检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医学报 2023年第10期43卷 2190-2196页

作者：李阳李挚邓钰蓱马淑慧徐刚天津农学院动物科学与动物医学学院天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室天津300392 中华人民共和国太原海关山西太原030006

禽传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)是由禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,疫苗接种仍是国内控制和预防此病的主要手段。由于IBV血清型众多,变异程度高,传统疫苗已... 详细信息

禽传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)是由禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,疫苗接种仍是国内控制和预防此病的主要手段。由于IBV血清型众多,变异程度高,传统疫苗已无法达到良好的防控效果,影响国内养禽业的发展。对现阶段IBV相关疫苗的种类及使用利弊进行综述,旨在为新型IBV疫苗的研发方向提供思路,为更好的预防和控制IB提供理论参考。

关键词：禽传染性支气管炎禽传染性支气管炎病毒疫苗预防控制

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

禽传染性支气管炎病毒非结构蛋白16的生物学功能研究

禽传染性支气管炎病毒非结构蛋白16的生物学功能研究

引用

作者：王真长江大学

学位级别：博士

禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起禽类传染性支气管炎,严重影响禽类养殖业的发展。IBV属于冠状病毒科γ冠状病毒属,为正向单链RNA病毒,基因组大小约为27.6kb。IBV与其它冠状病毒编码的非结构蛋白16(nsp16)具... 详细信息

禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起禽类传染性支气管炎,严重影响禽类养殖业的发展。IBV属于冠状病毒科γ冠状病毒属,为正向单链RNA病毒,基因组大小约为27.6kb。IBV与其它冠状病毒编码的非结构蛋白16(nsp16)具有2’-O-甲基转移酶(2’-O-MTase)活性,与病毒免疫逃逸机制相关。冠状病毒nsp16酶活性中心均由保守的赖氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-谷氨酸(KDKE)四个氨基酸残基组成,将其中的D突变为A(丙氨酸)会导致nsp16 2’-O-MTase活性的丧失。本研究旨在利用反向遗传学方法,对IBV nsp16 2’-O-MTase活性中心的D128氨基酸进行突变,使其2’-O-MTase活性丧失,构建并获得含IBV nsp16点突变D128A的重组病毒,通过生物学特性分析和转录组学分析,明确IBV nsp16的生物学功能。结果如下:1、以IBV-P65为遗传背景,利用已建立的IBV反向遗传学方法,分别构建并获得了重组病毒rIBV和含IBV nsp16点突变D128A的重组病毒IBV-D128A。2、以rIBV为对照病毒,通过噬斑试验,病毒生长曲线测定,RT-PCR及Western blot比较分析IBV-D128A的生物学特性。实验结果如下:(1)噬斑试验结果显示感染Vero细胞5d后,IBV-D128A的噬斑平均直径为0.54±0.12 mm,而rIBV的噬斑直径为1.20±0.23 mm,表明突变体病毒D128A的致病力明显降低;(2)两种病毒感染Vero细胞呈现出相似的生长走势,其滴度均在感染24h时达到峰值,但在相同的感染时间点,IBV-D128A的滴度均低于rIBV;(3)半定量RT-PCR检测两种病毒分别感染Vero细胞24h、36h、48h后病毒RNA的合成量,发现rIBV与IBV-D128A的RNA相对表达量比值为1.70、1.43和1.28,表明感染相同的时间,IBV-D128A的核酸表达量低于rIBV;(4)Western blot检测两种病毒感染Vero细胞24 h和36 h后病毒纤突蛋白(spike protein)的表达量,发现感染同样的时间,IBV-D128A的蛋白表达量略低于rIBV。上述结果表明,IBV nsp16的2’-O-MTase酶活性并非为IBV复制所必需,但点突变D128A引起的该酶酶活性的丧失会导致病毒复制降低,致病力明显减弱。3、为了了解IBV感染对宿主基因表达的调控作用,RT-PCR检测rIBV与IBV-D128A分别感染H1299和DF-1细胞相同时间后细胞因子或其它抗病毒基因的表达情况。结果表明两种病毒感染H1299细胞后,细胞内β干扰素IFN-β、白细胞介素6(IL-6)和8(IL-8)的表达未见明显变化。但两种病毒感染DF-1细胞后,发现很多细胞因子或蛋白如IFNγ、IFNα、信号传导子及转录激活子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)、干扰素刺激基因12(Interferon-stimulated gene 12,ISG12)、SOCS3(suppressor of cytokine signaling)、OASL(2′-5′-oligoadenylate synthetase-like)、RSAD2(radical S-adenosylmethionine domain containing 2)、IFITM1(IFN-induced protein with tetratricopeptide repeats 1)都有不同程度的表达,其中,两种病毒感染能上调DF-1细胞IFNγ、STAT1、SOCS3、OASL和RSAD2的表达。结果表明IBV感染DF-1细胞能激活IFNγ信号通路,继而诱导抗病毒相关基因SOCS3、OASL和RSAD2的表达。4、为了明确IBV-D128A致病力降低的机制,揭示2’-O-MTase生物学功能,我们对IBV-D128A和rIBV病毒分别感染DF-1细胞24 h后的RNA样品进行了转录组学分析。结果显示:(1)rIBV和IBV-D128A分别感染DF-1细胞24h后,差异表达的基因(DEG)总共有883个,其中IBV-D128A感染上调的基因有487个,下调的基因有396个;(2)对差异表达基因进行数据库的功能注释,总共得到注释的基因有799个,具体注释到相应功能数据库的类别及个数分别为:COG为292个、GO为725个、KEGG为491个、KOG为531个、NR为777个、Swiss-prot为749个、eggNOG为785个;(3)883个差异表达基因中有725个注释到生物学过程(Bio

