病理科江苏南京210002

迄今为止．病理学诊断技术已从传统的大体解剖病理学和组织形态学诊断．发展到与免疫组织化学、原位杂交、DNA片段分析等分子诊断技术相互结合的新阶段。形态学诊断虽仍是病理诊断的基础和重要依据，但分子检测技术提供了更丰富的信息... 详细信息

迄今为止．病理学诊断技术已从传统的大体解剖病理学和组织形态学诊断．发展到与免疫组织化学、原位杂交、DNA片段分析等分子诊断技术相互结合的新阶段。形态学诊断虽仍是病理诊断的基础和重要依据，但分子检测技术提供了更丰富的信息作为辅助．进而指导临床治疗。

关键词： microRNA RNA提取福尔马林固定石蜡包埋组织

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改良醋酸铵盐析法提取福尔马林固定石蜡包埋组织DNA

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中国法医学杂志 2012年第3期27卷 225-227页

作者：周勤虎丁梅王保捷庞灏徐振亮张晨冯春梅王巍巍中国医科大学法医学院辽宁沈阳110001 重庆市公安局刑警总队重庆400021

目的采用改良醋酸铵盐析法提取福尔马林固定石蜡包埋组织DNA,并评价其应用价值。方法取死后24h内人体肾组织用10%中性福尔马林溶液固定7d,石蜡包埋。采用酚/氯仿法、Chelex-100法及改良醋酸铵盐析法提取DNA。经用紫外分光光度计法、AGE... 详细信息

目的采用改良醋酸铵盐析法提取福尔马林固定石蜡包埋组织DNA,并评价其应用价值。方法取死后24h内人体肾组织用10%中性福尔马林溶液固定7d,石蜡包埋。采用酚/氯仿法、Chelex-100法及改良醋酸铵盐析法提取DNA。经用紫外分光光度计法、AGE及PCR-PAGE检测比较不同方法提取DNA的质量。结果改良醋酸铵盐析法、酚/氯仿法、Chelex-100法OD260/OD280比值分别为1.962±0.195、2.110±0.470、1.018±0.124,两两比较均有显著性差异(P<0.05);3种方法提取DNA含量(μg)分别为0.515±0.447、0.328±0.345、5.346±1.994;AGE电泳图谱可印证上述结果;PCR-PAGE检测显示改良醋酸铵盐析法提取DNA的谱带清晰度好于其它两种方法。结论改良醋酸铵盐析法更适合微量福尔马林固定石蜡包埋组织样本DNA的提取。

关键词：法医物证学 DNA提取改良醋酸铵盐析法福尔马林固定石蜡包埋组织

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醋酸铵盐析法和DNA修复技术在福尔马林固定石蜡包埋组织DNA多态性分析中应用的研究

醋酸铵盐析法和DNA修复技术在福尔马林固定石蜡包埋组织DNA多态性...

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作者：周勤虎中国医科大学

学位级别：硕士

福尔马林固定石蜡包埋组织(formalin-fixed and paraffin-embedded tissue,FFPET)因其能够较长时间地保存组织或制备检验所需的组织标本,因此在临床病理检验、法医病理学鉴定和医学科学研究过程中常被用到。这一处理过程虽然能够使DNA... 详细信息

