检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2006年第12期37卷 1319-1322页

作者：李晓英王红宁黄勇柳萍胡慧琼白天四川农业大学动物科技学院动物预防医学生物工程实验室雅安625014 四川大学生命科学学院动物疾病防控生物工程研究中心四川大学"985工程"西南资源环境与灾害防治科技创新平台成都610064

将制备的禽传染性支气管炎脂质体／DNA疫苗和壳聚糖／DNA疫苗，分别以肌肉注射（i．m）和滴鼻、点眼（i．n）两种途径免疫健康雏鸡，以裸DNA疫苗为对照，采用流式细胞仪（FACS）及间接ELISA分别对免疫鸡外周血中CD4^＋、CD8^＋T淋巴细... 详细信息

将制备的禽传染性支气管炎脂质体／DNA疫苗和壳聚糖／DNA疫苗，分别以肌肉注射（i．m）和滴鼻、点眼（i．n）两种途径免疫健康雏鸡，以裸DNA疫苗为对照，采用流式细胞仪（FACS）及间接ELISA分别对免疫鸡外周血中CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞数及特异性IBV血清抗体IgG的动态变化进行检测，并于免疫后35d进行攻毒，结果显示：（1）CD4^＋T淋巴细胞数，所有试验组在免疫后1～3周左右均高于对照组（P〈0．01或P〈0．05），各试验组间，脂质体／DNA疫苗肌肉注射途径在免疫后10d后高于壳聚糖／DNA疫苗，但仅在第15天差异显著（P〈0．05），而滴鼻、点眼途径则相反；（2）所有试验组CD8^＋T淋巴细胞数仅在免疫后第15天与对照组差异显著（P〈0．05），各试验组间无显著差异；（3）所有组间特异性IBV血清抗体IgG动态变化差异不显著；攻毒后脂质体／DNA疫苗肌肉注射组无鸡只死亡，其他试验组有4％或8％死亡率，均显著低于对照组（12％）。由此可见，脂质体和壳聚糖均为DNA疫苗良好的佐剂或载体，且脂质体／DNA疫苗肌肉注射的免疫效果优于壳聚糖／DNA疫苗。

关键词：禽传染性支气管炎 DNA疫苗脂质体壳聚糖细胞免疫体液免疫

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禽传染性支气管炎病毒疫苗的研究进展

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中国兽医学报 2023年第10期43卷 2190-2196页

作者：李阳李挚邓钰蓱马淑慧徐刚天津农学院动物科学与动物医学学院天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室天津300392 中华人民共和国太原海关山西太原030006

禽传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)是由禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,疫苗接种仍是国内控制和预防此病的主要手段。由于IBV血清型众多,变异程度高,传统疫苗已... 详细信息

禽传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)是由禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,疫苗接种仍是国内控制和预防此病的主要手段。由于IBV血清型众多,变异程度高,传统疫苗已无法达到良好的防控效果,影响国内养禽业的发展。对现阶段IBV相关疫苗的种类及使用利弊进行综述,旨在为新型IBV疫苗的研发方向提供思路,为更好的预防和控制IB提供理论参考。

关键词：禽传染性支气管炎禽传染性支气管炎病毒疫苗预防控制

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禽传染性支气管炎病毒S1基因毕赤酵母表达载体的构建

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中国家禽 2006年第21期28卷 14-16,19页

作者：余祖华王红宁周生黄勇丁轲河南科技大学动物科技学院河南洛阳471003 四川农业大学大学动物科技学院四川雅安625014

本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列,去掉由18个氨基酸构成的信号肽后,设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物,利用RT-PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段,将该片段克隆到PMD18-T载体上,通过对所得到的重组质... 详细信息

本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列,去掉由18个氨基酸构成的信号肽后,设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物,利用RT-PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段,将该片段克隆到PMD18-T载体上,通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定,证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒,测序分析片段长为1566bp,已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点,并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性,IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBVS1蛋白提供了基础材料,并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。

关键词：禽传染性支气管炎 S1基因毕赤酵母表达载体

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禽传染性支气管炎流行动态与防控对策

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中国家禽 2016年第16期38卷 1-5页

作者：张小荣吴艳涛扬州大学兽医学院江苏扬州225009

禽传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度传染性的病毒性疾病。该病主要引起感染鸡呼吸道损伤,部分毒株可以引起严重的肾脏病变。... 详细信息