关键词：禽传染性支气管炎病毒非结构蛋白16 2’-O-甲基转移酶转录组学分析生物学功能

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

禽传染性支气管炎病毒S2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

引用

中国预防兽医学报 2023年第9期45卷 942-950页

作者：李忠斐周建卫张焕东彭莉颜焰周继勇廖敏农业农村部动物病毒学重点实验室浙江杭州310058 浙江大学动物医学中心浙江杭州310058

为制备禽传染性支气管炎病毒(IBV) S2蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达并纯化重组S2蛋白,将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到4株能够稳定分泌S2蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1A7、4F12、4A7、4D1。亚类... 详细信息

为制备禽传染性支气管炎病毒(IBV) S2蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达并纯化重组S2蛋白,将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到4株能够稳定分泌S2蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1A7、4F12、4A7、4D1。亚类鉴定结果显示4株MAb的重链均为Ig G1,轻链均为κ。采用间接ELISA法检测上清及腹水效价,结果显示MAb细胞上清效价均不低于1∶12 800,腹水效价均不低于1∶51 200。采用western blot检测制备的S2蛋白MAb与IBV感染鸡胚尿囊液后天然表达的S2蛋白的反应原性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测IBV感染非洲绿猴肾细胞(Vero)后天然表达的S2蛋白的反应原性。Western blot结果显示,感染IBV的鸡胚尿囊液中出现了90 ku左右的特异性条带;IFA结果显示,感染IBV的Vero细胞中出现绿色荧光。以上结果表明,制备的S2蛋白MAb能够与天然表达的S2蛋白反应,反应原性较强。利用间接ELISA检测MAb与S2蛋白的亲和力,结果显示4株MAb对S2蛋白均有良好的亲和力。利用一系列表达部分重叠的重组S2片段并经western blot鉴定4株MAb识别的抗原表位,结果显示,1A7、4F12、4A7 MAb识别的抗原表位是^(69)VQINCLQYVCGSSLECRKLFQQ^(90),4D1MAb识别的抗原表位是^(175)YKKCTAGPLGTLKDLI^(190)。采用IFA检测MAb的中和活性,结果显示,4株MAb均不具有中和活性。通过western blot检测MAb的反应谱,结果显示,MAb均能够与所选不同基因型(GI-1、GI-7、GI-13、GI-19、GI-22、GI-23) IBV发生特异性反应,表明制备的MAb反应谱较广。本研究为进一步探究IBV S2蛋白的功能及病毒致病机制奠定了基础。

