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禽分枝杆菌副结核亚种保护性抗原的研究进展

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中国兽医科学 2011年第7期41卷 756-760页

作者：徐凤宇姜秀云么乃全钱爱东吉林农业大学动物科技学院吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室吉林长春130118 吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118

为了给副结核病新型疫苗研究中抗原的选择提供参考,综述了超氧化物歧化酶和巯基过氧化物酶等酶类、热休克蛋白、抗原85复合物及其他一些抗原在激发实验动物细胞和体液免疫中所发挥的作用,同时总结了在实际应用中可供借鉴的经验。

关键词：禽分枝杆菌副结核亚种保护性抗原酶热休克蛋白

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禽分枝杆菌副结核亚种map0862基因与map2154c基因的串联重组表达

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中国兽医科学 2008年第10期38卷 856-859页

作者：迟磊刘思国王春来宫强赵昆刘建东王勇云孟克刘慧芳赵福广中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001 吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118

以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增出了map0862基因和map2154c基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(PCR-SOE)获得了融合基因map0862-2154c。将融合基因与原核表达载体pET32a(+)连接,构建了重组质粒pET0862-2154c。将重... 详细信息

以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增出了map0862基因和map2154c基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(PCR-SOE)获得了融合基因map0862-2154c。将融合基因与原核表达载体pET32a(+)连接,构建了重组质粒pET0862-2154c。将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导后对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot检测。结果表明,表达的重组蛋白map0862-2154c的分子质量为76 ku,可用于建立诊断副结核病的ELISA。

关键词：禽分枝杆菌副结核亚种 map0862基因 map2154c基因重叠延伸剪接技术重组表达

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禽分枝杆菌副结核亚种GDSL脂肪酶MAP＿2739的功能研究

禽分枝杆菌副结核亚种GDSL脂肪酶MAP＿2739的功能研究

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作者：王建国黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

副结核病是由禽分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium ***,MAP)感染引起的多种反刍动物慢性消耗性传染病,以顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠黏膜增厚及形成皱襞为特征。该病呈世界范围内流行,由于副结核病所导致的养殖业生产力下降以及... 详细信息

副结核病是由禽分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium ***,MAP)感染引起的多种反刍动物慢性消耗性传染病,以顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠黏膜增厚及形成皱襞为特征。该病呈世界范围内流行,由于副结核病所导致的养殖业生产力下降以及受感染动物的早期淘汰,给畜牧业造成巨大的经济损失,同时还严重威胁公共卫生安全。MAP为胞内寄生菌,不仅能够逃逸宿主免疫防御的杀伤,而且还能形成MAP的潜伏感染状态,长期存在于宿主细胞中。因此,开展MAP的致病机制研究,以寻找有效的预防策略和治疗MAP感染的新手段已势在必行。本研究应用生物信息学预测方法,对MAP基因组保守氨基酸残基进行检索分析后发现map 2739编码的氨基酸序列中存在GDSL-脂肪酶的四个保守结构域,依据NCBI数据库的描述,提示MAP＿2739蛋白为MAP的脂肪酶。经PCR扩增、表达载体构建、原核表达及纯化研究,获得了纯化的MAP＿2739蛋白,采用吸光度法对脂肪酶活性进行测定。结果显示,MAP＿2739具有可水解长链脂肪酸的脂肪酶活性,确定了MAP＿2739酶活性的最适p H值为9.0,脂肪酶活性与温度(25℃-83℃)呈现正相关性,同时应用巴氏消毒法(65℃,30 min或83℃,15 s)处理MAP＿2739蛋白后进一步验证在高温条件其仍具有脂肪酶的活性,并证实镍离子和锰离子能促进MAP＿2739的脂肪酶活性。应用氨基酸突变方法获得拟酶活性位点突变的MAP＿2739纯化蛋白,证实204D和46S氨基酸残基为GDSL脂肪酶MAP＿2739的酶活性位点,对酶活性具有决定性作用。将map 2739基因连接pMV-261分枝杆菌穿梭载体,电转化入耻垢分枝杆菌(Msg)感受态后成功构建重组耻垢分枝杆菌rMsg-2739,并在制备兔抗MAP＿2739蛋白多克隆抗体基础上,应用Western Blot方法,明确MAP＿2739蛋白主要定位于MAP的细胞壁和细胞膜上,表明GDSL脂肪酶MAP＿2739属于MAP胞外蛋白,且过表达后可明显改变耻垢分枝杆菌的单菌落形态。同时,应用构建的重组耻垢分枝杆菌脂肪酶活性位点单突变菌株(rMsg-S46A和rMsg-D204A)和脂肪酶活性位点双突变菌株(rMsg-D204AS46A)感染小鼠腹腔原代巨噬细胞,经菌落计数研究结果显示,GDSL脂肪酶MAP＿2739可显著增强重组耻垢分枝杆菌在小鼠腹腔巨噬细胞内的存活能力。应用共聚焦显微镜观察结果表明,纯化后的MAP＿2739可与脂筏结构标记蛋白-小窝蛋白(Caveolin-1)共定位,提示MAP＿2739可以结合到巨噬细胞膜的脂筏上。通过透射电镜观察结果发现,GDSL脂肪酶MAP＿2739能促进耻垢分枝杆菌从吞噬体囊泡中逃逸,并明显造成了菌体对小鼠腹腔巨噬细胞的损伤。以腹腔注射途径感染C57BL/6J小鼠,评价重组耻垢分枝杆菌rMsg-2739、rMsgD204AS46A和rMsg-261对小鼠的致病性影响。结果表明,GDSL脂肪酶MAP＿2739能够促进耻垢分枝杆菌在小鼠脏器中的定植,并造成肝脏和脾脏不同程度的病理损伤,同时还促进了小鼠炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6释放。综上所述,研究证实MAP＿2739是MAP的一种胞外GDSL脂肪酶,阐明了MAP＿2739通过靶向巨噬细胞脂筏促进耻垢分枝杆菌入侵及从吞噬体中逃逸,进而提高其在宿主体内的存活率,最终达到MAP持续感染的致病机制。本研究不仅对MAP致病机制的理解,也为副结核病的治疗和药物研发奠定了基础。

