检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2020年第5期50卷 643-649页

作者：吴乐高海婷刘超男高雪丽张淑君周放吕晓萍边洋郑世民东北农业大学动物医学学院黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150030

为了探索禽网状内皮组织增生病病毒(REV)感染SPF雏鸡后,对其胸腺细胞增殖、细胞周期分布以及Cyclin D1的影响,将66只1日龄SPF雏鸡随机分为REV感染组和对照组,使用Cell counting Kit-8、流式细胞术、Western-blot、荧光定量PCR等方法对... 详细信息

为了探索禽网状内皮组织增生病病毒(REV)感染SPF雏鸡后,对其胸腺细胞增殖、细胞周期分布以及Cyclin D1的影响,将66只1日龄SPF雏鸡随机分为REV感染组和对照组,使用Cell counting Kit-8、流式细胞术、Western-blot、荧光定量PCR等方法对雏鸡胸腺细胞增殖、细胞周期及Cyclin D1 mRNA和蛋白的动态变化进行检测。结果发现,REV感染SPF雏鸡后,其胸腺细胞的增殖能力于第14、21、28天明显低于对照雏鸡;G0/G1期细胞数于第14天较对照雏鸡明显(P<0.05)升高,S、G2/M期细胞数量减少,第28天时相反;Cyclin D1 mRNA表达于第14天极显著(P<0.01)低于对照雏鸡,第35天时极显著高于(P<0.01)对照雏鸡;Cyclin D1蛋白量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)低于对照雏鸡。结果表明,感染REV后,雏鸡免疫机能下降可能与胸腺细胞增殖能力下降、细胞周期素D1 mRNA转录及蛋白质水平的异常表达相关。

关键词： SPF雏鸡禽网状内皮组织增生病病毒胸腺细胞细胞周期细胞周期素D1

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商品肉鸡群MDV和REV混合感染所致肿瘤的检测

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中国家禽 2009年第12期31卷 54-55页

作者：黄志永宋中宝彭丽荣韦平广西融安县水产畜牧兽医局广西融安545400 广西大学养禽与禽病研究所广西南宁530005

马立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV）和禽网状内皮组织增生病病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）是引起禽类肿瘤病的两种重要的病原，这两种病毒感染不仅能引起肿瘤，还可以引起感染鸡胸腺、法氏囊等免疫器官萎缩，... 详细信息

马立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV）和禽网状内皮组织增生病病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）是引起禽类肿瘤病的两种重要的病原，这两种病毒感染不仅能引起肿瘤，还可以引起感染鸡胸腺、法氏囊等免疫器官萎缩，导致感染鸡产生免疫抑制，致使机体免疫应答降低和对其它疾病的易感性增高，是导致当前养禽业生产性能下降的重要因素之一。

关键词：混合感染肉鸡群肿瘤病禽网状内皮组织增生病病毒 REV MDV 马立克氏病病毒 virus

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REV感染对SPF雏鸡外周血液B淋巴细胞功能和免疫球蛋白含量的影响

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黑龙江畜牧兽医 2021年第18期 69-73页

作者：崔新华边洋高海婷高雪丽刘超男吕晓萍郑世民东北农业大学动物医学学院黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150030

为了探索禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)感染对SPF雏鸡外周血液B淋巴细胞功能和免疫球蛋白含量变化的影响,试验将100只1日龄SPF雏鸡随机分为REV感染组和对照组,REV感染组(50只)雏鸡通过腹腔注射REV稀释液(0... 详细信息