关键词：禽传染性支气管炎病毒 S2蛋白单克隆抗体抗原表位

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

禽传染性支气管炎病毒基因双顺反子DNA疫苗及mRNA3的分子特性研究

禽传染性支气管炎病毒基因双顺反子DNA疫苗及mRNA3的分子特性研究

引用

作者：唐梦君四川农业大学

学位级别：博士

1、本研究采用PCR扩增获取鸡的IL-2、IL-18基因,将其插入pMD18-T载体中进行测序鉴定。对含有S1、M、N目的基因的pIBVS1、pIBVM、pIBVN质粒进行测序分析。结果表明,IL-2、IL-18、S1、M、N基因全长分别为432bp、536bp、1671bp、678bp和123... 详细信息

1、本研究采用PCR扩增获取鸡的IL-2、IL-18基因,将其插入pMD18-T载体中进行测序鉴定。对含有S1、M、N目的基因的pIBVS1、pIBVM、pIBVN质粒进行测序分析。结果表明,IL-2、IL-18、S1、M、N基因全长分别为432bp、536bp、1671bp、678bp和1230bp,鉴定的目的基因正确。以pDsRed-Express-N1载体为骨架,以内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site)序列为连接元件构建绿色和红色荧光基因的双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red,转染Vero细胞后观察到绿色和红色荧光基因均获得表达。构建的pIRES-EGFP/Red载体含有卡那霉素抗性基因,比含有氨苄抗性的双顺反子载体具有更高的生物安全性,为今后开展各种病原微生物双顺反子DNA疫苗的研制提供研究工具。 2、用S1、M、N基因与IL-2、IL-18基因分别替换pIRES-EGFP/Red质粒中的荧光基因,构建双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL2、pIPES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIPES-M/IL18和pIRES-N/IL18及其单基因表达质粒,转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测质粒在体外的表达。RT-PCR检测表明转染了重组质粒的Vero细胞中均能特异的扩增出S1、M、N和(或)IL-2、IL-18基因片段;间接免疫荧光检测表明,转染了重组质粒的细胞显示出黄绿色荧光,而转染了空质粒的细胞则没有显示出任何特异荧光。本研究为IBV结构基因和细胞因子双顺反子DNA疫苗免疫试验提供了材料。 3、采用本课题组获得专利(专利号为200410081443.4)的质粒提取、纯化方法制备质粒,将质粒溶液(1mg/mL)与脂质体溶液(10mg/mL)等体积混合配制成DNA疫苗。将配制的DNA疫苗通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡,28日龄加强免疫一次。分别在免疫前和免疫后7、14、21、28、35d采血检测ELISA抗体效价和外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量。二免后两周用IBV强毒进行攻毒。ELISA抗体水平结果显示:pIRES-S1/IL2、pIPES-M/IL2、pIRES-N/IL2疫苗组产生的抗体水平高于pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N疫苗组,在免疫后14-35d,差异显著(P＜0.05);pIRES-M/IL18、pIPES-N/IL18疫苗组产生的抗体水平也高于pIpES-M、pIRES-N疫苗组,在免疫后14-35d,差异显著(P＜0.05),pIRES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组产生的抗体水平与pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18疫苗组相比在免疫后21-35d差异显著(P＜0.05):外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2疫苗组在免疫后7-28d,与pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N疫苗组相比差异显著(P＜0.05),pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18疫苗组在免疫后14-28d CD3+、CD4+T、CD8+T淋巴细胞亚群的数量高于pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N疫苗组,差异显著(P＜0.05)。pIRES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量较pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18 DNA疫苗组高,但差异不显著(P＞0.05)。攻毒结果表明,双顺反子DNA疫苗组的保护率介于65%～85%,其中RES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组的保护率分别为85%和75%,高于混合质粒pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18 DNA疫苗组的70%和60%。其中pIRES-S1/IL2疫苗组的保护率85%高于灭活疫苗组的攻毒保护率75%。本研究研制出的IBV结构蛋白与IL-2、IL-18双顺反子DNA疫苗,为提高IBV DNA疫苗的免疫效率提供了新的途径。 4、采用RT-PCR获取IBV E基因,用以替换pIRES-M/Red质粒中的红色荧光基因,构建双顺反子表达质粒pIRES-M/E,转染Vero细胞后进行表达检测。采用本论文第三章的方法制备DNA疫苗和进行动物免疫试验。结果表明:在免疫后7-35d,pIRES-M/E免疫组产生的抗体水平及外周血T淋巴细胞亚群数量高于pIRES-M组,但差异不显著(P＞0.05)