福尔马林固定石蜡包埋组织(formalin-fixed and paraffin-embedded tissue,FFPET)因其能够较长时间地保存组织或制备检验所需的组织标本,因此在临床病理检验、法医病理学鉴定和医学科学研究过程中常被用到。这一处理过程虽然能够使DNA免受内源性核酸酶的破坏,但是甲醛不仅会导致DNA链的断裂和降解、DNA发生脱嘌呤以及DNA-蛋白质的交联,造成被固定组织DNA质量的改变,而且其在模板DNA中的残存也严重影响着PCR扩增。研究表明,影响FFPET DNA提取的因素有很多。如固定液的种类、固定时间、切片厚度、切片存储时间以及不同的提取处理方法等均可影响FFPET提取DNA的质量,从而影响其基因分型。通过优化蛋白酶消化条件、增加循环次数或采用巢式PCR等,虽然可以提高扩增产物量或扩增特异性,但并未明显改善其检出率;通过缩短扩增产物片段长度,如开发扩增片段较小的miniSTR (mini-short tandem repeat)系统或SNP (single nucleotide polymorphism)系统,虽然提高了对降解DNA检材的分型成功率,但仍然普遍存在诸如等位基因或位点丢失、不平衡峰、伪峰等问题。此外miniSTR系统扩增片段长度不可能无限的减小(基本在50-200bp之间);SNP分析技术要达到与目前所用STR试剂盒一样的识别率,所需的位点数较多等缺点,也限制了其在实际检案中的应用。本研究基于法医学检案的实际需要,结合前人的研究成果,通过对醋酸铵盐析法进行改进,并结合PCR前修复技术提高模板DNA质量,以期为法医学实际检案中FFPET DNA的STR分型提供一种新的方法。材料与方法 1、死后24h内尸体肾脏组织(1cm×1cm×0.5cm)及心血(15ml),均由中国医科大学法医病理学教研室提供。 2、经10%中性福尔马林溶液固定1d、3d、5d和7d后,进行石蜡包埋,常规切片备检。 3、血液DNA提取,新鲜组织DNA提取,FFPET切片DNA提取,对醋酸铵盐析法影响因素进行探讨,并将其与酚／氯仿法、Chelex-100法进行比较,同时探讨法医学可以实现成功分型的最小FFPET检材量。 4、对改良醋酸铵盐析法所提基因组DNA采用修复酶进行模板DNA的修复。结果 1、不同脱蜡方法提取基因组DNA的PCR-PAGE结果显示未脱蜡和脱蜡均可得到清晰谱带;但是从谱带亮度上看95℃水浴脱蜡谱带最亮,65℃水浴脱蜡次之,后依次为二甲苯脱蜡、微波脱蜡、不脱蜡。 2、不同消化缓冲液消化提取DNA的PCR-PAGE结果显示0.5%Tween 20消化谱带最亮,1%Triton X-100消化次之,后依次为0.5%SDS消化,2%CTAB消化。 3、不同浓度醋酸铵溶液沉淀所得基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果显示三种浓度醋酸铵溶液提取的DNA量无显著性差异。PCR-PAGE结果显示三种浓度醋酸铵溶液提取的基因组DNA扩增产物均可得到清晰谱带,谱带亮度上三者之间无显著性差异。 4、不同固定时间FFPET所提基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果显示不同固定时间切片组织所提取的基因组DNA的电泳谱带均成弥散状,且随着固定时间的延长,谱带弥散越明显,谱带最亮区域逐渐下移。PCR-PAGE结果显示不同固定时间切片组织均可得到清晰谱带,但随着固定时间的延长,谱带亮度逐渐减弱。 5、不同提取方法所得基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果显示Chelex-100法所得DNA的电泳谱带最亮,改良醋酸铵盐析法次之,酚／氯仿法相对最弱;同一种方法内部比较显示随着检材量的减少,三种方法所提取的基因组DNA的电泳谱带亮度均逐渐减弱。OD260／OD280比值,改良醋酸铵盐析法在1.6～2之间(1.962±0.195),酚／氯仿法大于2(2.110±0.470),Chelex-100法在1左右(1.018±0.124)。从所得DNA的量上来看,Chelex-100法所得DNA的量明显高于其他两种方法;改良醋酸铵盐析法次之,酚／氯仿法最少;且随着检材量的减少,这种趋势更明显。PCR-PAGE结果显示改良醋酸铵盐析法提取的DNA均可扩增出清晰的谱带;酚／氯仿法提取的DNA扩增谱带较弱,且随着检材量的减少,谱带亮度明显减弱,当检材量减小为1／8片时已基本显示不出谱带;Chelex-100法提取的DNA在1片时未扩增出谱带,1／2片时谱带隐约可见,而在1／4片、1／8片时可见清晰谱带,但亮度不及改良醋酸铵盐析法所提取的DNA的亮度。 6、对改良醋酸铵盐析法所提取的模板DNA进行PCR前修复,PCR-PAGE

关键词：法医物证学 DNA提取改良醋酸铵盐析法 DNA修复福尔马林固定石蜡包埋组织

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多重荧光PCR-熔解曲线法检测福尔马林固定石蜡包埋肺组织样本中病原真菌的价值

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国际流行病学传染病学杂志 2020年第1期47卷 50-54页

作者：朱芳朱以军翟晓利胡益飞倪红英浙江省金华市中心医院病理科 321000 浙江省金华市中心医院检验科 321000 浙江省金华市中心医院重症医学科 321000