关键词：禽分枝杆菌副结核亚种吞噬体逃逸胞内持续感染 GDSL脂肪酶 MAP_2739

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禽分枝杆菌副结核亚种hsp65与鹅副黏病毒HN融合基因真核表达载体的构建与表达

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中国兽药杂志 2014年第4期48卷 5-10页

作者：么乃全李淑君姜秀云马红霞高云航王春芳胡静涛徐凤宇胡桂学吉林农业大学动物科技学院长春130118 吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室长春130118 吉林农业大学生命科学院长春130118

为探索禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)的热休克蛋白65(hsp65)对鹅副黏病毒(GPMV)血凝素神经氨酸酶(HN)的分子佐剂作用及构建GPMV DNA疫苗,针对GPMV的HN基因和MAP的hsp65基因设计引物,PCR克隆扩增两个基因,分别将二者先后与真核表达载体pVAX... 详细信息

为探索禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)的热休克蛋白65(hsp65)对鹅副黏病毒(GPMV)血凝素神经氨酸酶(HN)的分子佐剂作用及构建GPMV DNA疫苗,针对GPMV的HN基因和MAP的hsp65基因设计引物,PCR克隆扩增两个基因,分别将二者先后与真核表达载体pVAX1连接,构建了pVAX1-HN、pVAX1-hsp65-HN,并通过PCR、酶切和序列鉴定所获重组质粒;应用脂质体法将其转染至Marc-145细胞,RT-PCR和间接免疫荧光试验证实hsp65和HN在Marc-145细胞中获得了表达。本研究为制备新型GPMV DNA疫苗及探索hsp65在DNA疫苗中的应用奠定了基础。

关键词：鹅副黏病毒血凝素神经氨酸酶禽分枝杆菌副结核亚种热休克蛋白65 构建表达

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禽分枝杆菌副结核亚种重组蛋白r22-ag85B的表达及纯化

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中国动物传染病学报 2009年第2期17卷 59-62页

作者：杨金国王聃刘慧芳杜艳芬司微赵海玲林靖凯王春来倪红波赫明雷彭玮赵福广刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 吉林农业大学生命科学学院长春130118 延边大学延吉133400

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(SOE-PCR)获得了融... 详细信息

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(SOE-PCR)获得了融合基因22-ag85B,将基因连接于表达载体pET32a(+),构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1mmol/L)诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。

关键词：禽分枝杆菌副结核亚种 22KD基因 ag85B基因重叠延伸剪接技术重组表达

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一种禽分枝杆菌副结核亚种LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法和应用

一种禽分枝杆菌副结核亚种LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法和应...

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作者：周霞俞杰张辉吴洁孙志华王震刘良波李劼魏京京徐淑云罗志洁魏增科王晓兰 832003 新疆维吾尔自治区石河子市北四路221号

本发明涉及食品检测技术领域，具体公开了一种禽分枝杆菌副结核亚种LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法和应用，通过所述引物组包括内引物、外引物和环引物；所述内引物由FIP和BIP组成，所述外引物由F3和B3组成，所述环引物由LF和LB组成... 详细信息

标准号: CN117418026A

本发明涉及食品检测技术领域，具体公开了一种禽分枝杆菌副结核亚种LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法和应用，通过所述引物组包括内引物、外引物和环引物；所述内引物由FIP和BIP组成，所述外引物由F3和B3组成，所述环引物由LF和LB组成。本发明提供的引物能特异性检测生鲜乳中的禽分枝杆菌副结核亚种，可视化灵敏性在5.01×10¹CFU/mL，琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度为5.01×10¹CFU/mL，本发明提供引物组的特异性高。

关键词：引物组环引物内引物外引物禽分枝杆菌副结核亚种琼脂糖凝胶电泳检测特异性检测分枝杆菌食品检测副结核可视化灵敏度灵敏性生鲜乳试剂盒亚种引物检测应用

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用于自然感染低龄绵羊抗体检测的禽分枝杆菌副结核亚种抗原筛选与评价