关键词：禽传染性支气管炎病毒双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/DsRed 禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因鸡白介素2基因鸡白介素18基因 DNA疫苗

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究

禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究

引用

作者：田浪四川农业大学

学位级别：博士

禽传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是危害养鸡生产重要的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)血清型众多,不同血清型之间交叉保护力弱,而常规疫苗常引起IB的免疫失败。因此,从基因... 详细信息

禽传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是危害养鸡生产重要的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)血清型众多,不同血清型之间交叉保护力弱,而常规疫苗常引起IB的免疫失败。因此,从基因水平上研制DNA疫苗等新型基因工程疫苗,对提高IBV免疫保护具有重要意义。在前期研究基础上,本研究对IBV肾型SAIBk株结构蛋白的抗原表位进行系统分析预测,筛选出IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位片段,构建含鸡属特异性CpG基序的IBV多表位嵌合基因,将嵌合基因进行原核表达并建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法,构建了多表位嵌合基因的真核表达质粒,并结合禽白细胞介素分子佐剂对其免疫效果进行了比较研究,为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。 1、采用生物信息学软件及相关网站分析IBV S1、S2和N结构蛋白的二级结构、B细胞表位(主要是中和抗原表位)和T细胞表位(主要是CTL抗原表位),同时结合文献研究报道,共筛选出IBV抗原表位区域7段F1-F7(S1:24-150AA、240-255AA、290-400AA、532-537AA;S2:1-65AA;N:1-120AA、N:290-410AA)。以柔性肽GP或GA作为Linker将7个抗原表位基因依次串联成一条全新的多表位嵌合基因F。嵌合基因5'端引入Kozak序列,3'端引入鸡属特异性CpG免疫刺激基序,分析表明,构建的IBV多表位嵌合基因F有良好的亲水性、柔性及抗原性等。本研究对IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位进行系统预测分析,成功构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因,分析表明该嵌合基因编码蛋白有良好的亲水性和抗原性等,国内外未见报道,该研究丰富了IBV结构蛋白生物信息学资料,为IBV多表位嵌合基因的原核表达、ELISA方法建立,以及DNA疫苗的制备提供了基础材料。 2、将IBV结构蛋白多表位嵌合基因F片段用BamHI和XhoI双酶切后亚克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化*** Rosetta,采用IPTG进行诱导,研究表明嵌合基因F编码的蛋白以包涵体形式融合表达,Western-blots显示,该融合蛋白能与抗IBV阳性血清发生特异性反应。通过优化重组质粒的表达条件,确定了嵌合基因F的重组蛋白表达的最佳IPTG诱导物浓度为1 mmol/L,诱导时间为3 h,诱导温度为30℃。以纯化的融合重组蛋白为抗原包被酶标板,筛选出重组抗原最佳包被浓度为20μg/mL,抗体最佳稀释度1∶40,酶标二抗(HRP标记兔抗鸡IgG)最佳稀释度1∶3000,血清样品阴阳性临界值为0.133,建立了以嵌合基因重组蛋白为诊断抗原的IBV抗体间接ELISA方法。本研究将IBV多表位嵌合基因进行原核表达研究,表达产物有良好免疫反应活性,建立了以IBV多表位嵌合蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,该方法安全、灵敏度高(血清稀释度可达1∶300)、特异性强,优于常规的IBV抗体检测方法,国内外未见报道,为IBV抗体的检测提供了新的方法。 3、将IBV多表位嵌合基因F分别亚克隆进真核表达载体pcDNA3.1、pVAX1、VR1020中,构建了禽白细胞介素IL-1β、IL-2、IL-18基因的pcDNA3.1真核表达质粒。重组质粒经酶切和测序鉴定后,通过脂质体转染COS-7细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测重组真核质粒在体外的表达。重组质粒经酶切和测序表明IBV多表位嵌合基因F、禽白细胞介素的真核表达质粒构建正确。RT-PCR检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F、pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-18的COS-7细胞中均能扩增出特异性的目的基因片段;间接免疫荧光检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F的COS-7细胞显示出特异性绿色荧光。本研究构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的真核表达质粒,检测表明真核质粒表达的IBV多表位嵌合蛋白有良好的免疫反应性,国内外未见报道,为IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的研制提供了试验材料。 4、采用本课题组获得专利(专利授权号为200410081443.4)的质粒提取纯化方法制备IBV结构蛋白多表位嵌合基因及禽白细胞介素真核表达重组质粒,将纯化的重组质粒溶液(1mg/mL)与脂质体溶液(10mg/mL)等体积混合配制成DNA疫苗,通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡,21日龄加强免疫一次,二免疫后7、14、21、28采血检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量和ELISA抗体效

