检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2015年第1期31卷 75-85页

作者：孙明铭李晓齐曹红王永强郑世军中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室北京100193

为了制备禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)gp90蛋白的单克隆抗体,应用His-gp90融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,经过筛选、3次亚克隆后获得3株稳定分泌抗REV-gp90蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别... 详细信息

为了制备禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)gp90蛋白的单克隆抗体,应用His-gp90融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,经过筛选、3次亚克隆后获得3株稳定分泌抗REV-gp90蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为3G5-B8、3G5-A10和1G12。经间接ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)方法检测,单克隆抗体的亲和力解离常数(Kd)分别为6.483×10–10、4.844×10–10和9.330×10–10,3株单抗的亚型分别为Ig G1、Ig G1和Ig G2b。经Western blotting和间接免疫荧光实验检测,3株单抗均能识别REV感染DF-1细胞后产生的gp90蛋白。以Western blotting方法利用单抗检测不同截短的gp90蛋白,初步确定3G5-B8和3G5-A10 2株单抗抗原识别区均位于gp90蛋白第200-245位氨基酸,而1G12株单抗识别区包含第230-235位氨基酸。这些单抗为REV的诊断和致病机理研究奠定了基础。

关键词：禽网状内皮组织增殖病病毒 gp90蛋白单克隆抗体亲和力抗原表位

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禽网状内皮组织增殖病病毒对禽流感疫苗免疫效果的影响

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中国预防兽医学报 2015年第4期37卷 291-294页

作者：白洁曾显营祁小乐李鑫李倩倩陈化兰田国彬中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)对禽流感病毒(AIV)疫苗免疫效果的影响,本研究将1日龄SPF鸡经腹腔感染REV HLJR0901株后,分别于10日龄免疫重组AIV灭活疫苗(H5N1亚型,Re-6)、禽流感-新城疫重组二联活疫苗(r LH5-6)及10日龄和24日龄... 详细信息

为研究禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)对禽流感病毒(AIV)疫苗免疫效果的影响,本研究将1日龄SPF鸡经腹腔感染REV HLJR0901株后,分别于10日龄免疫重组AIV灭活疫苗(H5N1亚型,Re-6)、禽流感-新城疫重组二联活疫苗(r LH5-6)及10日龄和24日龄两次免疫r LH5-6疫苗,并设未感染REV的免疫对照组,于免疫后检测血清HI抗体,并采用H5N1亚型高致病性AIV攻毒。结果显示:实验鸡感染REV后HI抗体滴度均低于相应的未感染REV的免疫对照组。感染REV后,免疫一次Re-6灭活疫苗、r LH5-6活疫苗及两次r LH5-6活疫苗的实验鸡攻毒后的存活率分别为70%、60%及80%,排毒鸡数分别为4/10、4/10及3/10;未感染REV的免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒;空白对照组实验鸡攻毒后3 d内全部死亡并且排毒。本研究表明,REV对AIV灭活疫苗和活疫苗均具有明显的免疫抑制作用,加强免疫r LH5-6疫苗可以部分减轻该抑制作用。

关键词：禽网状内皮组织增殖病病毒禽流感疫苗免疫效果影响

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禽网状内皮组织增殖病病毒GD09株的分离与全基因组测序

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中国畜牧兽医 2011年第9期38卷 170-174页

作者：史伟伟刘红波徐成刚廖明曹伟胜华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室广东广州510642

从广东某鸡场送检的疑似禽网状内皮组织增殖病的病鸡中采集病料,处理后经接种DF-1细胞,经聚合酶链式反应(PCR)及特异性间接免疫荧光试验(IFA),分离并鉴定出1株禽网状内皮组织增殖病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV),命名为GD09。... 详细信息

从广东某鸡场送检的疑似禽网状内皮组织增殖病的病鸡中采集病料,处理后经接种DF-1细胞,经聚合酶链式反应(PCR)及特异性间接免疫荧光试验(IFA),分离并鉴定出1株禽网状内皮组织增殖病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV),命名为GD09。依据已发表的REV前病毒全基因组序列设计并合成6对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示,该分离株基因组序列全长8295bp,符合典型的复制完全型反转录病毒的基因组结构,基因序列中不含已知致癌基因。将该分离株的亚群特异性gp90基因序列与国内外各参考株相应序列进行相似性比较分析,结果表明,GD09分离株与中国分离株HA9901亲缘关系最近,核苷酸相似性最高。

关键词：禽网状内皮组织增殖病禽网状内皮组织增殖病病毒 gp90 分离与鉴定

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禽网状内皮组织增殖病病毒及鸡传染性法氏囊病活疫苗对禽流感疫苗免疫效果的影响

禽网状内皮组织增殖病病毒及鸡传染性法氏囊病活疫苗对禽流感疫苗...