为了探索禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)感染对SPF雏鸡外周血液B淋巴细胞功能和免疫球蛋白含量变化的影响,试验将100只1日龄SPF雏鸡随机分为REV感染组和对照组,REV感染组(50只)雏鸡通过腹腔注射REV稀释液(0.5 mL/只),对照组(50只)雏鸡相同途径给予等量灭菌生理盐水,于REV感染后第1,7,14,21,28,42天,每组随机抽取5只,心脏无菌采血,应用细胞培养技术结合MTT和免疫学等检测方法,检测REV感染对SPF雏鸡外周血液B淋巴细胞增殖能力和IgG、IgA、IgM含量的影响。结果表明:SPF雏鸡感染REV后1~42 d,外周血液中无论是B淋巴细胞对脂多糖(LPS)的增殖能力还是血清IgG、IgA、IgM含量均不同程度低于对照组雏鸡,其中REV感染组B淋巴细胞对LPS的增殖能力在REV感染后第7,14天显著或极显著低于对照组雏鸡(P<0.05或P<0.01);IgG含量在REV感染后第14,28天显著低于对照组雏鸡(P<0.05);IgA含量在REV感染后第21,28,42天显著或极显著低于对照组(P<0.05或P<0.01);IgM含量在REV感染后第42天极显著低于对照组(P<0.01)。说明REV感染可导致SPF雏鸡外周血液的B淋巴细胞功能下降和免疫球蛋白IgG、IgA、IgM含量下降。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 SPF雏鸡外周血液 B淋巴细胞增殖能力免疫球蛋白

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SPF雏鸡感染REV引起脾脏氧化-抗氧化的平衡紊乱

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动物医学进展 2020年第8期41卷 132-136页

作者：卢静刘雪洁邹连慧郑世民刘超男吕晓萍高雪丽东北农业大学动物医学学院黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150030

为探究氧化-抗氧化平衡紊乱在禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)致病机制中的作用,对感染REV后3、7、14、21、28和35 d的SPF雏鸡脾脏进行过氧化氢(H2O2)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、总抗氧化能力(tota... 详细信息

为探究氧化-抗氧化平衡紊乱在禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)致病机制中的作用,对感染REV后3、7、14、21、28和35 d的SPF雏鸡脾脏进行过氧化氢(H2O2)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、总抗氧化能力(total-antioxidante capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力、过氧化氢酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPx1)蛋白含量及mRNA表达、脾脏器官指数的检测。结果显示,SPF雏鸡感染REV后,脾脏H2O2、MDA含量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),T-AOC、抗氧化酶等抗氧化指标及器官指数分别于不同时间不同程度显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),表明SPF雏鸡感染REV后,脾脏发生氧化应激,抗氧化功能和免疫功能下降,氧化-抗氧化平衡紊乱可在REV致病机制中发挥作用。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒脾脏氧化-抗氧化 SPF雏鸡

