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中国兽医病理学2017年学术研讨会暨兽医病理学分会第九届全国会员代表大会

作者：付礼胜侯宁王晓燕高雪丽刘超男吕晓萍郑世民东北农业大学动物医学学院黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨 150030 东北农业大学动物医学学院黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨 150030 秦皇岛圣蓝皇家海洋公园秦皇岛 066000

为探索禽网状内皮组织增生病病毒(REV)感染对雏鸡中枢免疫器官细胞凋亡及其相关酶活性和基因表达的影响。将70 只1 日龄SPF 雏鸡随机分为REV 感染组和未感染病毒的对照组,应用酶活性检测、荧光定量PCR、ELISA、TUNEL 等方法对胸腺和法... 详细信息

为探索禽网状内皮组织增生病病毒(REV)感染对雏鸡中枢免疫器官细胞凋亡及其相关酶活性和基因表达的影响。将70 只1 日龄SPF 雏鸡随机分为REV 感染组和未感染病毒的对照组,应用酶活性检测、荧光定量PCR、ELISA、TUNEL 等方法对胸腺和法氏囊细胞的Caspase-3 和Caspase-9 活性、Bcl-2 mRNA 及其蛋白表达和凋亡细胞的动态变化进行了系统检测。结果发现,REV 感染SPF 雏鸡后,其上述免疫器官无论是细胞凋亡数量还是Caspase-3 与Caspase-9 活性、Bcl-2 mRNA 及其蛋白表达均不同程度的高于未感染病毒的对照雏鸡。表明REV 感染引起SPF 雏鸡中枢免疫器官Caspase-3 和Caspase-9 活性增强、Bcl-2 mRNA 及其蛋白表达上调所致的细胞凋亡与雏鸡免疫器官功能抑制密切相关。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 Caspase-3 Caspase-9 Bcl-2 细胞凋亡

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禽网状内皮组织增生病病毒套式PCR检测方法的建立

禽网状内皮组织增生病病毒套式PCR检测方法的建立

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中英禽病国际研究中心成立典礼暨中英禽病最新研究进展研讨会

作者：毕研丽孙翠平王金良郭广君吕素芳苗立中沈志强山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

根据GenBank中登录的禽网状内皮组织增生病病毒(RaEV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467bp,内部引物的扩增片段大小为314bp.建立了适合REV快速检测的套式PCR方法.采用该方法对REV毒株进行了检测,结果显示能扩增... 详细信息

根据GenBank中登录的禽网状内皮组织增生病病毒(RaEV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467bp,内部引物的扩增片段大小为314bp.建立了适合REV快速检测的套式PCR方法.采用该方法对REV毒株进行了检测,结果显示能扩增到314bp的条带;禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性.该方法第1次扩增的敏感性是100pg,第2次扩增的敏感性是1fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍.所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽网状内皮组织增生病的临床诊断和分子流行病学调查.

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒基因组序列套式聚合酶链锁反应

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禽网状内皮组织增生病病毒感染对SPF雏鸡胸腺、法氏囊细胞凋亡及相关因子表达的影响

禽网状内皮组织增生病病毒感染对SPF雏鸡胸腺、法氏囊细胞凋亡及...

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中国兽医病理学2017年学术研讨会暨兽医病理学分会第九次全国会员代表大会

作者：付礼胜侯宁王晓燕高雪丽刘超男吕晓萍郑世民东北农业大学动物医学学院黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

为探索禽网状内皮组织增生病病毒(REV)感染对雏鸡中枢免疫器官细胞凋亡及其相关酶活性和基因表达的影响。将70只1日龄SPF雏鸡随机分为REV感染组和未感染病毒的对照组,应用酶活性检测、荧光定量PCR、ELISA、TUNEL等方法对胸腺和法氏囊细... 详细信息