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作者：白洁中国农业科学院

学位级别：硕士

H5亚型禽流感病毒(AIV)引起的高致病性禽流感(HPAI)给养禽业带来重大经济损失,也威胁着人类的公共卫生安全。中国采用免疫加扑杀相结合的综合措施防控禽流感(AI),疫苗免疫在防控AI方面取得了显著成效。然而,当前HPAI还时有发生,在疫苗... 详细信息

H5亚型禽流感病毒(AIV)引起的高致病性禽流感(HPAI)给养禽业带来重大经济损失,也威胁着人类的公共卫生安全。中国采用免疫加扑杀相结合的综合措施防控禽流感(AI),疫苗免疫在防控AI方面取得了显著成效。然而,当前HPAI还时有发生,在疫苗免疫方面主要存在着个别鸡群疫苗免疫保护效果与实验室结果相差较大的问题。影响免疫效果的因素很多,本研究主要探讨免疫抑制性病毒中禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)和鸡传染性法氏囊病(IBD)活疫苗株对机体的免疫抑制作用,为分析AI疫苗免疫效果不理想的原因及IBD疫苗的选用提供参考依据。为研究REV对AI疫苗免疫效果的影响,本研究在免疫重组禽流感病毒灭活疫苗(简称AI灭活苗)或禽流感-新城疫重组二联活疫苗(简称新禽活苗)之前以REV经典分离株感染1日龄SPF鸡,与未感染REV的免疫对照鸡一起,分别进行血清抗体监测、外周血及脾脏淋巴细胞增殖指数(SI)测定、外周血及脾脏淋巴细胞CD4+/CD8+值测定、细胞因子水平检测、攻毒后发病和死亡情况及排毒测定。结果显示,REV显著抑制免疫初期HI抗体、T淋巴细胞增殖能力和CD4+/CD8+值;平均HI抗体峰值相差4倍以上,同一免疫时间HI抗体最高相差达64倍;鸡只感染REV后,AI灭活苗仅提供70%的保护率,一次免疫和两次免疫新禽活苗提供的保护率分别为60%和80%,而未感染REV的相应免疫鸡获得100%保护。为评价IBD活疫苗对AI疫苗免疫效果的影响,本研究选取弱毒力(Gt株)和中等毒力(MB株)IBD活疫苗,分别与AI灭活苗或新禽活苗一起免疫SPF鸡,与仅免疫相应AI疫苗的鸡一起,进行与REV对AI疫苗免疫效果研究同样指标的检测。结果显示,IBD活疫苗(Gt株)加AI灭活苗、IBD活疫苗(MB株)加AI灭活苗与AI灭活苗免疫3组免疫鸡免疫21天时平均HI抗体分别为5.9 log2、2.1 log2和7.7 log2,攻强毒后存活数分别为10/10、8/10和10/10,排毒数别为1/10、7/10和0/10。接种IBD活疫苗(Gt株)加新禽活苗、IBD活疫苗(MB株)加新禽活苗与新禽活苗免疫21天HI抗体分别为2.2 log2、1.6 log2和2.5 log2,攻强毒后存活数分别为10/10、7/10和10/10,排毒数分别为1/10、3/10和0/10。这两种IBD活疫苗对细胞免疫反应均无显著影响。本研究表明,REV、IBD活疫苗(MB株)均对AI疫苗免疫效果产生显著影响,而IBD活疫苗(Gt株)对AI疫苗攻毒保护免疫效果无明显影响。

关键词：禽网状内皮组织增殖病病毒鸡传染性法氏囊病活疫苗禽流感疫苗免疫效果影响

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J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒协同致瘤机制研究