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REV-env蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化及其免疫原性的评估

REV-env蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化及其免疫原性的评估

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作者：杨彦超中国农业科学院

学位级别：硕士

禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis,RE)是由禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起的一群病理综合征,主要表现为生长迟缓、急性网状细胞肿瘤和淋巴组织慢性肿瘤。REV通常与其他病毒混合感染,并易整... 详细信息

禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis,RE)是由禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起的一群病理综合征,主要表现为生长迟缓、急性网状细胞肿瘤和淋巴组织慢性肿瘤。REV通常与其他病毒混合感染,并易整合到宿主基因组中,再加上感染后的免疫抑制,导致RE的防控工作越来越困难。本研究旨在通过对env蛋白和gp90蛋白免疫原性的比较,从而筛选出免疫原性更好的蛋白,为RE亚单位疫苗的研究奠定基础。首先,本研究选择毕赤酵母表达系统对REV的囊膜蛋白env进行了表达,构建了含有多个Menv表达盒的重组SMD1168菌株和重组GS115菌株,在摇瓶内利用甲醇进行诱导表达。结果表明,重组env蛋白在构建的重组毕赤酵母菌株中均能成功表达,在GS115菌株中的表达量明显超过在SMD1168菌株中的表达量;重组菌株GS115/pAO815-2Menv的表达量高于GS115/pAO815-4Menv和GS115/pAO815-6Menv的表达量,说明表达盒数量的增加对env蛋白的表达量没有显著的提升作用。通过对诱导条件的优化,重组菌株GS115/pAO815-2Menv在摇瓶内的表达量可达到0.5 g/L。为了获得大量的重组env蛋白和gp90(上清)蛋白,本研究对两种蛋白的发酵培养条件进行了一系列的优化,并对发酵得到的蛋白进行纯化,将纯化前后的蛋白分别置于室温、4℃和-20℃保存以比较其稳定性。结果表明,重组菌株GS115/pAO815-2Menv在29℃、pH=5.5的条件下发酵培养,env蛋白的表达量最高,高达3.5 g/L;重组菌株SMD1168/pPIC9k-gp90在27℃、pH=6.0的条件下发酵培养,gp90(上清)蛋白的表达量最高,高达1.1 g/L;可以通过亲和层析的方法得到纯度较高的重组env蛋白和gp90(菌体)蛋白,gp90(上清)蛋白通过30 kD的超滤管进行浓缩处理;三种蛋白经纯化后稳定性有所提升,但不显著,仍存在严重的降解问题。通过动物攻毒保护实验,对gp90(上清)蛋白、gp90(菌体)蛋白和env蛋白的免疫原性进行了比较。结果表明,三种蛋白均能产生较高水平的ELISA抗体和中和抗体。同时,相对于对照组的病毒载量,gp90(上清)蛋白免疫组的病毒载量降低2.36×10～5倍,gp90(菌体)蛋白免疫组的病毒载量降低6.61×10～3倍,env蛋白免疫组的病毒载量降低6.08×10～3倍。这些结果表明,三种蛋白均具备良好的免疫原性。本研究成功实现了env蛋白在毕赤酵母中的表达,并通过优化发酵培养的条件,可获得大量免疫原性良好的重组蛋白,能有效保护SPF鸡免受REV的感染。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒毕赤酵母发酵免疫原性