禽传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度传染性的病毒性疾病。该病主要引起感染鸡呼吸道损伤,部分毒株可以引起严重的肾脏病变。IBV也能在输卵管复制,成年母鸡感染后会对产蛋量和蛋品质造成较大影响,雏鸡感染后还会导致输卵管和卵巢发育异常,形成"假母鸡"。虽然疫苗免疫作为当前控制该病的最有效手段已被广泛应用于家禽生产,但长期以来该病在国内的流行并未得到有效控制,而且随着近年来我国家禽养殖规模的日益扩大,由该病所造成的损失也日益凸显,目前该病已经成为对我国养鸡业危害最严重的传染病之一。文章结合IBV分型技术、病原生物学特性和当前国内的流行动态对该病的防控对策进行简要的分析。

关键词：禽传染性支气管炎分型技术流行病学防控对策

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禽传染性支气管炎病毒M基因的克隆、序列分析及S1基因玉米表达载体的构建

禽传染性支气管炎病毒M基因的克隆、序列分析及S1基因玉米表达载...

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作者：李春四川农业大学

学位级别：硕士

本研究设计了一对引物M1/M2，通过RT-PCR的方法成功地扩增了8株IBV中国地方分离株SAIB4、SAIB6、SAIB9、SAIB14、SAIB20、SAIBWJ、SAIBRC、和SAIBRCHM基因的目的片段，并通过克隆、序列测定获得了8株分离毒株M基因的核苷酸序列，并在国... 详细信息

本研究设计了一对引物M1/M2，通过RT-PCR的方法成功地扩增了8株IBV中国地方分离株SAIB4、SAIB6、SAIB9、SAIB14、SAIB20、SAIBWJ、SAIBRC、和SAIBRCHM基因的目的片段，并通过克隆、序列测定获得了8株分离毒株M基因的核苷酸序列，并在国际基因库GenBank中注册，8株分离毒株M基因全长678bp-681bp，编码225-226个氨基酸残基。将M基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行比较的结果表明IBV分离株彼此间的核苷酸同源性为87.1％-100％，其相应的氨基酸序列的同源性为88.1％-100％。核苷酸序列前150bp的变异最大，不同毒株间存在插入、缺失及点突变等。M基因核苷酸系统进化树分析结果表明8株IBV分离株可分为2个基因群，SAIB4、SAIB6、SAIBWJ、SAIB14、SAIBRC和SAIBRCH属于Ⅰ群，与Mass型参考毒株的亲源关系较近，SAIB9和SAIB20属于Ⅱ群，其中SAIB20与Gray等肾型毒株亲缘关系较近。本研究选取具有代表意义的分离株SAIB14和SAIB4，设计了引物L1和L2，以其S1基因克隆质粒pUCSAIB14和pUCSAIB4为模板，用具有高保真度的pfu酶分别扩增到S1基因片段。把扩增产物分别通过ClaI和BamHI酶切纯化，连接到用ClaI和BamHI切去GFPml基因的中间表达载体pUGFPocs中，转化大肠杆菌JM109，在含Amp（100μg/ml）的LB抗性平板上筛选到了的阳性菌落。提取质粒通过酶切和PCR分析获得了中间载体重组质粒pUSAIB14和pUSAIB4；用KpnⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUSAIB14和pUSAIB4，回收Ubi-S1-Tocs片段，定向插入到pCAMBIA1300载体的多克隆位点，并转化大肠杆菌JM109，在含Kan（60μg/ml）的LB抗性平板上筛选到了阳性菌落，提取质粒通过酶切和PCR分析获得了玉米表达载体重组质粒pCUSAIB14和pCUSAIB4。IBV S1基因玉米高效表达载体的成功构建将为进一步进行IBV S1基因在玉米中的表达和免疫保护性研究打下了基础。

关键词：禽传染性支气管炎 M基因克隆序列分析S1基因玉米达载体

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禽传染性支气管炎病毒S1基因与猪IgGFc基因的克隆及在Hela细胞中的融合表达

禽传染性支气管炎病毒S1基因与猪IgGFc基因的克隆及在Hela细胞中...