J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒协同致瘤机制研究

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作者：周德方山东农业大学

学位级别：博士

病毒共感染是自然界中普遍的现象,在共感染过程中病毒复制、细胞表型、病理变化、宿主范围、组织嗜性和感染率等生物学特性都会发生变化。J亚群禽白血病病毒(ALV-J),属于反转录病毒科,可引起免疫抑制、生长迟缓和多种多样的肿瘤。禽网... 详细信息

病毒共感染是自然界中普遍的现象,在共感染过程中病毒复制、细胞表型、病理变化、宿主范围、组织嗜性和感染率等生物学特性都会发生变化。J亚群禽白血病病毒(ALV-J),属于反转录病毒科,可引起免疫抑制、生长迟缓和多种多样的肿瘤。禽网状内皮组织增殖病(Reticuloendotheliosis,RE),同样属于反转录病毒科,指包括禽网状内皮组织増殖病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、脾坏死病毒(Spleen necrosis virus,SNV)、鸡合胞体病毒(Chicken syncytial virus,CSV)和鸭传染性贫血病毒(Duck infectious anemia virus,DIA)等多种网状内皮组织增殖病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)群的反转录病毒引起的一群病理综合征,典型病症为免疫抑制、矮小综合症和淋巴组织或其它组织形成的慢性肿瘤。在过去二十多年,我国大量流行病学调查报告显示ALV-J与REV的共感染普遍存在。除协同抑制抗体生成、促进致病性增强外,ALV-J与REV共感染最主要的特征为引起致瘤谱扩展,但其协同促进肿瘤谱扩展的机制至今未明。本研究以ALV-J和REV为模式病毒,通过研究其协同致瘤机制,为肿瘤病毒协同致瘤机制的深入研究奠定坚实的基础。为确定ALV-J与REV的协同作用,本研究首先通过体外共感染实验,建立了ALV-J与REV协同感染CEF模型。通过电镜观察,发现ALV-J与REV可同时侵染一个宿主细胞,进一步,CCK-8检测结果发现ALV-J与REV共感染可以协同延长细胞存活时间。qRT-PCR和western blot检测结果显示,ALV-J与REV在RNA和蛋白表达水平上均显示了协同复制作用。为进一步验证ALV-J与REV在体内的协同作用,我们建立了两种病毒共感染的动物实验模型。为获得更显著的协同作用,我们选择对6胚龄的鸡胚尿囊腔接种两种病毒。ALV-J与REV共感染后可显著降低孵化率,加剧生长迟缓和抑制中枢免疫器官发育。qRT-PCR检测结果显示,两病毒的协同作用发生于各个组织器官中。病理组织观察显示,ALV-J与REV共感染可加剧了肝门管区、肾脏间质及胰腺血管周围炎性浸润;加速了胸腺皮质和髓质区界限的消失;促进了心内膜上纤维瘤的生成。为确定参与ALV-J和REV协同致瘤的关键分子,我们对处在协同复制高峰时间点(72dpi)的同一批共感染的CEF细胞分别进行了iTRAQ蛋白组学和microRNA表达谱分析,对照组分别为单感染组和Mock组。通过与各单感染组相比,在共感染组中共筛选到差异显著的蛋白33个和差异表达的miRNA 7个,并发现肿瘤相关分子KIAA1199上调和肿瘤抑制物miR-147下调。为验证其表达的确实性,分别用qRT-PCR和western blot在共感染的培养细胞中进行了检测,结果符合组学检测结果。进一步,体内共感染实验中,通过qRT-PCR和IHC检测各组织中miR-147和KIAA1199的RNA和蛋白表达水平。qRT-PCR结果显示,共感染组鸡只在肝脏、肾脏、法氏囊、骨髓和心脏中KIAA1199 RNA表达量均显著高于各单独感染组,而miR-147的表达量却仅在骨髓、肾脏和心脏中显著下调;IHC检测结果显示,共感染组中仅骨髓、肾脏和心脏中KIAA1199蛋白表达量显著上升。以上结果说明,无论是体外培养的细胞还是体内的组织器官,ALV-J与REV均协同激活了原癌基因KIAA1199,同时抑制了肿瘤抑制物miR-147。此外,KIAA1199与mi R-147在不同组织和细胞中表达的反相关,暗示了两者之间存在着调控的关系。为探明ALV-J与REV协同感染过程中miR-147与KIAA1199的联系,我们通过RNA22、NCBI、ensemble和miRanda等数据库预测到了miR-147与KIAA1199的3’UTR区潜在的结合位点。我们分别构建了miRNA过表达载体miR-147 mimics和mi RNA干扰载体miR-147 inhibitor,并将其转染进共感染ALV-J与REV的CEF细胞体系中,western blot检测结果表明miR-147可显著降低KIAA1199蛋白的表达量,并且这种下降的趋势随着mi R-147浓度的减少而降低;miR-147的抑制剂可显著促进KIAA1199蛋白的表达量,并且这种增强效果随抑制剂浓度的增加而升高。我们分别构建了WT KIAA1199和mut KIAA1199双荧光素酶载体,与miR-147 mimics共同转染进293T细胞,通过双荧光素酶报告系统来检测miR-147是否可以直接与KIAA1199的3’UTR区结合。检测结果表明,当miR-1