关键词：禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因 ELISA抗体检测 DNA疫苗免疫效果

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

禽传染性支气管炎病毒分离株的全基因组及S1、M、N基因DNA疫苗研究

禽传染性支气管炎病毒分离株的全基因组及S1、M、N基因DNA疫苗研究

引用

作者：周生四川农业大学

学位级别：博士

禽传染性支气管炎(IB)呈世界广泛流行，是危害养鸡生产最严重的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒(IBV)很容易发生变异，导致新的变异株不断出现，且不同毒株之间交叉保护力弱，使该病经常在免疫和非免疫的禽群爆发，造成了... 详细信息

禽传染性支气管炎(IB)呈世界广泛流行，是危害养鸡生产最严重的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒(IBV)很容易发生变异，导致新的变异株不断出现，且不同毒株之间交叉保护力弱，使该病经常在免疫和非免疫的禽群爆发，造成了严重的经济损失。在前期工作基础上，本研究对IBV肾型分离株SAIBk株的全基因组和11株分离株的3′端非编码区进行了序列测定和分析，并进一步构建了SAIBk株S1、M、N基因的荧光融合表达质粒并在细胞中进行表达研究，在此基础上构建了S1、M、N基因的真核表达质粒并对其免疫原性进行了比较研究，为从分子水平研究IBV的流行进化及研制预防和控制IB的DNA疫苗奠定基础。 1．选择具有一定代表性的IBV致肾病变型分离株SAIBk株，采用RT-PCR方法将其基因组分19个片段进行了扩增、测序及分析。结果表明：SAIBk株能引起鸡胚矮化，形成侏儒胚;其病毒经蔗糖密度梯度离心纯化后，在电镜下可观察到典型的冠状病毒粒子;SAIBk株基因组全长27520bp，核苷酸组成中A+T的含量占61.74％;具有典型的冠状病毒基因组结构，其528-20410位为RNA依赖的RNA聚合酶基因，编码两个多聚蛋白ORF1a和ORF1b，20361-27155位主要编码病毒的各种结构蛋白，包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白;SAIBk株与Beaudette、Mass41、Ca199、BJ、KQ6基因组序列的同源率介于85.6％-87.6％之间;不同区域的同源性比较结果表明，3′UTR和5′UTR是基因组中最为保守的区域，同源率介于90％-98％之间，而S1基因是基因组中变异最大的区域，同源率介于74.8％-83.2％之间。本试验在国内外首次对IBV肾型分离株的基因组全序列进行了测定，丰富了冠状病毒的生物信息数据库，为进一步研究该病的分子流行病学和DNA疫苗奠定了基础。 2．选择11株IBV分离株，采用RT-PCR方法对其3′端非编码区进行了测序及分析。结果表明：11株分离株3′端非编码区的PCR扩增片断长度介于328bp—512bp之间;将11株分离株与Genbank上登录的15个毒株的序列进行比较分析，表明3′非编码区存在大量的碱基插入和缺失，不同毒株之间碱基数目最大相差208bp;根据不同毒株在3′非编码区片段的大小，可以将26个毒株分成4组;26株毒株3′非编码区的进化树分析结果与按照3′非编码区片段大小进行分组有较一致的结果。