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作者：张明富华中农业大学

学位级别：硕士

禽传染性支气管炎(IB)是由禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性烈性传染病，目前主要感染鸡，引起各种年龄的鸡发病，是严重影响养鸡业的重大传染病之一。IBV血清型众多，变异复杂，且新的变异株不断出现，给诊断和防制带来了很多... 详细信息

禽传染性支气管炎(IB)是由禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性烈性传染病，目前主要感染鸡，引起各种年龄的鸡发病，是严重影响养鸡业的重大传染病之一。IBV血清型众多，变异复杂，且新的变异株不断出现，给诊断和防制带来了很多困难。Spike(S)蛋白是IBV病毒粒子表面的囊膜纤突蛋白，在翻译后被宿主的蛋白酶切割成S1和S2两个部分，通过非共价键相连，裂解后的S1及S2都是糖蛋白。S1蛋白与细胞受体结合有关，决定病毒的组织嗜性，在病毒血清学分类中起主要作用。同时也是IBV的主要免疫原性蛋白，可以诱导中和抗体与血凝抑制抗体及特异性CTL反应。 IgG是介导体液免疫的主要抗体，多以单体形式存在，是动物自然感染和人工主动免疫后，机体所产生的主要抗体。IgG经木瓜蛋白酶水解后产生两个Fab片段和一个Fc片段。Fc片段是免疫球蛋白分子中重链的恒定区，决定了各类免疫球蛋白抗原特异性。各种用免疫球蛋白免疫动物产生的抗抗体(第二抗体)即是针对免疫球蛋白Fc片段的。这一特性让Fc片段在各种免疫学方法中有着举足轻重的地位。Fc还具有较强的与链球菌G蛋白(SPG)及金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)非特异性结合的特殊生物学特性，这使其成为一种蛋白质标签，在蛋白质鉴定和纯化等下游操作过程中得到了广泛应用。IgG免疫球蛋白在体内半衰期较长，Fc段上更具有抗原提呈细胞受体而易被抗原提呈细胞(APC)所摄取，且安全无毒性。因此将目的基因与IgGFc基因进行融合表达不仅有利于蛋白质纯化鉴定，为研究蛋白质的互作提供了方便，同时表达产物比单纯目的基因表达产物具有更强的免疫原性，这也预示着一种IgGFc有望成为一种分子佐剂，在基因工程疫苗研究中发挥更大的作用。本研究克隆并融合表达鸡IBV S1基因与猪IgG Fc基因，旨在以猪IgG Fc片段作为IBV S1的蛋白质标签，以期进一步通过SPA或SPG与IgG Fc的结合及S1蛋白与细胞受体的特异性结合，利用亲合层析或免疫共沉淀法，进行IBV细胞受体的分离与鉴定。主要研究内容包括： 1、猪IgG Fc段基因、禽传染性支气管炎病毒S1基因的克隆与序列分析本研究根据Gen Bank收录的M41型IBV S1序列、猪IgG重链序列分别设计并合成了IBV S1和IgG Fc的特异性引物。从猪肝脏中提取总RNA，利用RT—PCR方法扩增了猪IgG Fc基因，同时扩增了IBV S1基因。将二者分别克隆到pMD18—T载体。用相应的酶切鉴定后，挑阳性子送TaKaRa测序。结果表明，

关键词：禽传染性支气管炎 S1蛋白 IgG Fc 融合表达

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禽传染性支气管炎病毒S1蛋白与HSP90AB1的相互作用研究

禽传染性支气管炎病毒S1蛋白与HSP90AB1的相互作用研究

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作者：方承秀浙江大学

学位级别：硕士

禽传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是由禽传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitis virus，IBV）引起的一种急性传染病，严重影响国内外养禽业的发展。IBV有多种血清型，而且新的变异型不断出现，给传染性支气管炎的诊... 详细信息