目的比较多重荧光PCR-熔解曲线法与病理诊断法检测福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肺组织样本中病原真菌的价值。方法选择2014—2019年本院病理科病原真菌阳性患者的42份肺组织样本(念珠菌8份、曲霉菌23份、隐球菌11份)作为阳性组,病原真菌... 详细信息

目的比较多重荧光PCR-熔解曲线法与病理诊断法检测福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肺组织样本中病原真菌的价值。方法选择2014—2019年本院病理科病原真菌阳性患者的42份肺组织样本(念珠菌8份、曲霉菌23份、隐球菌11份)作为阳性组,病原真菌阴性的肺组织样本50份作为阴性组,均进行多重荧光PCR-熔解曲线法检测,并应用配对χ2检验和Kappa值对两种方法的检测结果进行比较。结果阳性组42份样本多重荧光PCR-熔解曲线法检出23份阳性,并可分辨至种水平,其中念珠菌4份(白色念珠菌2份、热带念珠菌1份、克柔念珠菌1份)、曲霉菌13份(烟曲霉11份、黄曲霉2份)、新型隐球菌6份。阴性组50份样本多重荧光PCR-熔解曲线法检测均阴性。Kappa值0.568,以病理诊断法为"金标准",多重荧光PCR-熔解曲线法检测病原真菌的灵敏度为54.8%(23/42)、特异性为100.0%(50/50)。结论多重荧光PCR-熔解曲线法检测FFPE样本中病原真菌的灵敏度不高,但可以将病原真菌鉴定至种,是病理诊断法的补充。

关键词：真菌荧光PCR,多重熔解曲线福尔马林固定石蜡包埋组织

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多重荧光PCR-熔解曲线法检测福尔马林固定石蜡包埋肺组织标本中的病原真菌

多重荧光PCR-熔解曲线法检测福尔马林固定石蜡包埋肺组织标本中的...

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2019年浙江省医学会医学微生物与免疫学分会学术大会

作者：朱以军朱芳胡益飞倪红英单小云浙江省金华市中心医院检验科浙江省金华市中心医院病理科浙江省金华市中心医院重症医学科

目的比较多重荧光PCR-熔解曲线法与病理诊断法检测福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺组织标本中的病原真菌的结果方法选择2014-2019年本院病理科病原真菌阳性的42例肺组织标本（念珠菌8例、曲霉菌23例、隐球菌11例）作为病理诊断阳性组,... 详细信息

目的比较多重荧光PCR-熔解曲线法与病理诊断法检测福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺组织标本中的病原真菌的结果方法选择2014-2019年本院病理科病原真菌阳性的42例肺组织标本（念珠菌8例、曲霉菌23例、隐球菌11例）作为病理诊断阳性组,病原真菌阴性标本10例作为病理诊断阴性组进行多重荧光PCR-熔解曲线法检测,并应用配对χ检验,四格表χ检验对两种方法的检测结果进行比较。结果病理诊断阳性组42例标本多重荧光PCR-熔解曲线法检出23例阳性,其中念珠菌4例（白色念珠菌2例、热带念珠菌1例、克柔念珠菌1例）、曲霉菌13例（烟曲霉11例、黄曲霉2例）、新型隐球菌6例。病理诊断阴性的10例标本多重荧光PCR-熔解曲线法检测均阴性。配对χ检验显示两种方法结果具有明显差异（P <0.01）,四格表χ检验显示Kappa值0.318,两种方法的一致性具有明显差异（P<0.01）,以病理诊断法为"金标准",多重荧光PCR-熔解曲线法检测病原真菌的敏感性为54.8%（23/42）、特异性为100%（10/10）。结论多重荧光PCR-熔解曲线法检测FFPE标本中病原真菌的敏感性不高,但可以将病原真菌鉴定至种,是病理诊断法的补充,对侵袭性肺真菌感染的诊断具有重要意义。

关键词：肺真菌感染荧光PCR,多重熔解曲线福尔马林固定石蜡包埋组织

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福尔马林固定不同时间石蜡包埋组织DNA降解程度及SNP分型的研究

福尔马林固定不同时间石蜡包埋组织DNA降解程度及SNP分型的研究

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作者：段晋琦重庆医科大学

学位级别：硕士

背景福尔马林固定石蜡包埋组织(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues,FFPET)是病理学、法医病理学进行疾病诊断和科学研究的常用检材,并被长期保存,亦是涉嫌保险欺诈,医疗纠纷,财产继承等刑事、民事案件的法医物证检材。目前... 详细信息