为探索禽网状内皮组织增生病病毒(REV)感染对雏鸡中枢免疫器官细胞凋亡及其相关酶活性和基因表达的影响。将70只1日龄SPF雏鸡随机分为REV感染组和未感染病毒的对照组,应用酶活性检测、荧光定量PCR、ELISA、TUNEL等方法对胸腺和法氏囊细胞的Caspase-3和Caspase-9活性、Bcl-2 m RNA及其蛋白表达和凋亡细胞的动态变化进行了系统检测。结果发现,REV感染SPF雏鸡后,其上述免疫器官无论是细胞凋亡数量还是Caspase-3与Caspase-9活性、Bcl-2 m RNA及其蛋白表达均不同程度的高于未感染病毒的对照雏鸡。表明REV感染引起SPF雏鸡中枢免疫器官Caspase-3和Caspase-9活性增强、Bcl-2 m RNA及其蛋白表达上调所致的细胞凋亡与雏鸡免疫器官功能抑制密切相关。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 Caspase-3 Caspase-9 Bcl-2 细胞凋亡

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禽网状内皮组织增生病病毒的分离鉴定及其体外复制研究

禽网状内皮组织增生病病毒的分离鉴定及其体外复制研究

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全球肉鸡产业论坛暨第二届中国白羽肉鸡产业发展大会

作者：邓小芸祁小乐高玉龙高宏雷秦立廷王永强高立王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起鸡、鸭、鹅、火鸡及其它禽类的网状内皮组织增殖病(Reticuloendotheliosis,RE),它是以急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征、淋巴组织和其它组织的慢性肿瘤形成为特征的一... 详细信息

禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起鸡、鸭、鹅、火鸡及其它禽类的网状内皮组织增殖病(Reticuloendotheliosis,RE),它是以急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征、淋巴组织和其它组织的慢性肿瘤形成为特征的一群病理综合征。该病是除马立克氏病和白血病以外的第三种禽类病毒性肿瘤病,也是一种重要的免疫抑制病。该病在澳大利亚、匈牙利、英国、德国

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 CEF 复制动力学间接免疫荧光检测体外复制分离鉴定

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禽网状内皮组织增生病病毒检测方法研究进展

禽网状内皮组织增生病病毒检测方法研究进展

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首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛

作者：杨娟何召庆乾元浩生物股份有限公司

本文综述了禽网状内皮组织增生病病毒分子生物学特性和病毒检测方法,为检测并预防禽网状内皮组织增生病提供参考。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒检测

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禽网状内皮组织增生病病毒套式PCR检测方法的建立

禽网状内皮组织增生病病毒套式PCR检测方法的建立

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第六届南京农业大学畜牧兽医学术年会——猪禽疫病综合防控研讨会

本文根据GenBank中登录的禽网状内皮组织增生病病毒(REV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合REV快速检测的套式PCR方法。采用该方法对REV毒株进行了检测,结果显... 详细信息

本文根据GenBank中登录的禽网状内皮组织增生病病毒(REV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合REV快速检测的套式PCR方法。采用该方法对REV毒株进行了检测,结果显示能扩增到314bp的条带;禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽网状内皮组织增生病的临床诊断和分子流行病学调查。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒基因组序列套式PCR检测临床应用

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禽网状内皮组织增生病病毒囊膜糖蛋白gp90的原核表达及单抗的制备

禽网状内皮组织增生病病毒囊膜糖蛋白gp90的原核表达及单抗的制备

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会

作者：黄翌吴海燕曹红郑世军陈福勇中国农业大学动物医学院

本研究以本实验室保存的REV毒株为模板,扩增了env-gp90基因,构建重组质粒pGEX-6p-1-gp90及pET-28a-gp90,诱导表达后成功得到目的蛋白。Western-Blot结果证明蛋白产物能与REV阳性血清发生特异性反应。用重组蛋白免疫8周龄Balb/c小鼠,4次... 详细信息

本研究以本实验室保存的REV毒株为模板,扩增了env-gp90基因,构建重组质粒pGEX-6p-1-gp90及pET-28a-gp90,诱导表达后成功得到目的蛋白。Western-Blot结果证明蛋白产物能与REV阳性血清发生特异性反应。用重组蛋白免疫8周龄Balb/c小鼠,4次免疫后取其脾细胞与sp2/0细胞融合,得到阳性孔,用有限稀释法进行亚克隆,后续工作正在进行。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 gp90蛋白原核表达单克隆抗体

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表达禽网状内皮组织增生病病毒env基因的重组马立克病毒的生物学特性

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畜牧兽医学报 2018年第7期49卷 1482-1491页

作者：周忠文林桂芳王好好苏帅崔治中孙淑红山东农业大学动物医学院泰安271018 山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室泰安271018 山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心泰安271018