禽传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是由禽传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitis virus，IBV）引起的一种急性传染病，严重影响国内外养禽业的发展。IBV有多种血清型，而且新的变异型不断出现，给传染性支气管炎的诊治带来极大困难。IBV的S蛋白是IBV入侵宿主细胞的重要蛋白。在感染过程中，S1蛋白主要负责与细胞表面受体结合，S2蛋白则在IBV吸附细胞后负责介导细胞膜融合。IBV的受体尚不明确，本论文开展IBV S蛋白与宿主细胞蛋白的互作研究，试图寻找IBV受体。　　首先我们用鸡胚肾细胞（CEK细胞）适应的IBV野毒株JH06011（JH06011-CEK）感染CEK细胞，确定病毒感染CEK的最佳时间点为感染后36h。在感染的最佳时间点收获JH06011-CEK感染的CEK细胞，抽提细胞膜蛋白，利用IBV S蛋白鼠单克隆抗体和鼠IgG进行IP实验。银染结果显示在25kD、45kDa、70kDa、110kDa、170kDa处出现与对照组相比的特异性条带。结合WB结果，排除110kDa处和170kDa处的条带分别为IBV S1蛋白和S蛋白。随后，将剩余三处特异性条带切下后进行质谱鉴定，质谱鉴定结果表明条带中存在HSP90AB1、EIF4A3、HSP70等多个蛋白。　　我们筛选HSP90AB1进一步研究其与IBV的互作关系。通过实验证明HSP90AB1与真核转染表达的JH06011-S1-RBD（Receptor binding domain）以及M41、H120、Beaudette、QX毒株的RBD都存在互作关系。另外，利用IBV感染CEK细胞进行IP实验，证明内源性的IBV S1与HSP90AB1也存在互作。激光共聚焦实验结果表明HSP90AB1蛋白与IBV-RBD都在细胞膜上有表达，且存在共定位现象。Gst-pull-down实验进一步证明HSP90AB1蛋白与IBV-RBD的互作属于直接互作。以上结果提示HSP90AB1蛋白可能在不同IBV毒株感染宿主细胞过程中均扮演着重要的角色。采集1日龄雏鸡的心、肝、脾、肺、肾组织，抽提RNA反转录后利用qPCR检测HSP90AB1蛋白在不同组织中的表达情况。结果表明HSP90AB1蛋白在肾脏中的表达水平最高，该现象是否与IBV肾组织嗜性相关需要进一步研究。　　为了进一步探究HSP90AB1是否对IBV入侵有影响，又是产生何种影响，我们在293T和VERO细胞中通过转染真核表达质粒过表达了HSP90AB1。在4℃条件下将IBV与过表达细胞进行孵育，检测过表达HSP90AB1对病毒吸附的影响。结果显示HSP90AB1的过表达提高了吸附病毒mRNA与蛋白的含量，显著促进IBV与细胞的吸附结合。同时我们在敲低HSP90AB1的H1299细胞上进行相似实验，结果显示HSP90AB1的敲低抑制了IBV与细胞的吸附。结果表明HSP90AB1对于IBV的吸附过程发挥着重要的作用。我们利用HSP90AB1的商品化抗体预处理宿主细胞，实验结果显示，抗体的预处理可以显著抑制IBV与宿主细胞的吸附;另外我们利用HSP90AB1的重组蛋白预处理IBV病毒液，实验结果显示，IBV病毒液的预处理也可以显著抑制IBV与宿主细胞的吸附。这些实验表明HSP90AB1是IBV入侵细胞过程中重要的宿主蛋白。为了进一步验证HSP90AB1蛋白是否为IBV的功能性的受体，我们利用IBV非易感细胞——人肾上皮细胞系（293T细胞）建立了过表达HSP90AB1的细胞系并进行IBV传代实验，发现IBV不能在HSP90AB1过表达的非易感细胞系中连续传代。　　综上所述，我们的研究成功鉴定出HSP90AB1蛋白为IBV S1相互作用的蛋白，并且可以与多个IBV毒株的S1发生互作，同时胞膜上的HSP90AB1可以促进IBV与宿主细胞的结合。该研究为今后进一步探讨HSP90AB1在IBV感染过程发挥的作用，理解IBV在感染宿主过程中的致病机理奠定了基础。

关键词：禽传染性支气管炎病毒感染 S1蛋白 HSP90AB1蛋白相互作用

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禽传染性支气管炎病毒M基因自杀性DNA疫苗及免疫效应研究

禽传染性支气管炎病毒M基因自杀性DNA疫苗及免疫效应研究

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作者：向菁四川农业大学

学位级别：硕士

自杀性DNA疫苗是指将引起免疫应答的目的基因片段插入以甲病毒为基础的质粒载体构建而成的一种新型DNA疫苗，它可引起宿主细胞调亡，并且通过抗原的高效表达刺激机体产生免疫应答，是更为安全有效的基因工程疫苗。鸡传染性支气管炎病毒... 详细信息