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REV感染对SPF雏鸡胸腺MDA-5调控IFN-β信号通路的影响及机制研究

REV感染对SPF雏鸡胸腺MDA-5调控IFN-β信号通路的影响及机制研究

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作者：吴文杰东北农业大学

学位级别：硕士

禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)是一种携带RNA的逆转录病毒。REV感染禽后,可引起严重的禽免疫抑制性疾病。胸腺在REV感染后明显萎缩,这与REV导致的宿主免疫机能下降密切相关。黑色素瘤分化相关基因-5(melan... 详细信息

禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)是一种携带RNA的逆转录病毒。REV感染禽后,可引起严重的禽免疫抑制性疾病。胸腺在REV感染后明显萎缩,这与REV导致的宿主免疫机能下降密切相关。黑色素瘤分化相关基因-5(melanoma differentiation-associated gene-5,MDA-5)属于视黄酸诱导基因(retinoic acid-inducible gene,RIG)蛋白-I样受体(RIG-like receptors,RLRs)家族,是一种病毒RNA的胞内模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)。MDA-5识别胞内的病毒RNA后,通过接头分子线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling,MAVS)蛋白调节多条信号通路,促使β-干扰素(interferon-β,IFN-β)启动子启动转录、介导抗病毒天然免疫。本学科团队的前期研究表明,REV感染上调了鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)中MDA-5 mRNA表达。IFN-β在抗REV感染中发挥重要作用。为了探究REV感染SPF雏鸡后,病毒对雏鸡胸腺MDA-5/IFN-β信号通路的影响,以及与胸腺组织和超微结构病理变化的内在关联。本研究以1日龄无特定病原体(specific pathogen free,SPF)雏鸡为研究对象,应用分子生物学技术,测定了REV感染SPF雏鸡后1～28天,其胸腺病毒载量、MDA-5下游两条信号通路相关因子mRNA表达和蛋白含量的变化;应用组织病理学方法和透射电子显微镜技术,观察了胸腺组织形态结构和超微结构的病理变化。主要研究结果如下:(1)REV感染SPF雏鸡后1～14天,均能在胸腺中检测到REV核酸。表明胸腺是REV作用的主要靶器官之一。(2)REV感染SPF雏鸡后,其胸腺MDA-5、MAVS和肿瘤坏死因子受体相关因子-3(tumor necrosis factor receptor-associated factor-3,TRAF-3)mRNA表达在病毒感染后1～7天高于对照雏鸡,14～28天低于对照雏鸡。病毒感染雏鸡胸腺MDA-5蛋白含量于病毒感染后第1天表达上调,随后逐渐下调,且明显低于对照雏鸡。整个实验周期中,REV感染雏鸡胸腺中MAVS蛋白含量均不同程度地增多。而TRAF-3蛋白含量变化与MAVS基本一致,始终高于对照雏鸡。表明REV感染雏鸡后的早期MDA-5能迅速应答病毒的侵袭,并激活下游相关因子的表达。(3)REV感染SPF雏鸡后1～14天,其胸腺干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)mRNA表达不同程度地增加,而21～28天表达下调,且明显低于对照雏鸡。除第21天外,胸腺STING蛋白含量始终高于对照雏鸡。TANK结合激酶-1(TANK binding kinase-1,TBK-1)mRNA表达在病毒感染后7～14天高于对照雏鸡,而其余被检时间点,均低于对照雏鸡。除第14天外,胸腺TBK-1蛋白含量始终低于对照雏鸡。表明STING信号通路在雏鸡应答REV感染中具有重要作用。(4)REV感染SPF雏鸡后,其胸腺干扰素调节因子-7(interferon refulatory factor-7,IRF-7)无论是mRNA表达还是蛋白含量均在病毒感染后1～7天低于对照雏鸡,而在14～28天均不同程度地增多。磷酸化IRF-7(phospho-IRF-7,p IRF-7)在病毒感染后第1和第21天表达上调,在第7、14和28天表达下调,且低于对照雏鸡,尤其是在第21天差异显著。胸腺IFN-βmRNA表达和蛋白含量在病毒感染后1～28天始终不同程度地高于对照雏鸡,其中,第21天尤为明显。表明REV感染雏鸡引起的胸腺IFN-β表达变化与p IRF-7密切相关。(5)REV感染SPF雏鸡后,其胸腺可见炎性细胞浸润,不同程度的淤血、出血,网状细胞核固缩,淋巴细胞变性、坏死,数量减少,而巨噬细胞增多。超微结构可见,线粒体肿胀变圆,其嵴消失。表明REV感染所致雏鸡胸腺结构的病理损伤是病毒感染后期MDA-5/MAVS/TRAF-3信号通路受抑制的病理学基础。综上所述,REV感染可激活雏鸡胸腺MDA-5和STING信号通路,促进IFN-β的产生。本研究为进一步探讨动物抗逆转录病毒的天然免疫及其机制提供了新的见解。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒视黄酸诱导基因蛋白-I样受体家族黑色素瘤分化相关基因-5 干扰素基因刺激因子 β-干扰素

