检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：庄金秋毕研丽梅建国王金良苗立中沈志强山东省滨州畜牧兽医研究院山东绿都生物科技有限公司

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒,根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计合成了1对特异性引物,其扩增产物长度为314bp,建立了PCR法,其特异性和敏感性较好。经与间接免... 详细信息

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒,根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计合成了1对特异性引物,其扩增产物长度为314bp,建立了PCR法,其特异性和敏感性较好。经与间接免疫荧光法进行同步比较试验,发现结果吻合性较高,而且PCR法的结果更为直观,易于判断,样品保存方便,重检也方便,当日即可完成,显示出了较好的可行性。

关键词：禽网状内皮组织增生症病毒 PCR 检测

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禽网状内皮组织增生症病毒感染肉鸡中鸡白细胞介素18的定量检测

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畜牧兽医学报 2011年第7期42卷 963-966页

作者：孔斌陈雪锋唐德宏胡敬东山东农业大学动物医学院山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室泰安271018 泰安市动物疫病预防控制中心泰安271000

建立并利用鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)荧光定量RT-PCR方法,对禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)感染肉鸡后主要免疫器官的IL-18mRNA转录水平进行了初步研究。结果表明,与对照组相比,处... 详细信息

建立并利用鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)荧光定量RT-PCR方法,对禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)感染肉鸡后主要免疫器官的IL-18mRNA转录水平进行了初步研究。结果表明,与对照组相比,处理组脾脏、胸腺和法氏囊中IL-18的分泌水平在感染后7和14d均显著升高(P<0.05),在感染21、28、35和42d表达差异均有显著变化(P<0.05)。本研究为探讨REV感染的免疫抑制机理奠定了一定基础。

关键词：肉鸡禽网状内皮组织增生症病毒白细胞介素18 荧光定量RT-PCR

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2020-2021年市售马立克病疫苗的效价测定及质量评估

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河南农业科学 2022年第6期51卷 134-143页

作者：郑鹿平滕蔓刘金玲罗琴楚钰淑王伟东张文凯罗俊河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/农业农村部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南省农业科学院中英禽病国际研究中心河南郑州450002 河南牧业经济学院动物医药学院河南郑州450046 郑州大学公共卫生学院河南郑州450001 河南科技大学动物科技学院河南洛阳471003

为了解和评估现有鸡马立克病(MD)疫苗的质量,采用间接免疫荧光试验(IFA)对2020—2021年市场销售的9家不同企业生产的11个批次MD疫苗产品进行病毒效价测定和对比分析,同时用ELISA试剂盒、胶体金试纸条或RT-PCR方法分别对禽白血病病毒(ALV... 详细信息

为了解和评估现有鸡马立克病(MD)疫苗的质量,采用间接免疫荧光试验(IFA)对2020—2021年市场销售的9家不同企业生产的11个批次MD疫苗产品进行病毒效价测定和对比分析,同时用ELISA试剂盒、胶体金试纸条或RT-PCR方法分别对禽白血病病毒(ALV)和禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的污染状况进行检测。结果表明,在所检测的MD液氮苗中,3批进口或国产的CVI988单价液氮苗之间病毒效价无显著差异,2批不同品牌814单价液氮苗效价差异显著(P<0.05),2批不同品牌双价液氮苗(CVI988+HVT或814+HVT)病毒效价差异极显著(P<0.01),但上述全部类型液氮苗产品的病毒效价均大于5 500 PFU/羽份,达到国标规定值2倍以上。然而,4批不同品牌HVT冻干苗的病毒效价均远低于产品说明书标注的2 000 PFU/羽份,仅为83.90~109.50 PFU/羽份。全部MD疫苗产品的ALV和REV检测结果均为阴性,表明这些产品洁净无污染。

关键词：马立克病疫苗效价测定间接免疫荧光试验禽白血病病毒禽网状内皮组织增生症病毒

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禽网状内皮组织增生症病毒感染对肉鸡主要免疫器官白细胞介素18产生的影响

禽网状内皮组织增生症病毒感染对肉鸡主要免疫器官白细胞介素18产...