其中的基因Ⅰ型和基因Ⅱ型毒株均属于第二组，基因Ⅲ型毒株属于第三组，基因Ⅳ型毒株属于第四组，而第一组的毒株均为国外分离毒株。本试验通过测定11株IBV分离株3′端非编码区的序列，为IBV分离株的分子流行病学研究提供科学依据。 3．构建S1、M和N基因的荧光融合表达质粒，转染Vero细胞后观察结构蛋白在细胞内的表达与分布。结果表明：酶切分析和测序结果证明构建了融合表达质粒pS1-EGFP、pM-EGFP、pN-EGFP、pS1-DsRed、pM-DsRed、pN-DsRed;在S1、M、N结构蛋白上均未分析出有核定位信号;转染了pS1-EGFP、pS1-DsRed质粒的Vero细胞，细胞的胞浆和胞核区均显示出绿色荧光或红色荧光，荧光的强度随着转染时间的增加而增强;pM-EGFP、pM-DsRed质粒转染的Vero细胞，激发的绿色和红色荧光仅分布在胞浆区域，且分布不均匀，表明pM-EGFP、pM-DsRed质粒表达的M-EGFP和M-DsRed在胞浆中发生了聚集;pN-EGFP、pN-DsRed质粒表达的融合蛋白在胞浆区域或胞核区域发生了部分聚集。本试验首次构建了S1、M和N基因的荧光融合表达质粒并在细胞中进行了表达研究，为进一步研制的IBV DNA疫苗提供了理论基础。 4．选择高效的真核表达载体pcDNA3.1(+)，将分离株SAIBk株的S1、M、N基因分别插入其多克隆位点，构建真核表达质粒pIBVS1、pIBVM和pIBVN，对构建的表达质粒进行酶切和测序鉴定，用脂质体转染Vero细胞，进行蛋白的表达和鉴定。结果表明：酶切和DNA测序证实重组质粒pIBVS1、pIBVM、pIBVN构建正确;通过RT-PCR、间接免疫荧光检测证实IBV的S1、M、N基因能在细胞中正确的转录和表达。本试验构建了S1、M和N基因的真核表达质粒，并在细胞中进行了表达检测，为进一步的DNA疫苗免疫试验提供了材料。 5．将构建的pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒单独或按比例混合进行动物免疫试验。结果表明：雏鸡免疫pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒后，均能产生特异性抗体，对强毒的攻击具有一定的保护力，其中pIBVM的保护率为37.5％;将pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒混合免疫所产生的抗体水平和对强毒攻击的保护力，均要优于

关键词：禽传染性支气管炎病毒基因组 3′非编码区分子特征 DNA疫苗

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

禽传染性支气管炎病毒非编码RNA的形成机制及其生物学功能

禽传染性支气管炎病毒非编码RNA的形成机制及其生物学功能

引用

作者：安红柳长江大学

学位级别：博士

许多病毒利用不同的机制产生非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）,主要包括由RNA聚合酶II或III转录而成的ncRNA和通过细胞5’-3’核酸外切酶不完全降解产生的亚基因组ncRNA。这些ncRNA在病毒的生活周期和病毒-宿主互作中发挥着非常重要的... 详细信息