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泰册松花粉多糖和蜂胶对ALV和REV诱导的免疫抑制鸡的免疫调理作用

泰册松花粉多糖和蜂胶对ALV和REV诱导的免疫抑制鸡的免疫调理作用

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作者：李兵山东农业大学

学位级别：硕士

家禽中存在多种病毒性免疫抑制病，这类疾病不仅能够引起机体原发感染导致死亡，还能侵害家禽的免疫系统，致使机体免疫功能下降，甚至造成疫苗免疫失败。此外，这类疾病易引发其他病毒性和细菌性病原继发感染，因此很难对这些潜伏感染... 详细信息

家禽中存在多种病毒性免疫抑制病，这类疾病不仅能够引起机体原发感染导致死亡，还能侵害家禽的免疫系统，致使机体免疫功能下降，甚至造成疫苗免疫失败。此外，这类疾病易引发其他病毒性和细菌性病原继发感染，因此很难对这些潜伏感染的病原进行确诊。这些免疫抑制性病毒在鸡群中常常呈现多种传染性因子和非传染性因子并存的局面，在生产过程中难以控制和根除。J亚群白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)和禽网状内皮组织增生病病毒(Retieuloendotheliosis virus，REV)同属反转录病毒，两者均能引起禽类不同程度的免疫抑制疾病，是鸡群免疫抑制性病毒的典型代表。养禽业中普遍存在ALV-J和REV混合感染的现象，尤其是近几年，二者共感染现象越发常见。然而，目前尚缺乏安全有效的疫苗对这两种病原进行预防，加之这两种病原诱导产生抗体的水平较低，甚至不诱导抗体，从而造成防控和检测存在困难和疏漏。为了寻找控制ALV-J和REV感染和传播的新方法，本研究用SPF雏鸡建立感染REV和ALV-J的免疫抑制模型，研究两者共感染引发的免疫抑制协同作用;然后选择泰山松花粉多糖（Taishan Pinus massoniana pollen polysaccharide，TPPPS）和蜂胶(Propolis，PP)研究二者对免疫抑制鸡的免疫调理作用，以期为合理有效地防控病毒性免疫抑制疾病提供新的思路。\n 首先建立SPF雏鸡感染ALV-J和REV的免疫抑制模型。将120只健康1日龄SPF雏鸡，随机分成4个组(Ⅰ-Ⅳ)，每组30只。Ⅰ-Ⅲ组的雏鸡分别腹腔注射REV，ALV-J，REV和ALV-J（1∶1混合），建立单独感染及共感染模型;Ⅳ组注射等量生理盐水设为健康对照组。于感染后的7、14、21、28、35、42和56d，每组随机抽取3只，检测相关免疫指标。结果显示病毒单独感染和混合感染均可引起鸡生长发育不良，中枢免疫器官萎缩，免疫器官指数下降，淋巴细胞转化率和CD4+、CD8+T细胞数下降，同时鸡白细胞介素(IL-2)和干扰素(IFN-γ)的分泌量减少，并且在病毒共感染时免疫抑制程度最明显。结果表明ALV-J、REV均能引起鸡的免疫抑制疾病的发生，并且ALV-J与REV之间的确存在一定的协同作用，严重抑制机体免疫器官发育和免疫功能，加重机体的免疫抑制性疾病。\n 然后利用TPPPS和PP对共感染ALV-J和REV的雏鸡进行免疫调理作用。选取健康1日龄SPF雏鸡150只随机分为5个组(Ⅰ-Ⅴ)，每组30只。Ⅰ-Ⅳ组为雏鸡共感染REV和ALV-J组，在相同条件下饲养，Ⅰ、Ⅱ组分别皮下注射TPPPS（50 mg/ml）、PP（50 mg/ml）0.2 ml;Ⅲ组同时注射TPPPS（50 mg/ml）0.1ml和PP（50 mg/ml）0.1 ml;Ⅳ组注射相同含量的生理盐水作为对照;Ⅴ组设为健康对照组，在9日龄时，每组免疫新城疫疫苗，于感染后7、14、21、28、35、42、56 d，每组随机抽取3羽，检测相关免疫指标。试验结果显示TPPPS和PP均能不同程度的调节感染后免疫抑制鸡免疫系统的生长发育，相比未使用免疫调节剂的免疫抑制组，TPPPS和PP均能有效提高免疫器官指数，淋巴细胞转化和细胞因子分泌，改善对特定疫苗免疫失败的状况，降低免疫器官内载毒量。其中TPPPS组免疫增强作用显著高于PP组，TPPPS和PP联合作用(TPPPS-PP)组免疫增强效果显著高于TPPPS或PP单独使用组。\n 结果表明TPPPS和PP是有效的免疫增强剂，可改善免疫抑制鸡的免疫功能，并且TPPPS和PP之间存在协同作用，增强免疫机能的作用优于TPPPS或PP单一使用组。

关键词：鸡免疫抑制疾病泰册松花粉多糖蜂胶免疫调理作用亚群白血病病毒禽网状内皮组织增生病病毒

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REV感染对SPF雏鸡免疫器官细胞凋亡及Bcl-2、C-myc基因表达的影响

REV感染对SPF雏鸡免疫器官细胞凋亡及Bcl-2、C-myc基因表达的影响

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作者：侯宁东北农业大学

学位级别：硕士

以1日龄SPF雏鸡为研究对象,应用TUNEL、HE、实时荧光定量PCR、免疫组织化学及间接ELISA等方法,通过凋亡细胞数量、细胞核浆比、Bcl-2和C-myc基因表达等相关指标动态变化的检测,较全面系统的研究了REV感染对SPF雏鸡免疫器官(胸腺、法氏... 详细信息