背景福尔马林固定石蜡包埋组织(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues,FFPET)是病理学、法医病理学进行疾病诊断和科学研究的常用检材,并被长期保存,亦是涉嫌保险欺诈,医疗纠纷,财产继承等刑事、民事案件的法医物证检材。目前,国内医院及科研机构大多使用普通10%甲醛固定人体组织,普通福尔马林溶液固定人体组织中DNA降解相对比较严重,提取高质量的DNA并进行PCR-STR分型较为困难。这使FFPET成为法医物证疑难检材之一。检测FFPET也成为法医物证学研究的重点和难点。联合DNA索引系统(CODIS)13个核心STR基因座的Plus和Cofiler等试剂盒,虽已广泛应用于血液、唾液、上皮组织、发根及骨组织的基因分型,但仍不能对FFPET进行准确分型。研究表明,福尔马林固定时间、切片厚度以及不同的脱蜡方法均可影响FFPET提取DNA的质量,从而影响其基因分型。而且不同组织的DNA降解程度有所不同。通过优化蛋白酶消化条件,精简DNA提取步骤和纯化DNA模板虽能提高DNA纯度和减少DNA额外损伤,但并不能给FFPET的基因分型带来本质的改观;通过增加循环次数或采用巢式PCR等对PCR方法进行调整与改良,可以提高扩增产物量或扩增特异性,但并未明显改善其检出率。因此,越来越多的学者将研究的重点转移到如何有效地缩短扩增产物片段长度,以克服FFPET检材中DNA严重降解对基因分型的影响,从而提高FFPET基因分型的成功率。大公司竞相研发出扩增片段较小的miniSTR商品化检测试剂盒,提高了对降解DNA检材的分型成功率,但仍然普遍存在诸如等位基因或位点丢失、不平衡峰、Pull-up峰等问题,影响了在实际检案中的应用。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)通常是指人类基因组中特定部位的单个碱基序列的变异。人类基因组中SNP含量丰富,每个个体存在数百万个SNP。由于很多原因,SNP引起法医工作者的关注。首先,SNP的PCR扩增产物长度可以小于100bp,而STR的扩增产物都为300-400bp,因此SNP比STR更适用于降解的DNA样本。第二,样品的处理和数据分析易于自动化。第三,它的每个等位基因上不出现stutter带,有助于简化等位基因分析。在法医学领域,SNP最大的优点就是可以得到短的PCR产物,从而为解决FFPET基因分型的难题提供了新的思路和途径。目的本研究探讨不同时间福尔马林固定石蜡包埋组织DNA降解情况,保证扩增产物片段长度小于100bp为基本条件,针对具有较高杂合度的SNP基因座自行设计等位基因特异性引物,通过SNP基因座与STR(D2S441)基因座对FFPET检材基因分型结果的比较,探讨采用短扩增子ASPCR技术对FFPET进行SNP分型的可行性与优越性。并调查了rs1454361、rs2046361基因座在中国重庆汉族群体的频率分布。实验分为两部分一、福尔马林固定不同时间石蜡包埋组织DNA降解程度与SNP分型成功率的研究材料与方法: 1、FFPET取自重庆医科大学法医学教研室,3个例尸体解剖提取的肝脏、肺脏、皮肤、骨骼肌、脑,用福尔马林溶液固定5d,10d,15d,按常规方法制作FFPET样品,切取10μm厚切片,每4片放入一个1.5ml的无菌离心管中。同时取上述尸体心脏血各2ml作为阳性对照。(同时常规切片HE染色,显微镜下观察确保组织结构清晰,无自溶、坏死、和大片出血) 2、采用琼脂糖凝胶电泳对FFPET样本的DNA进行质量检测。 3、分别应用SNP-ASPCR技术与PCR-STR技术对FFPET检材进行基因分型,并对两者的分型成功率与分型效果进行比较。结果 1、琼脂糖凝胶电泳显示,血液样品提取DNA的电泳谱带纤细清亮,电泳迁移率低;FFPET样品提取DNA的电泳谱带成弥散状,电泳迁移率高。通过与DNA Marker比较,片段长度主要分布于200bp以下,5d组各FFPET样品片段长度主要分布于100bp-200bp,10d组脑组织片段长度主要分布于50bp以下,其余分布100bp左右,15d组只有肝脏样品片段长度分布于100bp,其余分布于50bp以下。 2、采用ASPCR技术对rs1454361与rs2046361基因座进行分型,5d组rs1454361的检出率为14/15(有1例脑组织来源的FFPET样品未检出PCR产物),rs2046361的检出率为13/15(有2例脑组织来源的FFPET样品未检出PCR产物)。10d天组脑组织来源的FFPET样品全部未检出PCR