自杀性DNA疫苗是指将引起免疫应答的目的基因片段插入以甲病毒为基础的质粒载体构建而成的一种新型DNA疫苗，它可引起宿主细胞调亡，并且通过抗原的高效表达刺激机体产生免疫应答，是更为安全有效的基因工程疫苗。鸡传染性支气管炎病毒重要免疫原基因之一的M基因上存在重要的抗原决定簇，且具有高度保守性。M基因与病毒的复制有关，大小约700bp。已有的IBV疫苗文献报道中关于M基因免疫效应的研究较少。本研究通过PCR扩增在两端引入BamHⅠ酶切位点，经酶切插入自杀性DNA疫苗载体pSCA1，构建了自杀性DNA疫苗pSCA1一M质粒，经由菌落PCR、酶切及测序鉴定目的基因被成功克隆至自杀性DNA疫苗载体pSCA1，且方向正确。以1：20的配比加入脂质体作佐剂，制备了IBV M基因的自杀性DNA疫苗。分别取等量的重组质粒pSCA1-M、常规IBV M基因DNA疫苗质粒pcDNAM、空载体pSCA1转染Veto细胞。48h后经间接免疫荧光试验观察发现，pSCA1-M以及pcDNAM转染组细胞浆均可见特异性亮绿色荧光，pSCA1空载体组无荧光为阴性。证实自杀性DNA疫苗载体能成功表达M基因。为评价IBV自杀性DNA疫苗的免疫效应，分别用构建的自杀性DNA疫苗pSCA1-M、常规DNA疫苗pcDNAM、空载体pSCA1和IBV灭活疫苗免疫非免疫原健康雏鸡，对照组注射PBS液。自免疫后每周采血分离血清连续五周，采用间接ELISA试验检测血清特异性抗体IgG，结果表明：自杀性DNA疫苗产生针对IBV的特异性血清抗体，免疫后第三周上升到峰值，随后开始下降，其抗体水平与常规IBV DNA疫苗相当，低于灭活疫苗。用流式细胞仪（FACS）测定各组CD3+、CD4+、CD8+动态变化，结果显示：自杀性DNA疫苗pSCA1-M组CD3+、CD4+、CD8+各T淋巴细胞数量平均水平均高于其余各组，在各个时间点均表现为差异显著（P＜0.01或P＜0.05）。但在第4周左右有一个明显的下降，之后又回升。说明自杀性DNA疫苗能诱导机体产生高水平的细胞免疫。攻毒保护试验结果表明：pSCA1-M组共5只鸡发病死亡，攻毒保护率为75％；pcDNAM组免疫鸡只保护率低于pSCA1-M，为65％；空载体组和PBS组共10只鸡发病死亡；灭活苗组无鸡只发病。本研究采用IBV M基因构建自杀性DNA疫苗对鸡进行免疫，并对其免疫效果进行评价，在国内外还未见报道。可为研制IBV自杀性DNA疫苗提供了基础材料和科学依据。

关键词：禽传染性支气管炎 M基因自杀性DNA疫苗细胞免疫体液免疫

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禽传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及其特性研究

禽传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及其特性研究

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作者：王芳中国农业科学院

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis, IB)，也叫禽传染性支气管炎(Avain InfectiousBronchitis)，由冠状病毒属(coronavirus)的成员鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis virus,IBV)引起，是一种急性高度接触性的病毒性传染病，常引起鸡业严重的经济损失。感染鸡只主要表现呼吸道、消化系统和泌尿生殖系统的疾患。Schalk和Hawn于1931年首次报道了该病，其后IBV不断地发展、变异，目前已出现100多种血清型。由于不同血清型毒株之间交叉保护力弱，给IB的诊断及防治带来了极大的困难。通过单克隆抗体技术对IBV抗原表位的研究，不但可以深入了解IBV的抗原结构，而且便于设计科学合理的表位疫苗和诊断试剂，对IB的诊治具有重要的意义。本研究将IBV ck/CH/LDL/091022作为免疫原，免疫6～8周龄BALB/c小鼠，采用传统细胞融合技术，经过Western blot、间接ELISA以及有限稀释法筛选克隆后，最终获得2株能够稳定分泌针对IBV的单克隆抗体(MonoclonalAntibody, ＭAb)的杂交瘤细胞株，分别命名为MAb2F2和MAb3G9。MAb2F2和MAb3G9的重链均为IgG1、轻链均为к。Western blot和ELISA检测结果显示2株单抗均能与ck/CH/LDL/091022以及其他几种血清型毒株反应。MAb2F2与毒株反应的特异性条带大小为45kDa，MAb3G9与毒株反应的特异性条带大小为90kDa。通过制备IBVN蛋白和S1蛋白的重组蛋白并用该蛋白与2株单克隆抗体进行反应，结果表明MAb2F2为抗IBVN蛋白的单克隆抗体，MAb3G9为抗IBV S1蛋白的单克隆抗体。为了进一步对MAb2F2识别的抗原表位进行精确定位，以研究该表位在不同型IBV中的保守性或变异特点，以便为进一步研发诊断方法或诊断试剂提供依据，本实验设计了23段具有部分重叠的，带GST标签且覆盖N蛋白的短肽，利用Pepscan技术原理，通过Western blot和ELISA检测方法，最终鉴定出MAb2F2识别的表位序列为397INWGDSAL404。通过将不同毒株与单克隆抗体进行Western blot，同时分析已报道病毒的对应序列，结果显示该表位反应原性较好，且表位序列在大部分冠状病毒毒株中均保守。由于S1亚基与IBV中和活性有关，因此为了探究MAb3G9的中和活性，本研究采用固定血清稀释病毒的方法，对MAb3G9进行中和活性检测，结果显示MAb3G9的中和指数为117，中和活性较高。该抗体可作为进一步研发IBV诊断试剂或治疗制剂的候选抗体。