旨在构建能够表达禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)env基因的重组马立克病毒(Marek′s disease virus,MDV),并对其生物学特性进行初步研究。以REV SNV株DNA为模板,PCR扩增其env基因,克隆进真核表达载体pcDNA3... 详细信息

旨在构建能够表达禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)env基因的重组马立克病毒(Marek′s disease virus,MDV),并对其生物学特性进行初步研究。以REV SNV株DNA为模板,PCR扩增其env基因,克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+);以其为模板,PCR扩增整个REVenv基因真核表达盒并与卡那霉素抗性基因分别克隆进pUC18载体;以其为模板,利用含有MDV SC9-1株meq基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REVenv真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用Red E/T同源重组技术插入SC9-1的meq位点,最终利用阿拉伯糖诱导表达flp重组酶,敲除卡那霉素抗性基因,阳性重组质粒命名为SC9-env BAC。提取SC9-env BAC质粒转染CEF细胞,拯救重组MDV,利用MDV单抗H19以及REV单抗11B118经间接免疫荧光试验鉴定阳性病毒,命名为SC9-env。分析比较SC9-env在CEF细胞上的复制水平,利用动物试验初步评价SC9-env对SPF鸡的致病性以及SC9-env对SPF鸡感染MDV、REV的免疫保护效果。结果表明,利用同源重组技术构建的重组MDV SC9-env能够稳定表达REV env蛋白,且复制水平与亲本病毒SC9-1相似;该重组毒接种SPF鸡没有明显的致病性,且对rMd5的强毒攻击提供92%的免疫保护,与SC9-1差异不显著;SC9-env显著降低REV感染SPF鸡所引起的体重减轻以及灭活苗抗体下降。构建的表达REVenv的重组MDV对感染MDV、REV的SPF鸡具有良好的免疫保护效果。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 env基因同源重组马立克病毒生物学特性

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宿主波形蛋白在禽网状内皮组织增生病病毒感染中的作用机制研究

宿主波形蛋白在禽网状内皮组织增生病病毒感染中的作用机制研究

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作者：胡峰中国农业科学院

学位级别：博士

禽网状内皮组织增生病（Reticuloendotheliosis,RE）是严重危害养禽业的传染性肿瘤病之一,也是重要的免疫抑制病。禽网状内皮组织增生病病毒（Reticuloendotheliosisvirus,REV）感染主要造成网状内皮细胞增生,诱发机体免疫抑制和矮小综... 详细信息