关键词：福尔马林固定石蜡包埋组织 SNP ASPCR PCR-STR

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qPCR检测结核杆菌在肺和胸膜上皮样肉芽肿性疾病诊断中的意义

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临床与实验病理学杂志 2017年第10期33卷 1132-1134页

作者：陈昕陈灵锋黄颖福建省立医院病理科/福建省立临床医学院福州350001

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction,q PCR)法在诊断及鉴别诊断肺和胸膜结核病和其他肉芽肿性疾病中的意义。方法收集经病理学检查发现上皮样肉芽肿性病变的肺和胸膜活检的石蜡包埋组织142例,应用q PCR... 详细信息

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction,q PCR)法在诊断及鉴别诊断肺和胸膜结核病和其他肉芽肿性疾病中的意义。方法收集经病理学检查发现上皮样肉芽肿性病变的肺和胸膜活检的石蜡包埋组织142例,应用q PCR法检测结核分枝杆菌DNA,同时行抗酸染色,并与临床资料对比进行回顾性分析。结果在142例肺胸膜活检标本中,60例临床诊断确诊为结核病。采用q PCR法检测结核分枝杆菌DNA阳性者58例,敏感性为96.67%,特异性为100%;抗酸染色阳性者17例,敏感性为28.33%,特异性为97.56%,差异有统计学意义(χ~2=21.47,P<0.001)。结论结核分枝杆菌核酸检测有助于在石蜡包埋的肺和胸膜小活检组织中快速、准确的诊断结核病,可用于疑似结核的肉芽肿性病变的鉴别诊断。

关键词：结核分枝杆菌福尔马林固定石蜡包埋组织荧光定量聚合酶链反应

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不同条件下核酸样本制备的质量控制和参数建立

不同条件下核酸样本制备的质量控制和参数建立

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作者：刘超浙江大学

学位级别：硕士

现代某些遗传学研究领域，如法医学分析，出生前或植入前诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD），或致瘤因子检测中，DNA分析通常只是针对小量细胞甚至单个细胞。有限的基因组DNA（genomic DNA，gDNA）即通常所说的低拷贝数（... 详细信息