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作者：孔斌山东农业大学

学位级别：硕士

白细胞介素18(interleukin-18, IL-18),又称为γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)诱生因子(interferon-gamma-inducing factor, IGIF),是一种具有多向和多层次免疫调节功能的细胞因子,与肿瘤、变态反应性疾病、自身免疫性疾病、移植物抗... 详细信息

白细胞介素18(interleukin-18, IL-18),又称为γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)诱生因子(interferon-gamma-inducing factor, IGIF),是一种具有多向和多层次免疫调节功能的细胞因子,与肿瘤、变态反应性疾病、自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等的发生发展密切相关,因此它在许多疾病的基础性研究和临床应用中有重要价值。目前,免疫抑制病给我国集约化养鸡业带来了很大危害,禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus, REV)感染后可导致体液和细胞介导免疫应答的严重抑制已有很多报道,了解免疫抑制机理并制定提高鸡的免疫应答策略正成为当前的研究热点。本研究以禽网状内皮组织增生症病毒造成的免疫抑制为模型,对鸡白细胞介素18在免疫抑制中可能发挥的作用进行了初步探讨。研究内容主要分为两部分: 1.成功建立了一种能够检测鸡白细胞介素18的SYBR GreenΙ荧光定量RT-PCR方法。根据GenBank上鸡白细胞介素18基因的序列,在保守区设计并合成各自特异引物,并以核糖体蛋白亚基4基因为内参,采用SYBR GreenⅠ染料以建立实时荧光定量RT-PCR检测方法。将白细胞介素18与核糖体蛋白亚基4基因克隆至pMD18-T载体上,以各阳性质粒作为标准品,构建标准曲线,并进行了熔解曲线分析。结果表明,该方法对鸡白细胞介素18 mRNA的扩增效率为107.16%,线性范围为10-2～10-6,相关系数为0.998,最低能检出100拷贝/μL;熔解曲线分析荧光定量RT-PCR产物在(80.4±0.6)℃出现单特异峰;从RNA提取到荧光定量PCR结束的检测周期只需4 h。本研究所建立的鸡白细胞介素18基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,为在转录水平对鸡IL-18的定量分析奠定了基础。 2.实时荧光定量RT-PCR检测禽网状内皮组织增生症病毒感染肉鸡免疫器官白细胞介素18基因表达量的研究。为了研究鸡白细胞介素18基因在禽网状内皮组织增生症病毒感染肉鸡体内的表达水平,120只1日龄肉鸡随机分为2组,禽网状内皮组织增生症病毒处理组和生理盐水对照组。每个处理组分别在感染后7、14、21、28、35和42 d随机取6只鸡处死,迅速取脾脏、胸腺和法氏囊样品用于RNA提取。采用SYBR GreenⅠ染料实时荧光定量RT-PCR,比较处理组和对照组IL-18基因mRNA相对表达量的变化。结果显示,与对照组相比,处理组脾脏、胸腺和法氏囊中IL-18的分泌水平在感染后7d和14d均显著(P<0.05)升高,在21d、28d、35d和42d表达差异(P<0.05)也均显著。本实验为探讨禽网状内皮组织增生症病毒感染的免疫抑制机理打下了一定基础。

关键词：肉鸡禽网状内皮组织增生症病毒白细胞介素18 荧光定量RT-PCR

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一种检测CHV型鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其应用

一种检测CHV型鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其应用

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作者：谢青梅张新珩巫秀红封柯宇邵冠明 510642 广东省广州市五山路483

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种检测CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其应用。本发明提供的引物对可以特异性扩增CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒，与CHⅠ型、CHⅡ型、CHⅢ型、CHⅣ型、CHⅥ型和Mass型的鸡传染性... 详细信息

标准号: CN116121461A

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种检测CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其应用。本发明提供的引物对可以特异性扩增CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒，与CHⅠ型、CHⅡ型、CHⅢ型、CHⅣ型、CHⅥ型和Mass型的鸡传染性支气管炎病毒，以及鸡传染性贫血症病毒、禽白血病病毒、新城疫病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸均无交叉反应，特异性强。利用本发明提供的引物对进行RT‑RAA荧光法检测CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒时，能够在30min内完成检测，具有操作简便、成本低、灵敏度高和假阳性率低的优势。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒引物禽网状内皮组织增生症病毒禽传染性喉气管炎病毒鸡传染性贫血症病毒传染性法氏囊病毒禽白血病病毒生物检测技术特异性扩增新城疫病毒荧光法检测假阳性率交叉反应马立克氏特异性强灵敏度试剂盒种检测核酸病毒检测应用

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CD4^(+) CD25^(+)调节性T细胞与鸡REV持续性感染的相关性研究

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中国家禽 2021年第9期43卷 37-43页

作者：何书海李军郑高颖董建国杨琳黄立信阳农林学院牧医工程学院苏州药明康德新药开发有限公司测试事业部

为探讨CD4^(+) CD25^(+)调节性T细胞(Treg)在禽网状内皮组织增生症病毒(REV)垂直感染引起鸡持续性病毒血症中的作用,在鸡胚发育第7天经卵黄囊接种REV建立先天性感染动物模型,通过流式细胞术分析不同日龄REV感染鸡外周血和免疫器官中CD4+... 详细信息