禽网状内皮组织增生病（Reticuloendotheliosis,RE）是严重危害养禽业的传染性肿瘤病之一,也是重要的免疫抑制病。禽网状内皮组织增生病病毒（Reticuloendotheliosisvirus,REV）感染主要造成网状内皮细胞增生,诱发机体免疫抑制和矮小综合征等,同时REV能污染马立克氏病病毒疫苗、禽痘病毒疫苗等生物制品,从而降低疫苗的免疫效果。目前,REV常和马立克氏病病毒、白血病病毒、传染性贫血病病毒、传染性法氏囊病病毒等禽的免疫抑制性病毒混合感染,使疾病的发生更为严重,且有加重趋势。随着我国养殖业的集约化发展,REV感染造成的损失已经严重影响了养禽业的经济效益,所以,有必要对REV感染及致病机制进行深入研究。目前,对REV的研究主要局限在基因组的插入整合、混合感染、疫苗污染等方面,但病毒编码蛋白的功能及其在感染和致病过程中与宿主蛋白之间相互作用等方面的研究鲜有报道,有待于开展。病毒与宿主相互作用在病毒感染过程中发挥重要作用,研究REV与宿主相互作用有助于了解病毒的复制机制。在本实验室的前期研究中,采用蛋白质组学方法并结合双向电泳技术,获得了REV感染SPF鸡的脾脏差异蛋白质数据,经过质谱分析成功鉴定出包括波形蛋白（vimentin）在内的28种差异表达蛋白。研究报道,宿主vimentin在多种病毒的感染过程中发挥重要作用。本研究旨在探讨vimentin在REV感染中的作用。本研究首先利用建立的检测vimentin基因的Real time PCR方法检测vimentin基因在不同组织脏器中的分布,结果表明vimentin蛋白广泛表达于所检测的各组织脏器中,其中胸腺、法氏囊和脾脏含量最高。同时检测发现,REV感染后导致易感细胞CEF和主要靶器官脾脏中vimentin上调表达。利用靶向vimentin蛋白的特异性RNAi分子沉默CEF细胞内源性vimentin蛋白的表达,可抑制REV基因组的复制、蛋白的表达以及REV的增殖。利用能特异性破坏vimentin蛋白结构的药物丙烯酰胺处理REV易感细胞CEF,同样可抑制REV基因组的复制、蛋白的表达以及REV的增殖。这说明,宿主细胞vimentin有利于REV的复制。为进一步探索宿主vimentin影响REV复制的机制,本研究首先通过密码子优化和蛋白表达条件的优化,对REV蛋白酶（protease,PR）进行了可溶性表达。以表达的REV自身蛋白p18-p30为底物,对其酶活性进行分析,结果显示可溶性表达的PR蛋白具有良好的蛋白酶活性,能有效切割底物p18-p30,并且PR活性的发挥受温度、p H值、离子等因素的影响。进一步研究发现PR蛋白对原核和真核表达的vimentin蛋白均具有切割作用,将PR蛋白截短表达以及将其活性中心DTG基序突变为DSG后,结果显示PR均不能有效切割vimentin,这表明PR的这种切割作用依赖于其蛋白分子结构和活性中心DTG基序。将表达PR蛋白的真核表达质粒p CAGGS-PR转染细胞,真核表达的PR蛋白对细胞内源性vimentin蛋白同样具有切割作用。激光共聚焦试验结果显示,真核表达PR蛋白能够导致细胞中的vimentin在细胞核周围发生聚集,同样的REV感染后也能改变vimentin在宿主细胞内的分布,在细胞核周围发生聚集,且与REV结构蛋白共定位。综上,REV感染导致宿主vimentin上调表达;宿主vimentin有利于REV的复制;REV PR在体内外具有切割宿主vimentin的作用,而且这种切割作用依赖于PR蛋白的分子结构和活性中心DTG基序;REV感染后通过PR与宿主的互作而改变vimentin在宿主细胞内的分布,在细胞核周围发生聚集,且与病毒蛋白共定位,这可能有利于病毒蛋白的聚集和病毒“复制工厂”的建立,这是vimentin参与REV感染和复制的分子机制之一。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒波形蛋白蛋白切割蛋白分布病毒复制

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大蒜素改善禽网状内皮组织增生病病毒感染SPF鸡免疫功能的机制

大蒜素改善禽网状内皮组织增生病病毒感染SPF鸡免疫功能的机制

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作者：王丽媛山东农业大学

学位级别：硕士

禽网状内皮组织增生症病毒(REV)为禽C型逆转录病毒,感染后主要引发禽类生长抑制、急性网状细胞肿瘤、淋巴以及其他组织的慢性肿瘤。在该病的发生、发展过程中,免疫抑制起到了至关重要的作用,但是其潜在的分子机制尚不清楚。本研究以REV ... 详细信息