以1日龄SPF雏鸡为研究对象,应用TUNEL、HE、实时荧光定量PCR、免疫组织化学及间接ELISA等方法,通过凋亡细胞数量、细胞核浆比、Bcl-2和C-myc基因表达等相关指标动态变化的检测,较全面系统的研究了REV感染对SPF雏鸡免疫器官(胸腺、法氏囊和脾脏)中上述被检指标变化的影响,旨在为RE发生机制和其防治提供重要的实验参考依据。研究结果发现:(1)REV感染1日龄SPF雏鸡后,其免疫器官中凋亡细胞数量均不同程度高于对照雏鸡,且法氏囊中细胞凋亡现象最为明显。其中,REV感染后21～28 d,胸腺与法氏囊中凋亡细胞数量均明显(P<0.05或P<0.01)高于对照雏鸡。42 d时,法氏囊中凋亡细胞数量依然显著(P<0.05)高于对照雏鸡。REV感染雏鸡后,其免疫器官中细胞核浆比不同程度小于对照雏鸡。其中,法氏囊中细胞核浆比在病毒感染后21～28 d显著(P<0.05)小于对照雏鸡,而胸腺和脾脏中细胞核浆比尽管低于对照雏鸡,但未见统计学差异(P>0.05)。(2)REV感染1日龄SPF雏鸡后,其免疫器官中Bcl-2阳性细胞数量、Bcl-2 mRNA表达及其蛋白含量均不同程度的高于对照雏鸡。其中,病毒感染后21 d,胸腺与法氏囊中Bcl-2阳性细胞数量显著(P<0.05)高于对照雏鸡,28 d时,胸腺和脾脏中Bcl-2阳性细胞数量与对照雏鸡相比明显增多(P<0.05),而法氏囊中Bcl-2阳性细胞数量极显著(P<0.01)高于对照雏鸡;胸腺、法氏囊和脾脏中Bcl-2 mRNA表达及其蛋白含量在病毒感染后21～28 d均明显(P<0.05或P<0.01)高于对照雏鸡。(3)REV感染1日龄SPF雏鸡后,其免疫器官中C-myc阳性细胞数量、C-myc mRNA表达及其蛋白含量均不同程度高于对照雏鸡。其中,胸腺、法氏囊中C-myc阳性细胞数量分别于病毒感染后21 d、21～28 d显著(P<0.05)高于对照雏鸡;胸腺中C-myc蛋白含量,在病毒感染后21～28 d显著(P<0.05)高于对照雏鸡,脾脏中C-myc蛋白含量在病毒感染后28d显著(P<0.05)高于对照雏鸡,法氏囊中C-myc蛋白含量不仅在病毒感染后21～28 d极显著(P<0.01)高于对照雏鸡,42 d时依然显著(P<0.05)高于对照雏鸡;上述3种免疫器官中C-myc mRNA表达量分别于病毒感染后21～28 d、28 d显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照雏鸡。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 SPF雏鸡细胞凋亡 Bcl-2 C-myc

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禽肿瘤病混感病例中REV基因序列分析及LTR重组MDV的鉴定

禽肿瘤病混感病例中REV基因序列分析及LTR重组MDV的鉴定

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作者：包珂岩中国农业科学院

学位级别：硕士

鸡马立克氏病(MD)是由鸡马立克氏病病毒(MDV)引起的一种鸡的传染性、肿瘤性疾病,可导致其主要宿主鸡的免疫抑制和以淋巴细胞增生为特征的肿瘤发生,直至死亡。禽网状内皮组织增生病(RE)是另一种致瘤性的疾病,其病原为禽网状内皮组织增生... 详细信息