关键词： J亚群禽白血病病毒禽网状内皮组织增殖病病毒协同感染 KIAA1199 miR-147 NF-κB EGFR 肿瘤

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miR-155介导J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒协同复制机制

miR-155介导J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒协同复...

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作者：薛婧雯山东农业大学

学位级别：博士

病毒共感染在自然界中普遍存在,对疾病进程产生重要影响。家禽养殖中,J亚群禽白血病(Avian Leukosis subgroup J,J-AL)和禽网状内皮组织增殖病(Reticuloendotheliosis,RE)是两种常见的免疫抑制病,分别由J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosi... 详细信息

病毒共感染在自然界中普遍存在,对疾病进程产生重要影响。家禽养殖中,J亚群禽白血病(Avian Leukosis subgroup J,J-AL)和禽网状内皮组织增殖病(Reticuloendotheliosis,RE)是两种常见的免疫抑制病,分别由J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis virus subgroup J,ALV-J)和禽网状内皮组织增殖病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起。ALV-J与REV均为反转录病毒,其传播途径相似,在临床上这两种病毒的共感染现象广泛发生,ALV-J与REV共感染协同促进病毒复制,导致致病性增强、肿瘤谱扩展。然而,目前关于ALV-J与REV的协同机制的研究主要集中于促进生长抑制和免疫抑制,ALV-J与REV协同复制机制仍未完全阐明。本研究表明,ALV-J与REV通过其结构蛋白协同激活miR-155,miR-155通过PRKCIMAPK8和TIMP3-MMP2双通路与ALV-J和REV的3′U3直接互作,促进两种病毒的协同复制。为明确ALV-J与REV的协同复制与致病性,建立了ALV-J与REV体外共感染模型。病毒生长曲线表明,ALV-J与REV共感染时,两种病毒的复制加快,其m RNA表达水平和蛋白表达水平均极显著升高,并且其病毒复制效率在感染后72-96 h(Hour postinfection,hpi)达到最高。为明确ALV-J和REV在动物体内是否也存在协同复制,建立了两种病毒的共感染动物模型。结果表明,相较于单感染,共感染组鸡的孵化率和体重显著降低,死亡率显著升高,并有着更严重的免疫器官萎缩和组织病变,并且共感染组鸡的病毒的m RNA水平均显著高于单感染组鸡。上述结果表明,ALV-J与REV在体外和体内均存在协同复制。病毒协同复制主要通过共劫持宿主因子和信号通路来实现其协同复制,如miRNA分子。为了筛选调控ALV-J与REV协同复制中的关键miRNA,利用RNASeq技术对ALV-J与REV单感染及共感染的DF-1细胞进行miRNA组学分析,对ALV-J和REV共感染组、ALV-J单感染组、REV单感染组和对照组细胞的差异表达miRNA进行了比较分析。结果表明,相较于ALV-J单感染组和REV单感染组,在ALV-J与REV共感染组中,共筛选出17个显著差异表达的miRNA,其中7个miRNA上调,10个miRNA下调。对共感染组和单感染组中均上调的或下调的miRNA进行分析发现,相对差异表达倍数最高的为miR-155分子。miR-155在多种病毒复制中均发挥着重要作用,推测其在ALV-J与REV的协同复制中也发挥着重要作用。随后,为揭示miR-155在ALV-J与REV协同复制中的作用和机制。本研究首先探究了ALV-J和REV如何调控miR-155的表达。反转录病毒通常通过宿主细胞基因组DNA整合或病毒结构蛋白互作调控相关miRNA表达。通过对ALV-J与REV共感染细胞基因组DNA进行整合位点测序发现,ALV-J与REV的整合并未调控miR-155的表达;进一步,为明确是否是ALV-J和REV的结构蛋白介导了miR-155的表达,通过在培养的细胞中过表达ALV-J和REV的结构蛋白,检测miR-155的表达水平。结果表明,共过表达ALV-J或REV的结构蛋白均协同促进了miR-155表达,其中以ALV-J和REV的gag最为显著的协同促进了miR-155表达。为明确miR-155在ALV-J与REV协同复制中的作用,在ALV-J与REV共感染的细胞中过表达或干扰miR-155,检测ALV-J与REV的协同复制水平。结果显示,过表达miR-155极显著地促进了ALV-J和REV的协同复制,而干扰miR-155则极显著抑制了ALV-J与REV的协同复制,说明miR-155在ALV-J与REV的协同复制中发挥了重要作用。为探究miR-155在ALV-J与REV协同复制中是否是起决定作用的关键分子,通过将不同浓度的miR-155 mimics转染入ALV-J或REV单感染的细胞中,以替代另一种病毒对miR-155表达的影响,并检测ALV-J与REV的复制水平。结果显示,当添加miR-155 mimics使ALV-J与REV的单感染和共感染细胞中的miR-155表达水平无显著差异时,ALV-J或REV的复制水平也无显著差异,表明miR-155在ALV-J与REV协同复制中发挥着决定性的关键作用。miR-155调控病毒复制的机制主要分为两种途径,分别为直接靶向病毒,或是通过靶向相关因子调控病毒复制。为了明确miR-155促进ALV-J与REV协同复制的途径,本研究通过RNA22软件对miR-155直接与ALV-J和REV直接互作的可能性进行