关键词：禽传染性支气管炎 S1蛋白 N蛋白单克隆抗体抗原表位

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禽传染性支气管炎病毒一步法RT-PCR检测试剂盒的研制及应用

禽传染性支气管炎病毒一步法RT-PCR检测试剂盒的研制及应用

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作者：潘盛四川农业大学

学位级别：硕士

本实验对异硫氰酸胍一步法、Trizol试剂法和RNA抽提试剂盒法三种不同的病毒RNA提取方法做了对比试验，用紫外光检测RNA纯度和电泳检测RNA的完整性的方法对三种提取方法作为评价指标，以找出适合禽传染性支气管炎病毒RNA提取方法。结果... 详细信息

本实验对异硫氰酸胍一步法、Trizol试剂法和RNA抽提试剂盒法三种不同的病毒RNA提取方法做了对比试验，用紫外光检测RNA纯度和电泳检测RNA的完整性的方法对三种提取方法作为评价指标，以找出适合禽传染性支气管炎病毒RNA提取方法。结果表明：三种RNA提取方法的对比实验表明三种方法中，异硫氰酸胍一步法提取的RNA样品纯度不高，且不完整；Trizol试剂法和RNA抽提试剂盒法提取的RNA样品纯度和完整性都较理想，两者提取效果差异不显著，考虑到成本的因素，本研究选用Trizol试剂法做为今后的RNA提取方法；通过在IBV非结构基因3abc的保守区域设计一对引物，对引物的特异性进行检验；建立和优化了一步法RT-PCR，在此基础上组装成一步法RT-PCR检测试剂盒。引物的特异性实验表明，用该引物对IBV分离株和IBV标准株检测成阳性，而对IB DNA疫苗和鸡相关病原体检测呈阴性，阳性产物回收后测序表明，扩增出的阳性片段为IBV的3abc基因。通过对8株IBV国内分离株和3株国内标准株以及IB DNA疫苗（S1、M和N三基因混合）和4株鸡常见病原体的检测来检验试剂盒的特异性。结果表明，试剂盒对IBV分离株和IBV标准株检测成阳性，而对IB DNA疫苗和鸡相关病原体检测呈阴性；用试剂盒对不同浓度的病毒RNA模板进行检测来检验试剂盒的灵敏度结果表明：试剂盒最低可以检测出浓度为10-3ng／μl的IB病毒RNA模板；通过在试剂盒组装后的6个月内定期用试剂盒对IBV毒株、IB DNA疫苗和鸡常见病原体的检测，来检验试剂盒的稳定性和重复性，结果表明：6个月后，试剂盒的稳定性未下降，具有较好的灵敏度和特异性。用一步法RT-PCR试剂盒、两步法RT-PCR和ELISA方法对人工感染鸡进行对比检测。结果表明：试剂盒和两步法RT-PCR均能特异地检测出IBV，试剂盒比两步法RT-PCR节省了1.5小时的检测时间，并节约了成本，减少了试剂污染的可能。试剂盒和ELISA方法均能特异地检测出IBV，试剂盒比ELISA方法提前36小时检测出IBV。试剂盒对IB DNA疫苗免疫鸡、人工IBV感染鸡和自然感染病例进行检测。结果表明，试剂盒对IB DNA疫苗免疫的检测全部呈阴性；试剂盒可以对人工IBV感染鸡

关键词：禽传染性支气管炎一步法RT-PCR 检测试剂盒

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