鸡马立克氏病(MD)是由鸡马立克氏病病毒(MDV)引起的一种鸡的传染性、肿瘤性疾病,可导致其主要宿主鸡的免疫抑制和以淋巴细胞增生为特征的肿瘤发生,直至死亡。禽网状内皮组织增生病(RE)是另一种致瘤性的疾病,其病原为禽网状内皮组织增生症病毒(REV),能引起鸡、火鸡、鸭和其他禽类的慢性肿瘤、矮小综合征及免疫器官萎缩等临床症状。近些年来,我国MDV和REV混合感染的病例逐渐增加,二者混合感染导致宿主更早的发病,临床症状更加严重。此外,污染REV的MD疫苗也是RE流行的一个重要来源。这些问题增加了MD和RE的防控难度。疱疹病毒MDV与逆转录病毒REV在体内和体外混合感染,会发生REV基因组,尤其是它的LTR序列片段在MDV基因组的整合。LTR具有启动子和增强子的活性,可调控MDV某些的基因表达,导致MDV的致病性和水平传播能力等生物学特性的改变,对MDV的演化具有重要意义。本研究从山东省和辽宁省2个发生肿瘤病的养鸡场采集病料,经琼脂扩散试验和PCR检测证实2个鸡群发生的均为MD。进一步的检测显示,2个鸡群存在REV的混合感染。为了进一步研究混感病料中REV的分子特征,我们在DF-1细胞上进行了REV的病毒分离,获得了2株REV病毒株。获得的毒株利用PCR、间接免疫荧光(IFA)和电镜观察等方法进行了鉴定。分离到的2株REV分别命名为CY1111株和SY1209株。在此基础上,对CY1111株和SY1209株进行了前病毒基因组测序,并与其他已发表的REV分离株进行序列比对和遗传进化分析。根据基因组不同区域的序列构建了LTR、gag基因、pol基因、env基因和全基因的遗传进化树。遗传进化树分析显示:我们获得的2株REV分离株和其他中国分离株,除GD1210株外,均位于同一个进化分枝,表明我国REV分离株之间具有较高的遗传进化相关性。值得注意的是,我们分离的REV CY1111株和SY1209株,与来源于MD商品疫苗中的MD-2毒株之间序列相似性达到99.8%,遗传进化分析也显示它们位于同一个分枝,推测两个鸡场中的REV可能来源于疫苗污染,这提示我们应加强对MD疫苗的质量控制。此外,进化分析的结果现实REV分离株并没有表现出宿主或地域的特异性,在自然条件下,REV可能能够自由地在不同宿主以及不同地域之间传播。为了研究REV在MDV基因组中整合的发生,我们采用一种检测REV LTR在MDV基因组中整合的HS-cPCR(Hot Spot Combined PCR)方法,用于检测REV LTR在MDV中重组的热点位置。应用该方法对REV和MDV在体内和体外混合感染过程中的病毒之间的插入重组进行了检测。MDV LCY-BAC株为本实验室在混感REV的MDV野毒株分离过程中获得的毒株,该毒株经细菌人工染色体技术(BAC)进行了病毒纯化。对其检测发现,MDV LCY-BAC株基因组中存在两个REV的完整LTR序列插入,插入位置分别在基因组的短独特区(Us)两侧与内部短重复区(IRs)和末端短重复区(TRs)交接处,而且这两个LTR的插入方向相同,均为反向插入到MDV基因组。为研究这种重组病毒的遗传稳定性,将LCY-BAC株体外传至15代,对第2、5、8、12和15代分别进行了检测,结果发现LTR插入的位置、方向和拷贝数均没有发生变化,证明具有这种REV LTR插入的重组MDV毒株能够在体外稳定遗传,对研究MDV和REV之间的重组具有重要意义。通过HS-cPCR检测来自8个不同鸡群的确诊为MDV和REV混合感染的病鸡样品,并没有发现有LTR重组的现象,说明自然发生LTR重组MDV的几率可能较低。本研究对混合感染病料中的REV进行了病毒分离、鉴定和遗传进化分析,发现我国REV毒株遗传进化关系接近,并且推测疫苗污染是REV的一种可能的来源。REV重组MDV的分析研究发现了REV LTR一种新的重组插入方式和插入位置,并且这种新的重组病毒在体外具有良好的遗传稳定性;对一定数量的自然混感病例的检测未发现自然重组的野毒株。本研究为两种主要禽肿瘤病原的重组、演化以及它们的防控提供了一些重要的研究数据和理论依据。

关键词：鸡马立克氏病病毒禽网状内皮组织增生病病毒混合感染重组

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REV感染SPF雏鸡通过线粒体凋亡通路诱导法氏囊细胞凋亡的作用及机制

REV感染SPF雏鸡通过线粒体凋亡通路诱导法氏囊细胞凋亡的作用及机...