关键词：禽白血病病毒J亚群禽网状内皮组织增殖病病毒协同复制 miR-155

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禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)gp90蛋白单克隆抗体的制备及识别区分析

禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)gp90蛋白单克隆抗体的制备及识别...

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中国畜牧兽医学会2014年学术年会

作者：孙明铭王永强李晓齐曹红郑世军中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室

引言禽网状内皮组织增殖病病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）能够引起感染禽的免疫抑制,常与MDV、CAV、ALV等病原混合感染,给养禽业带来的危害越来越严重。目前国内尚未开发出针对REV抗体或抗原检测的商品化试剂盒,养殖场鸡群RE... 详细信息

引言禽网状内皮组织增殖病病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）能够引起感染禽的免疫抑制,常与MDV、CAV、ALV等病原混合感染,给养禽业带来的危害越来越严重。目前国内尚未开发出针对REV抗体或抗原检测的商品化试剂盒,养殖场鸡群REV的检测仍使用价格昂贵的进口试剂盒。gp90蛋白能够产生中和抗体,是病毒的免疫原性蛋白。本研究针对REV-gp90抗原制备单克隆抗体,并对单

关键词：禽网状内皮组织增殖病病毒 REV)gp90 单克隆抗体

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聚合酶链反应技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒

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中国实验动物学报 2007年第6期15卷 444-448,I0005页

作者：翟新验王兴龙卢胜明刘月焕吉林大学畜牧兽医学院长春130062 北京实验动物研究中心北京100012 北京市农林科学院畜牧兽医研究所北京100089

目的建立聚合酶链反应(PCR)技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。方法提取感染REV-T和脾坏死病毒(SNV)的SPF鸡胚成纤维细胞DNA为模板,利用前病毒长末端重复序列(LTR)区引物进行扩增。采集肿瘤病鸡,以及人工感染REV 28 d后鸡... 详细信息

目的建立聚合酶链反应(PCR)技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。方法提取感染REV-T和脾坏死病毒(SNV)的SPF鸡胚成纤维细胞DNA为模板,利用前病毒长末端重复序列(LTR)区引物进行扩增。采集肿瘤病鸡,以及人工感染REV 28 d后鸡肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胸腺、法氏囊等器官,进行扩增。同时将采集的脏器组织,进行HE染色和免疫组化试验(IHC)。结果REV-T感染的组织未检测出电泳条带,而SNV感染的细胞中检测到了一条300bp特异而清晰的电泳条带,而且SNV感染的鸡组织中,PCR方法检测到了特异的条带。通过HE染色和免疫组化技术观察到了肿瘤组织,肿瘤细胞的形态、分布。结论PCR检测REV更快捷,特异更好。