现代某些遗传学研究领域，如法医学分析，出生前或植入前诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD），或致瘤因子检测中，DNA分析通常只是针对小量细胞甚至单个细胞。有限的基因组DNA（genomic DNA，gDNA）即通常所说的低拷贝数（low copy number，LCN）DNA常常限制这些检测的敏感性。另一方面，临床实践和法医学实践中由于种种外界条件的限制，长期以来在生物样本中，获得理想的高质量的DNA一直是个难题。DNA常受光、热、湿度、温度、微生物等多种因素的影响而发生降解。因此，DNA的质和量是影响DNA分析的两个重要因素。福尔马林固定、石蜡包埋组织（formalin fixed and parafiin embedded，FFPE）是现在运用最广的用于回顾性研究的材料。一般认为，从福尔马林固定的组织样本中分离出的DNA常成高度降解状态，平均片段大小在60-200bp之间。DNA的降解可发生于组织准备、福尔马林固定和石蜡包埋的不同阶段，这对于DNA检测的敏感性会产生不利影响。通常大于300bp的扩增片段较难在石蜡包埋组织进行基因表达研究。扩增片段越短，结果越可靠。但是，当扩增片段太小时，常较难针对限制区域设计引物，并且容易使一些与疾病相关的重要基因的改变被漏检。那么，如何提高这些质和量较差样本检测的敏感性是研究者面对的一个难题。聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术的发展和应用使得微量甚至单个细胞DNA的分析成为可能，极大促进了法医学、分子针断学和分子病理学的发展。但即使对于非常敏感的PCR技术，许多材料所能提供的DNA量也不足以被成功检测。为能从少量细胞中最大限度的获取信息，全基因组扩增（Wholegenome amplification，WGA）技术应运而生。简并寡核苷酸引物（degenerateoligonueleotide primed Polymerase chain reaction，DOP-PCR）是一种全基因组DNA扩增技术，因其扩增DNA具有均匀性，故该技术已开始应用于微量组织的全基因组DNA分析。DOP-PCR引物是由其3'和5'端的特异核苷酸序列和中间的6个核苷酸构成的随机引物组成。其PCR程序是先在低退火温度下进行几十个循环的低严谨扩增，然后下一轮的严谨扩增中又将低严谨的产物再次放大，从而使整个基因组得到放大。此外，样本DNA的纯化方式也是影响基因分析的一个重要因素。我们现在常用的纯化方式包括酚氯仿抽提法、chelex抽提法、硅粒纯化法等，这些方法都因为抽提过程中不能获得较高质量的DNA或者产生PCR抑制物而使其应用受到限制。DNA IQTM System试剂盒是一种较新的能够针对小样本获得较高质量DNA的纯化方法。该方法采用一种包裹有磁性粒子的树脂分离DNA，该磁珠具有与DNA较强的特异结合能力，能够较强的吸附DNA而较完全的保留DNA。样品中的DNA首先通过裂解液的作用释放出来，然后在有结合液存在的情况下特异性地与磁珠微粒子结合，结合了DNA的磁珠被磁场俘获，通过洗涤将污染物除去，然后利用洗脱液将DNA洗脱下来，从而获得高质量的DNA.。该方法主要是用于小量DNA的快速纯化并且能获得一致的产量。线粒体DNA（mtDNA）由于其高拷贝数现已较多运用于质量较低的样本中。线粒体DNA是细胞内相对独立的基因组，基因组结构比较简单，并具有很高的专一性，独特性。它的传递、重组、分离、复制、转录都可应用分子生物学的许多手段和方法进行分析。因此，线粒体DNA不仅是研究DNA结构与DNA复制、转录的良好模型，也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成等一般问题非常合适的模型系统。通常一个细胞内有多个mtDNA拷贝（核DNA拷贝数的10倍左右），因此对于一些核DNA降解较为严重的样本，检测mtDNA更容易得到有意义的结果。为此，我们首先利用细胞系建立参考DNA标准，选择目前公认的常染色体和性染色体上的STR，及β2微球蛋白以及线粒体DNA三类DNA片段标签序列，利用常规蛋白酶K-酚氯仿抽提法、DOP-PCR、DNA IQTM System、以及联合应用DNA IQTM System和DOP-PCR确定能抽提出的细胞最小数，以此为标准，检测福尔马林固定、石蜡包埋组织中DNA的质量。材料与方法 1材料（1）培养细胞系：选择人胚胎羊膜成纤维细胞FL及人结肠癌细胞系RKO，MEM和RPMI 1640（均含10％超级新生牛血清）为培养基，，放入37℃，5％CO2～9

关键词：全基因组扩增低拷贝DNA 简并寡核苷酸引物PCR 线粒体DNA 福尔马林固定石蜡包埋组织

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应用短扩增子ASPCR技术对FFPET进行SNP基因分型的研究

应用短扩增子ASPCR技术对FFPET进行SNP基因分型的研究

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作者：谭卓毅中国医科大学

学位级别：硕士

前言福尔马林固定石蜡包埋组织（Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues，FFPET）是病理学、法医病理学等学科进行疾病诊断和科学研究的常用检材，多被长时期的保存而成为一种重要的个人实物档案，为解决涉嫌保险欺诈、医疗纠... 详细信息