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中国生物制品学杂志 2024年第6期37卷 679-686页

作者：沈克飞余远迪付利芝徐登峰唐达曹政张素辉重庆市畜牧科学院重庆402460 重庆市兽用生物制品工程技术研究中心重庆402460

目的分析禽分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis,MAP)10个血清反应性抗原(MAP1138c、MAP2121c、MAP0150c、MAP0862、MAP0209c、MAP2120c、MAP0038、MAP3420c、MAP 2154c和MAP-2751)在自然感染低月龄绵羊体内的抗体反应,评估其诊断价值。方法采集有副结核(paratuberculosis,PTB)病史羊群中无明显PTB症状的6月龄绵羊血清和肛拭子样品,采用PTB抗体检测ELISA试剂盒检测血清,基于MAP F57元件的荧光定量PCR检测肛拭子,根据检测结果对羊只进行分组。采用PCR检测阳性肛拭子中的MAP 10个抗原基因。将抗原基因克隆至pET-28a载体,在大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,Ni-Sepharose纯化重组抗原。将纯化的重组抗原包被ELISA板,用于检测采集的血清,以分析所选抗原在自然感染绵羊体内的抗体反应。分析不同抗原血清抗体的检出率,以评估其诊断价值。结果所采样的72只绵羊被分为肛拭子阳性-抗体阳性(34只)、肛拭子阳性-抗体阴性(23只)、肛拭子阴性-抗体阴性(15只)3组。10个抗原基因均能在阳性肛拭子中检测到,且每个基因序列高度一致。经ELISA检测,MAP1138c、MAP2121c、MAP0150c、MAP0862在感染绵羊体内产生了抗体反应。在57只感染羊中,分别有30、34、24和31只检测到针对MAP1138c、MAP2121c、MAP0150c和MAP0862的抗体。在肛拭子阳性-抗体阳性组中,抗MAP1138c的抗体检出率(76.47%)最高;在肛拭子阳性-抗体阴性组中,抗MAP2121和MAP0862的抗体检出率(52.17%和47.83%)高于其他2种蛋白。在72份血清样品的检测中,包被MAP2121c和MAP0862的ELISA检测结果的符合率超过91%。结论MAP1138c、MAP2121c和MAP0862可能是诱导自然感染低龄绵羊产生MAP抗体反应的显性生物标志物,MAP2121c和MAP0862可弥补商品化ELISA试剂盒在PTB早期诊断上敏感性不足的缺陷。

关键词：禽分枝杆菌副结核亚种抗原血清反应性副结核反刍动物

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副结核病发病机制研究进展

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中国兽医学报 2011年第4期31卷 619-624页

作者：徐凤宇姜秀云幺乃全钱爱东吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118 吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室吉林长春130118 吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118

副结核病（Paratuberculosis,也称Johne＇s病）是由副结核分枝杆菌即禽分枝杆菌副结核亚种（My-cobacterium avium ***,MAP）引起的以慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的多种动物共患传染病,只在美国每年对奶牛业的损失就有2.... 详细信息

副结核病（Paratuberculosis,也称Johne＇s病）是由副结核分枝杆菌即禽分枝杆菌副结核亚种（My-cobacterium avium ***,MAP）引起的以慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的多种动物共患传染病,只在美国每年对奶牛业的损失就有2.2亿美元[1]。

关键词：禽分枝杆菌副结核亚种发病机制侵袭力免疫应答

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一种同时检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用

一种同时检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用

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作者：党光辉刘思国蔡珠明崔子寅 150009 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号

本发明公开了一种同时检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用。所述的三种分枝杆菌包括结核分枝杆菌复合群(MTBC)、禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)和禽分枝杆菌禽亚种(MAA)。所述的试剂盒中含有分别用于检测MTBC、MAP和MA... 详细信息

标准号: CN113528682B

本发明公开了一种同时检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用。所述的三种分枝杆菌包括结核分枝杆菌复合群(MTBC)、禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)和禽分枝杆菌禽亚种(MAA)。所述的试剂盒中含有分别用于检测MTBC、MAP和MAA的引物以及探针。进一步的，本发明还建立了使用上述试剂盒检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR方法，实验证明，本发明建立的多重TaqMan荧光定量方法与常规PCR的阳性符合率为100.0％(175/175)、阴性符合率为87.0％(220/253)，与分枝杆菌培养的阳性符合率为100.0％(116/116)、阴性符合率为69.6％(220/316)。因此，本发明所建立的多重TaqMan荧光定量方法可用于MTBC、MAP和MAA的定性和定量检测，为有效防控牛结核病和副结核病提供了新的技术手段。

关键词：分枝杆菌荧光定量阴性禽分枝杆菌副结核亚种结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR试剂盒荧光定量PCR 禽分枝杆菌试剂盒检测定量检测副结核病技术手段牛结核病常规PCR 试剂盒检测可用探针亚种引物定性应用

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一种同时检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用

一种同时检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用

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作者：党光辉刘思国蔡珠明崔子寅 150009 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号

标准号: CN113528682A

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