关键词：禽网状内皮组织增殖病病毒聚合酶链反应免疫组化

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鼠抗禽网状内皮组织增殖病病毒gp90多抗的研制及gp90在昆虫细胞中的表达

鼠抗禽网状内皮组织增殖病病毒gp90多抗的研制及gp90在昆虫细胞中...

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作者：钟登科扬州大学

学位级别：硕士

禽网状内皮组织增生症病毒(REV)是禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis)的病原，属逆转录病毒科的C型病毒。该病毒主要感染火鸡，也能引起鸡、鸭等禽类以淋巴-网状细胞增生为特征的肿瘤性的病理综合征。主要侵害宿主的淋巴细胞... 详细信息

禽网状内皮组织增生症病毒(REV)是禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis)的病原，属逆转录病毒科的C型病毒。该病毒主要感染火鸡，也能引起鸡、鸭等禽类以淋巴-网状细胞增生为特征的肿瘤性的病理综合征。主要侵害宿主的淋巴细胞或网状内皮细胞，严重影响宿主免疫系统的功能，诱发细胞免疫和体液免疫抑制，降低机体对其它病原或抗原的免疫应答，导致不同程度的继发、二重感染和多重感染，减弱鸡群对各种疫苗的免疫力，加剧某些疾病的临床表现。目前REV在我国的流行越来越严重，在某些鸡场中对REV阳性抗体的检出率高达21.4％-71％，其中出现免疫抑制状态的鸡群对REV抗体的阳性检出率要比正常鸡群高的多。 GP90是REV病毒env基因编码的表面囊膜糖蛋白，是病毒的主要免疫蛋白，含有顺序和构象表位，具有受体结合功能，能诱导感染宿主产生较高水平的保护性抗体。对不同地区不同时间分离的REV全基因组测序表明，env基因序列同源性在92％以上，其不同主要由编码gp90的基因引起，提示gp90可能与病毒的变异、毒力、致病性、致病机理等有关。本研究将含有经EcoRI和SalI双酶切和基因测序鉴定正确的gp90基因的重组质粒pGEX-6P-1-gp90转化进宿主菌BL21中，在37℃ 0.5mMIPTG诱导下，gp90基因以融合蛋白的形式获得了良好的表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，证实其表达的融合蛋白的大小为64KD，表达形式为包涵体。通过包涵体纯化的方法，将获

关键词：禽网状内皮组织增殖病病毒 gp90基因表达间接免疫荧光

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禽白血病病毒J亚群与禽网状内皮组织增殖病病毒协同致病作用研究

禽白血病病毒J亚群与禽网状内皮组织增殖病病毒协同致病作用研究

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作者：程相雨山东农业大学

学位级别：硕士

在自然界中病毒共感染的现象普遍存在,病毒共感染后常表现出相互促进或相互抑制的情况,并且病毒共感染后临床特征、病理表现、传染能力和临床指标都会发生变化。禽白血病（Avian leucosis,AL）是指由禽白血病病毒（Avian leucosis virus... 详细信息