前言福尔马林固定石蜡包埋组织（Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues，FFPET）是病理学、法医病理学等学科进行疾病诊断和科学研究的常用检材，多被长时期的保存而成为一种重要的个人实物档案，为解决涉嫌保险欺诈、医疗纠纷、财产继承等民事或刑事案件提供了一种极为重要的、可靠的法医物证检材。基于CODIS系统13个STR位点的Plus和Cofiler等试剂盒，虽已广泛应用于血液、唾液、上皮组织、发根及骨组织的基因分型，但是对FFPET进行基因分型时，常因组织固定过程中各种理化因素的影响致使DNA高度降解，从而难以获得稳定、可靠的分型结果。研究表明，福尔马林固定时间、切片厚度以及不同的脱蜡方法均可影响FFPET提取DNA的质量，从而影响其基因分型。通过优化蛋白酶消化条件，精简DNA提取步骤和纯化DNA模板虽能提高DNA纯度和减少DNA额外损伤，但并不能给FFPET的基因分型带来本质的改观；通过增加循环次数或采用巢式PCR等对PCR方法进行调整与改良，可以提高扩增产物量或扩增特异性，但并未明显改善其检出率。因此，越来越多的学者将研究的重点转移到如何有效地缩短扩增产物片段长度，以克服FFPET检材中DNA严重降解对基因分型的影响，从而提高FFPET基因分型的成功率。各大公司竞相研发出扩增片段较小的miniSTR商品化检测试剂盒，提高了对降解DNA检材的分型成功率，但仍然普遍存在诸如等位基因或位点丢失、不平衡峰、伪峰等问题，影响了在实际检案中的应用。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Po]ymorphism，SNP）具有数量丰富、突变率低、适合高通量自动化检测的特点，被认为是更具应用前景的第三代法医学遗传标记。由于SNP基因座的检测对检材DNA的完整性要求不高，50～100bp的DNA片段就可以满足其分型的需要，从而为解决FFPET基因分型的难题提供了新的思路和途径。本研究以保证扩增产物片段长度小于100bp为基本条件，针对具有较高杂合度的SNP基因座（rs1454361）自行设计等位基因特异性引物，建立了检测rs1454361基因座多态性的等位基因特异性扩增（Allele Specific PCR，ASPCR）方法，调查了rs1454361基因座在辽宁汉族群体的频率分布；通过rs1454361基因座与D8S1179基因座对FFPET检材基因分型结果的比较，探讨采用短扩增子ASPCR技术对FFPET进行SNP分型的可行性与优越性，进而为解决此类高度降解DNA检材的基因分型问题开拓一种新的途径。材料与方法 1、选取3具冰冻尸体，分别取肺、骨骼肌、脑组织块按常规方法制作FFPET样品，同时取尸体心脏血液各2ml作为阳性对照；152例中国辽宁地区汉族无血缘关系个体血样。 2、采用短扩增子ASPCR技术建立rs1454361基因座分型系统，检测该基因座在中国辽宁地区汉族群体样本中的多态分布，直接计数法计算其基因型频率与等位基因频率，并进行Hardy—Weinberg平衡检验。采用PowerStatesV12软件计算其法医学应用指标。 3、采用紫外分光光度计与琼脂糖凝胶电泳对FFPET样本的DNA进行质量检测。 4、分别应用短扩增子ASPCR技术与PCR-STR技术对FFPET检材进行基因分型，并对两者的分型成功率与分型效果进行比较。结果 1、152例中国辽宁地区无血缘关系个体中：TT、TA和从三种基因型频率分别为0.2632、0.4671和0.2697；等位基因T的频率为0.4967，A为0.5033。采用x2检验法进行Hardy-Weinberg平衡检验的结果为：x2=0.657（P＞0.05）。采用PowerStatesV12软件统计分析结果：其杂合度为（H）0.467，个人识别几率（DP）为0.640，偶合几率（Pm）为0.360，非父排除率（PE）为0.160，多态信息含量（PIC）为0.375。 2、采用紫外分光光度计对FFPET样品进行检测，其OD260／OD286均分布在1.6～1.8。4张切片组的DNA模板浓度约140μg／ml～1g／ml，1张切片组的DNA模板浓度约20～80μg／ml。 3、琼脂糖凝胶电泳显示，FFPET的DNA片段长度主要分布于200bp以下，其中肺脏与骨骼肌FFPET样品的DNA在100bp附近有显亮条带，部分脑组织FFPET样品的DNA降解程度更加严重，片段长度主要分布于50bp以下。另外，在上样量相同的情况下，1张切片组D

关键词：单核苷酸多态性短扩增子 ASPCR 福尔马林固定石蜡包埋组织 rs1454361

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肿瘤纯度对结直肠癌二代基因测序结果的影响

肿瘤纯度对结直肠癌二代基因测序结果的影响

引用

作者：赵信禹天津医科大学

学位级别：硕士

目的:二代测序(Next-generation sequencing,NGS)是近年来发展的DNA序列检测技术,目前已广泛应用于结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)的精准治疗中。肿瘤纯度是制约NGS准确性的重要因素,但肿瘤纯度与CRC测序结果的关系有待进一步的探究... 详细信息