禽网状内皮组织增生症病毒(REV)为禽C型逆转录病毒,感染后主要引发禽类生长抑制、急性网状细胞肿瘤、淋巴以及其他组织的慢性肿瘤。在该病的发生、发展过程中,免疫抑制起到了至关重要的作用,但是其潜在的分子机制尚不清楚。本研究以REV SNV-C5株人工接种SPF鸡,初步探讨了免疫抑制过程中可能发挥作用的细胞因子及相关信号通路。大蒜素是大蒜的主要有效成分,对多种病毒和致病菌均有良好的抵抗能力。针对REV感染,目前尚缺乏安全有效的疫苗及特效药物进行防制。本研究采用添加不同浓度大蒜素的日粮饲喂REV感染的SPF鸡,探讨大蒜素对REV感染鸡的免疫调节作用,以期为合理有效的防控REV提供新的思路。研究一大蒜素缓解REV感染引起的SPF鸡生长抑制及免疫抑制试验采用100TCID50 REV攻毒处理7d SPF雏鸡后饲喂添加有不同浓度大蒜素(0、300mg/kg、600mg/kg)的日粮,并设置大蒜素单独处理组(0、150mg/kg、300mg/kg)。于感染后2W、3W、4W、5W采集胸腺、脾脏和法氏囊样品。研究结果表明,与对照组相比,REV感染后2W始显著抑制了SPF鸡的生长发育(P<0.0001),胸腺(P<0.05)、法氏囊指数(P<0.05)显著降低,脾脏指数显著升高(P<0.05),脾脏淋巴细胞活性降低(P<0.05)。添加300mg/kg大蒜素日粮有效缓解了REV感染引起的生长抑制(P<0.0001)及免疫器官异常发育(P<0.05),提高脾脏淋巴细胞活性(P<0.0001)。单独饲喂大蒜素对机体生长发育无显著影响(P>0.05)。上述结果表明REV感染引起了机体的免疫抑制,大蒜素有效缓解REV感染诱导的免疫抑制。研究二大蒜素缓解REV引起SPF鸡的炎性反应应用研究一中模型,检测大蒜素及REV处理对试验鸡内源性免疫相关炎性因子表达的影响。结果显示,REV感染后显著提高促炎性因子IL-1(P<0.01)、TNF-α(P<0.01)、IFN-γ(P<0.01),抗炎因子IL-4(<0.01)、IL-10(P<0.05)的含量及其转录水平。REV感染鸡脾脏中MDA5(P<0.05)、TLR3(P<0.05)、TLR4(P<0.01)、TLR7(P<0.05)及其接头分子MyD88(P<0.05)表达水平显著升高。炎性信号通路MAPK包括p38(P<0.05)、ERK(P<0.05)、JNK(P<0.05)磷酸化水平显著升高,NF-κB移位入核(P<0.01)显著增加。此外,STAT6信号通路在REV感染过程中转录水平显著升高(P<0.01),促进下游ISG12-1(P<0.05)、IRF(P<0.01)转录表达。大蒜素有效抑制了炎性因子以及TLRs等受体的异常变化变化,降低MAPK、NF-κB的磷酸化水平。此外,研究发现,ERK抑制剂能够抑制REV基因复制(P<0.0001)。上述结果表明,REV侵入机体后可能与TLRs及MDA5等模式识别受体结合,激发炎性反应,引发机体内源性免疫应答,而大蒜素抑制了REV的复制,缓解感染引起的炎症反应,揭示大蒜素对REV感染有一定的缓解作用。研究三大蒜素减轻REV感染导致SPF鸡氧化损伤应用研究一中模型,检测大蒜素及REV处理对试验鸡抗氧化系统的影响。结果显示,与对照组相比,REV感染后血清中CAT(P=0.1024)、SOD(P<0.05)、GPx(P<0.05)活性显著降低,GSH含量降低(P<0.05),MDA(P<0.05)和蛋白质羰基(P<0.01)含量显著升高。REV长期感染导致胸腺中抗氧化酶活性降低,氧化应激产物含量升高,胸腺(P<0.05)、脾脏(P<0.05)中Nrf2磷酸化水平升高,表明REV感染导致机体一定程度的氧化损伤,破坏机体的抗氧化-氧化平衡。REV感染后饲喂大蒜素有效提高抗氧化酶活性,减少Nrf2入核,提高机体抗氧化能力。研究四大蒜素及REV感染对脂肪细胞的影响研究一发现REV感染显著降低了机体腹脂沉积量(P<0.05)。本试验初步探讨了REV感染对脂肪细胞的影响以及大蒜素的作用。试验应用15胚龄的SPF鸡胚建立体外脂肪细胞培养模型,分别用0 TCID50、5 TCID50、10 TCID50、20 TCID50、40 TCID50 REV处理诱导分化成熟的脂肪细胞0h、12h、24h、48h、72h,发现20 TCID50、40 TCID50 REV感染脂肪细胞1h后显著促进脂肪细胞因子TNF-α的表达(P<0.01),磷酸化p38(P<0.01)、ERK(P<0.0001)、JNK(P<0.0001)以及NF-κB(P<0.0001),表明REV感染引起了脂肪细胞内炎症反应。REV感染脂肪细胞后激活了AMPK(P<0.0001)信号途径,促进了脂肪细胞内能量代谢,抑制

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒大蒜素炎性反应氧化损伤

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