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作者：顾先哲东北农业大学

学位级别：硕士

随着家禽养殖业的不断发展和壮大,对家禽传染性疾病的防治越来越受到人们的重视。禽网状内皮组织增生病病毒(REV)目前依然缺乏行之有效的商业化疫苗,感染该病毒后会导致家禽的免疫抑制,并与其他病原一起造成混合感染,严重影响了家禽养... 详细信息

随着家禽养殖业的不断发展和壮大,对家禽传染性疾病的防治越来越受到人们的重视。禽网状内皮组织增生病病毒(REV)目前依然缺乏行之有效的商业化疫苗,感染该病毒后会导致家禽的免疫抑制,并与其他病原一起造成混合感染,严重影响了家禽养殖业的健康发展。本次研究中,以1日龄SPF雏鸡做为试验动物,将雏鸡随机分为两组,分别是禽网状内皮组织感染组(I组)和病毒感染阴性对照组(C组)。应用western blot、化学荧光检测、酶活性检测等方法,并结合组织病理学和超微病理学检测技术,通过探究提取的纯化线粒体膜电位及其通透性,检测细胞凋亡相关因子活性和蛋白含量,观察法氏囊病理变化。通过上述检测,系统性地对SPF雏鸡感染禽网状内皮组织增生病病毒后,其法氏囊细胞的上述各项相关被检指标进行检测或观测,主要结果如下:(1)REV感染SPF雏鸡后14-21天和第35天,其法氏囊细胞线粒体膜电位极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)低于对照组;而线粒体膜通透性在病毒感染后14-28天极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)高于对照组;法氏囊细胞胞Cyt-C蛋白含量在病毒感染后21-35天均极显著(P<0.01)高于对照雏鸡。表明REV感染SPF雏鸡法氏囊细胞胞浆中Cyt-C蛋白含量增加与线粒体膜电位降低及其通透性增高密切相关。(2)REV感染SPF雏鸡后第21天和35天,其法氏囊细胞中Caspase-3酶活性极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)高于对照组;尽管REV感染雏鸡的Caspase-9酶活性于病毒感染后的7-35天病毒均高于对照组雏鸡,但数据未得到统计学支持(P>0.05)。表明Caspase-3参与了禽网状内皮组织感染感染所致的雏鸡法氏囊细胞凋亡。(3)SPF雏鸡受到REV感染后,感染雏鸡的法氏囊细胞中Bcl-2蛋白含量在病毒感染后14-35天明显(P<0.05或P<0.01)高于对照雏鸡,而Bax蛋白含量以及Bax/Bcl-2值于病毒感染后14-35天明显(P<0.05或P<0.01)高于对照雏鸡;BID蛋白的含量在SPF雏鸡被REV病毒感染后的第7天以及第35天相比照组雏鸡极显著(P<0.01)增高;tBID蛋白质含量和tBID/BID值在病毒感染后7-35天均极显著(P<0.01)高于对照雏鸡;对照组雏鸡的Fas蛋白含量在REV感染后第7天和21-35天明显(P<0.05或P<0.01)低于感染组雏鸡;Fas L蛋白含量在感染病毒后7-35天均极显著(P<0.01)高于对照雏鸡。表明上述被检生物活性因子的病理性改变与REV感染所致SPF雏鸡法氏囊细胞凋亡密切相关。(4)REV感染SPF雏鸡法氏囊淋巴细胞变性、凋亡样死亡,数量明显减少;纤维结缔组织明显增加;法氏囊超微结构观察发现,组织细胞中出现凋亡小体;部分细胞线粒体肿胀、破裂,细胞核染色质边集。表明REV感染导致的SPF雏鸡法氏囊组织结构损伤、淋巴细胞数量显著减少主要由细胞凋亡而引起。(5)REV感染SPF雏鸡后7-35天,禽网状内皮组织感染雏鸡的体重虽然都低于对照组雏鸡,但未找到统计学意义(P>0.05);法氏囊器官指数在病毒感染后的第14-28天显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)低于对照组雏鸡。表明REV感染导致SPF雏鸡法氏囊发生萎缩。综上研究结果可知,REV感染SPF雏鸡后,可导致其法氏囊细胞在线粒体途径上发生凋亡,本研究为深入阐明禽网状内皮组织增生病病毒的致病机制以及探究病毒感染如何引发雏鸡免疫抑制提供新的思路。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 SPF雏鸡法氏囊线粒体凋亡通路

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