许多病毒利用不同的机制产生非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）,主要包括由RNA聚合酶II或III转录而成的ncRNA和通过细胞5’-3’核酸外切酶不完全降解产生的亚基因组ncRNA。这些ncRNA在病毒的生活周期和病毒-宿主互作中发挥着非常重要的作用,包括自动调控病毒基因的表达、改变细胞周期、以及逃避宿主的防卫反应等。至今,大多已发现的病毒ncRNA是由DNA病毒所编码的,除黄病毒属病毒和少数植物病毒外,由RNA病毒产生的ncRNA鲜有报道,目前尚未有关冠状病毒编码ncRNA的报道。禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）属于冠状病毒科（Coronaviridae）,Gamma冠状病毒属的成员,是一种具囊膜的单股正链RNA病毒。在感染细胞中,IBV通过由基因组5’-端的转录调控序列（TRS）中和编码结构蛋白和辅助蛋白基因前的保守核心序列CU（U/G）AACAA介导的、以非连续转录机制合成5条亚基因组RNA（sgRNA）,编码病毒的结构蛋白和辅助蛋白。在本研究中,我们首次发现并鉴定了由IBV产生的一条ncRNA;利用反向遗传学技术获得病毒突变体,揭示了该ncRNA的形成机制,定位了影响ncRNA形成的关键核苷酸;通过分子生物学技术和转录学分析对该ncRNA的生物学功能进行了初步研究。结果如下:1、在IBV感染的Vero细胞和鸡胚中,通过RT-PCR检测,发现IBV能产生一条小的新sgRNA。克隆后测序,序列分析结果显示,该sgRNA全长563 nt(不包括poly（A）尾),由IBV基因组长63 nt的5’-端前导序列和3’-UTR（27104-27608 nt）组成。由于其不含起始密码子AUG,故为一ncRNA。2、为了揭示ncRNA的形成机制,定位影响ncRNA形成的关键核苷酸,我们以IBV-p65为遗传背景,利用已建立的IBV反向遗传学体系,构建并获得了一系列重组病毒,并对其生物学特性进行了分析,结果如下:（1）将EGFP的ORF插入IBV基因组3’-UTR 27149-27150 nt间,获得的重组病毒感染细胞后,可检测到EGFP的表达,证实该ncRNA是一条mRNA。（2）通过缺失、点突变,构建并获得重组病毒IBV-U27104A、IBV-A27105U、IBV-A27106U、IBV-C27107G、IBV-A27108U、IBV-Δ27104-08和IBV-A27110U/A27111U/G27113C/G27114C。RT-PCR检测这些病毒感染细胞中的ncRNA。结果显示,点突变U27104A和A27108U对ncRNA的合成无显著影响,点突变A27105U和A27106U导致ncRNA的合成显著减少,而点突变C27107G和Δ27104-08完全阻碍了正链和负链ncRNA的合成。结果说明,至少3个核苷酸（A27105/A27106/C27107）为ncRNA的有效合成所必需。此外,位于非标准核心序列(27104UAACA27108)下游的A27110/A27111/G27113/G27114与前导序列中核心序列下游序列保守。当用含有4个点突变的重组病毒IBV-A27110U/A27111U/G27113C/G27114C感染细胞后,在感染细胞中未能检测到ncRNA的合成,显示这4个核苷酸对ncRNA合成也至关重要。综上所述,该ncRNA是由非标准核心序列27104UAACA27108介导的、通过非连续转录机制转录而产生的,至少3个核苷酸（A27105/A27106/C27107）为ncRNA的有效合成所必需,且位于非标准核心序列（27104UAACA27108）下游的A27110/A27111/G27113/G27114对ncRNA合成也至关重要。3、ncRNA对病毒复制和致病性的影响（1）噬斑试验结果发现用IBV-rIBV和IBV-C27107G病毒感染Vero细胞形成的CPE直径分别为1.27±0.18和1.23±0.22mm,两者无显著差异。（2）荧光定量RT-PCR分析2种病毒感染Vero细胞8h和20h时S基因和N基因表达水平,结果显示两者无明显差异。（3）Western blot分析2种病毒感染4h、8h、12 h、16 h、20 h、24 h和28h时S蛋白和N蛋白的表达量,发现两组之间差异不显著。由以上结果可知,ncRNA对病毒在Vero细胞的复制和致病性无显著性影响。4、ncRNA对宿主基因表达的调控（1）初步的RNA微阵列分析结果表明ncRNA在宿主基因的表达中起着重要作用。rIBV感染Huh7后LBP和VNN3基因分别上调2.50和3.29倍,IBV-C27107G感染Huh7后LBP和VNN3基因分别上调14.43和9.