目的:二代测序(Next-generation sequencing,NGS)是近年来发展的DNA序列检测技术,目前已广泛应用于结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)的精准治疗中。肿瘤纯度是制约NGS准确性的重要因素,但肿瘤纯度与CRC测序结果的关系有待进一步的探究。故本课题利用30例CRC标本,对其进行显微镜下的精确取样,得到高纯度的肿瘤样本,进而探究肿瘤纯度对CRC的NGS结果的影响,提出适合于CRC的二代测序优化策略方法:本课题分为两个部分,第一部分通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库,验证CRC突变结果与肿瘤纯度间的关系。第二部分通过30例CRC石蜡标本进行进一步探讨。首先将CRC组织进行切片,然后将切片均匀分成精确取样组与常规取样组。常规取样组的切片直接进行消化,并通过酚-氯仿法获取DNA。精确取样组经过脱蜡水化,histogene染色,在镜下精确获取肿瘤细胞后,通过酚-氯仿法获取DNA样本。最后将DNA样本进行425基因的靶向NGS。最后对比两组间突变的差异,分析不同纯度下NGS的准确性,得出肿瘤纯度与NGS结果的准确关系。结果:TCGA数据库中CRC肿瘤纯度分布区间为[35%,95%]。结果显示,突变数目和突变基因的变异等位基因频率(Variant Allele Frequency,VAF)均与肿瘤纯度呈较为明显的正相关。接着通过本课题组的CRC标本的研究表明,精确取样后,不仅存在新出现的突变,同样也剔除了部分常规取样的突变。通过对比精确取样与常规取样间共同单核苷酸位点变异(Single Nucleotide Variants,SNV)与插入/缺失突变(Insertion-deletion,In Del)的VAF,我们发现精确取样后共同突变的VAF有着不同程度的提高,其中纯度为0-10%的样品最为显著。比较不同纯度下两组间的突变数目,我们发现当纯度为0-30%时,精确取样的突变数目要显著高于常规取样组,而在30%以上时,精确取样的突变数目与常规取样无显著性差异。同时我们对拷贝数变异(Copy number variant,CNV)进行探究,结果表精确取样组CNV的检出数量较常规取样组有增多趋势,且对于拷贝数扩增的基因,变异倍数也随着精确取样而显著提高。接着我们以精确取样后的组织为标准,探究不同纯度下NGS的准确性。我们定义两组共有突变称为真阳性突变,精确取样组特有的突变称为可疑假阴性突变,常规取样组特有的突变则成为可疑假阳性突变。定义假阴性比为可疑假阴性突变数/真阳性突变数,假阳性比为可疑假阳性突变数/真阳性突变数。通过对假阴性比与纯度进行相关性分析,我们发现假阴性比与肿瘤纯度呈显著负相关趋势。提示随着肿瘤纯度的提高,可疑假阴性突变增长的幅度也越小。对比可疑假阴性突变与真阳性突变的VAF分布,我们发现当纯度小于20%时,对可疑假阴性突变数量极大,且VAF广泛分布于20%-40%之间,而当纯度位于(20,30]时,仍有相当一部分可疑假阴性突变的VAF分布于10%-25%范围内,当纯度大于30%后,可疑假阴性突变主要分布于5%以下。以上结果提示当纯度大于30%时,可保证高频突变检测的完整性。通过对假阳性比与纯度进行相关性分析,我们发现假阳性比与肿瘤纯度无相关性差异。并且从可疑假阳性突变与真阳性突变的VAF分布中我们发现,可疑假阳性突变基本集中于5%以下。所以考虑可疑假阳性突变为测序中的误差现象。最后肿瘤突变负荷(Tumor mutation burden,TMB)也进行分析,我们发现,TMB在精确取样后也普遍提高,其中(0,30]范围内的标本变化最为显著,但无统计学差异。结论:***数据库中,我们发现CRC组织中突变数目、特定基因的VAF与肿瘤纯度呈明显量效关系。2.从本课题的30例CRC样本中,我们发现精确取样后突变基因的VAF显著提高,对于30%以下的肿瘤,精确取样后突变数目有着显著性提升。3.通过比较不同纯度下测序的准确性,我们发现当肿瘤纯度小于30%时,可保证高频突变检出的完整性,适用于临床的检测工作。4.肿瘤纯度对TMB亦有影响,但无显著性差异。

关键词：结直肠癌肿瘤纯度二代测序精确取样福尔马林固定石蜡包埋组织

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