在自然界中病毒共感染的现象普遍存在,病毒共感染后常表现出相互促进或相互抑制的情况,并且病毒共感染后临床特征、病理表现、传染能力和临床指标都会发生变化。禽白血病（Avian leucosis,AL）是指由禽白血病病毒（Avian leucosis virus,ALV）和禽肉瘤病毒群病毒（Avian sarcoma viruses,ASVs）引起的一种能够引起免疫抑制、生长迟缓等症状的肿瘤性疾病。禽网状内皮组织增殖病（Reticuloendotheliosis disease,RE）是由禽网状内皮组织增殖病病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）引起的一种可致禽类免疫抑制、生长迟缓和死淘增加的肿瘤性疾病。这两种病毒在临床上都能够造成严重的免疫抑制和生长迟缓。先前研究调查数据显示,我国ALV-J和REV共感染的现象严重,ALV-J和REV共感染的案例在我国频繁出现,对鸡群造成严重影响。因此,掌握ALV-J与REV共感染的发生规律对家禽致病、传染、免疫抑制等方面变化的研究,是后续实现联合防控和净化这两种疾病的关键。为了研究ALV-J与REV的协同致病作用,将400枚SPF鸡胚随机分成4组,平均每组100枚,6胚龄时通过尿囊腔接种,ALV-J感染组接103.0TCID50ALV-J感染细胞培养上清;REV感染组接种103.2TCID50REV感染细胞培养上清;共感染组对半接种10～3TCID50ALV-J与103.2TCID50REV感染细胞培养上清混合液;Mock组接种DMEM。孵化后经过qPCR检测是否接毒成功。为了明确ALV-J与REV共感染对ALV-J感染的影响,在各个时间点收集血样和泄殖腔拭子等样品。检测发现,共感染组鸡ALV-J病毒血症阳性率在所有检测时间点都高于单感染组,尤其在14、28、42和49日龄,分别比单感染组高11%、18%、21%和20%。7日龄共感染组鸡病毒排毒阳性率为70%,平均p27 OD630值为0.452;而单感染组ALV-J病毒排毒阳性率为50%,平均p27 OD630值为0.339,表明ALV-J与REV共感染不仅能够显著提升ALV-J病毒血症阳性率,同时还会提高病毒血症水平。此外共感染还导致抗ALV-J抗体产生的推迟,通过血清样品检测发现,ALV-J单感染组在6周龄时少数鸡产生抗ALV-J抗体,而共感染组在整个检测时间段内均未产生抗ALV-J抗体,表明ALV-J与REV共感染导致更严重的免疫抑制,从而导致抗ALV-J抗体产生推迟。组织病毒载量检测结果显示,共感染组ALV-J载量在脾脏、胸腺和法氏囊等器官中显著升高,这表明ALV-J与REV共感染增强ALV-J对免疫器官的靶向性。为明确ALV-J与REV共感染对REV的影响,检测共感染组鸡和REV单感染组鸡REV病毒血症阳性率。结果显示,共感染组病毒血症阳性率相比于单感染组没有显著的差别,但共感染组病毒排毒率和抗REV抗体水平相比于单感染组有显著的变化,首先共感染组排毒阳性率在28日龄前都低于REV单感染组,而单感染组的病毒排毒阳性率在21日龄时达到顶峰后开始下降;共感染组的REV排毒阳性率在整个时间段内都保持上升的趋势,在28日龄后超过单感染组REV病毒排毒阳性率,表明ALV-J与REV共感染提高了REV的病毒血症阳性率,并且能够延长病毒排毒时间。为了明确ALV-J与REV共感染对机体免疫系统的影响。在7日龄,4个组中各随机抽选30只鸡,通过腹腔接种鸡新城疫、禽流感（H9亚型）、禽腺病毒（Ⅰ群4型）3联灭活苗。接种后的第14、28和42d采血,检测血液中新城疫和腺病毒抗体效价。检测发现,42天时共感染组腺病毒和新城疫的抗体水平显著低于两个单感染组的抗体水平,表明ALV-J与REV共感染显著降低机体对疫苗的应答能力。为了评估ALV-J与REV共感染对感染鸡免疫器官的影响,在14、28和42日龄每组随机挑选3只鸡剖杀,取免疫器官,检测免疫器官指数、炎症因子水平和病理组织学变化。结果显示,ALV-J与REV共感染组的脾脏免疫指数在42日龄显著高于两个单感染组;而在所有检测时间点,胸腺和法氏囊的免疫器官指数要显著的低于两个单感染组,表明ALV-J与REV共感染导致脾脏肿大,胸腺和法氏囊萎缩。在14、28和42日龄时,检测脾脏内IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IFN-γ和TNF-α。结果显示,共感染组IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的表达水平显著高于单感染组。而共感染组IL-4、IL-10、IL-12和IL-13因子表达水平相比与单感染组显著下降。IL-2和IFN-γ是Th1型细胞介导分泌的细胞因子;IL-4、IL-10和IL-13是Th2型细胞介导分泌的细胞因子。Th1/Th2细胞

关键词：禽白血病病毒J亚群禽网状内皮组织增殖病病毒协同致病抗原抗体消长规律免疫抑制

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