关键词：禽传染性支气管炎病毒非编码RNA 形成机制生物学功能

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

禽传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体制备及其中和抗原表位的鉴定

引用

中国兽医学报 2023年第12期43卷 2425-2432页

作者：彭莉张焕东李忠斐肖鹏颜焰董伟仁周继勇廖敏浙江大学海南研究院海南三亚572025 浙江大学动物科学学院浙江杭州310058

为鉴定禽传染性支气管炎病毒(IBV)刺突(S1)蛋白的中和抗原表位,本研究通过IBV全病毒免疫BALB/c小鼠,经融合、亚克隆筛选获得了4株稳定分泌抗IBV S1蛋白抗体的杂交瘤细胞株4A11、1B11、5E5和7C9。经鉴定制备的单克隆抗体腹水抗体ELISA效... 详细信息

为鉴定禽传染性支气管炎病毒(IBV)刺突(S1)蛋白的中和抗原表位,本研究通过IBV全病毒免疫BALB/c小鼠,经融合、亚克隆筛选获得了4株稳定分泌抗IBV S1蛋白抗体的杂交瘤细胞株4A11、1B11、5E5和7C9。经鉴定制备的单克隆抗体腹水抗体ELISA效价为106以上,Western blot和间接免疫荧光试验分析显示该单克隆抗体反应性和特异性良好。随后用8种基于S1分型的IBV毒株为试验毒株,同实验室已有的8株IBV S1单抗(1E9、1H1、1E4、3C6、3C7、2F3、2E5、4F9)共12株单抗进行气管环中和活性检测,发现S1蛋白单抗与8种S1亚型的毒株均有不同程度的中和作用。随后,在抗原表位和Western blot分析的基础上,鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域,获得了6个中和抗原表位,其中除^(416)IQTRTEP^(422)表位,其他5个表位仍未有相关报道。本研究成功制备出4株特异性识别S1蛋白且具有中和活性的单克隆抗体,不仅丰富了IBV的单克隆抗体库,为今后研究IBV S1蛋白分子结构提供了关键生物材料;获得的6个S1蛋白中和抗原表位也为后续建立IBV疫苗免疫效果评价方法和亚单位疫苗开发提供了工具。

关键词：禽传染性支气管炎病毒 S1蛋白单克隆抗体中和抗原表位

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

禽传染性支气管炎病毒地方株N基因的克隆及序列分析

引用

中国兽医杂志 2007年第4期43卷 15-17页

作者：周生王红宁唐梦君黄勇柳萍四川农业大学动物科技学院四川雅安625014

禽传染性支气管炎(IB)是鸡的一种急性、高度接触性的传染病,其特征为病鸡呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等.IBV可感染所有日龄的鸡,导致生长迟缓、死亡、影响增重和饲料报酬降低;还常常引起霉形体混合感染以及大肠杆菌等... 详细信息

禽传染性支气管炎(IB)是鸡的一种急性、高度接触性的传染病,其特征为病鸡呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等.IBV可感染所有日龄的鸡,导致生长迟缓、死亡、影响增重和饲料报酬降低;还常常引起霉形体混合感染以及大肠杆菌等继发感染而增加鸡群的死亡率,给养鸡生产带来巨大经济损失.

关键词：禽传染性支气管炎病毒 N基因序列分析地方株分子流行病学重大传染病克隆继发感染

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因的构建和原核表达

引用

中国兽医杂志 2009年第10期45卷 22-24页

作者：田浪王红宁高荣张安云鲁丹张云飞王霆康润敏四川大学生命科学学院动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室四川成都610064

传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病,给养禽业造成严重经济损失.生产中常采用弱毒疫苗对IB进行预防控制,但它存在毒力返强的隐患[1];灭活疫苗对冠状病毒感染的免疫效果不确实,且其... 详细信息

传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病,给养禽业造成严重经济损失.生产中常采用弱毒疫苗对IB进行预防控制,但它存在毒力返强的隐患[1];灭活疫苗对冠状病毒感染的免疫效果不确实,且其副作用可能造成较严重及较长时间的局部反应.常规基因工程疫苗具有安全性好和诱导全方位免疫应答等优点,但它通常只能携带一个目的基因,因而诱导的免疫保护力有限.

关键词：禽传染性支气管炎病毒鸡传染性支气管炎病毒原核表达嵌合基因多表位接触性传染病冠状病毒感染经济损失

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：