为探讨CD4^(+) CD25^(+)调节性T细胞(Treg)在禽网状内皮组织增生症病毒(REV)垂直感染引起鸡持续性病毒血症中的作用,在鸡胚发育第7天经卵黄囊接种REV建立先天性感染动物模型,通过流式细胞术分析不同日龄REV感染鸡外周血和免疫器官中CD4+CD25+Treg细胞的比例及其动态变化,进一步运用绝对荧光定量技术对病毒载量进行连续监测。结果显示:与对照组相比,在7、15、30、45日龄时,感染组鸡胸腺、法氏囊、外周血以及脾脏中CD4^(+) CD25^(+)Treg细胞的比例均显著升高;血液和脾脏中的病毒载量随着日龄增长而逐渐升高,胸腺和法氏囊中的病毒载量随着日龄增长而逐渐降低;外周血和免疫器官中REV的mRNA表达水平与CD4+CD25+Treg细胞出现的频率呈正相关。研究提示:REV感染鸡体内高频出现的CD4^(+) CD25^(+)Treg细胞与REV的持续性感染存在显著的相关性。

关键词：禽网状内皮组织增生症病毒 CD4^(+)CD25^(+)调节性T细胞免疫耐受病毒血症

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REV感染对SPF雏鸡法氏囊蛋白质组学和内质网应激信号通路的影响

REV感染对SPF雏鸡法氏囊蛋白质组学和内质网应激信号通路的影响

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作者：杨达汉东北农业大学

学位级别：博士

为深入探究REV感染宿主的致病机制,填补REV感染雏鸡后法氏囊蛋白质组学和内质网应激信号通路研究的空白,进一步为REV的防治(制)奠定重要的理论基础,本研究以1日龄SPF雏鸡为研究对象,在成功建立REV感染SPF雏鸡模型的基础上,应用TMT标记... 详细信息

为深入探究REV感染宿主的致病机制,填补REV感染雏鸡后法氏囊蛋白质组学和内质网应激信号通路研究的空白,进一步为REV的防治(制)奠定重要的理论基础,本研究以1日龄SPF雏鸡为研究对象,在成功建立REV感染SPF雏鸡模型的基础上,应用TMT标记蛋白质组学技术,检测REV感染前与感染后7、14、21和28天鸡法氏囊蛋白质的变化,应用生物信息学方法对蛋白质组学得到的差异表达蛋白进行GO二级注释分类、KEGG通路、蛋白结构域富集分析以及模式表达聚类分析;同时,通过ELISA和RT-q PCR双重方法检测了REV感染SPF雏鸡后7、14、21和28天,其法氏囊内质网应激信号通路相关分子,以及内质网应激所诱导的细胞凋亡相关分子;应用传统组织病理方法和电子显微镜技术,观察REV感染SPF雏鸡后,其法氏囊组织形态和超微结构的病理变化;主要研究结果如下:一、REV感染SPF雏鸡疾病模型的建立本研究经向1日龄SPF雏鸡通过腹腔注射法感染RE病毒液,应用PCR方法检测了病毒感染雏鸡法氏囊中REV保守片段LTR,结果表明,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,在紫外灯下可观察到病毒感染雏鸡的电泳泳道中出现275bp的特异性产物,而对照雏鸡的相应泳道中未见特异性条带,表明成功建立了REV感染SPF雏鸡的疾病模型。为该项目的后续深入研究奠定了基础。二、REV感染对SPF雏鸡法氏囊蛋白质组学的影响(1)REV感染SPF雏鸡法氏囊差异表达蛋白分析通过质谱分析,与对照组相比,在REV感染SPF雏鸡后第7天,总计鉴定出1127个差异表达蛋白,其中有300个上调蛋白,827个下调蛋白;在REV感染SPF雏鸡后第14天,共计鉴定出999个差异表达蛋白,其中上调蛋白为265个,下调蛋白为734个;在REV感染SPF雏鸡后第21天,共计鉴定出910个差异表达蛋白,其中有231个上调蛋白,679个下调蛋白;在REV感染SPF雏鸡后第28天,共计鉴定出1138个差异表达蛋白,有338个上调蛋白,800个下调蛋白。(2)REV感染SPF雏鸡法氏囊差异表达蛋白功能富集分析富集分析结果显示,与对照组相比,REV感染SPF雏鸡后第7天,在生物进程中,差异表达蛋白主要富集在核苷酸代谢、跨膜转运调节、中性粒细胞活化和中性粒细胞介导的免疫等。在细胞成分中,差异表达蛋白主要富集在膜蛋白复合物、线粒体膜、细胞器内膜以及呼吸链复合物等。在分子功能中,差异表达蛋白主要富集在核苷酸结合、氧化还原酶活性、NADH脱氢酶活性等。REV感染SPF雏鸡后第14天,在生物进程中,差异表达蛋白主要富集在核苷酸代谢、核苷酸生物合成过程、对病原的防御过程、中性粒细胞活化和中性粒细胞介导的免疫等。在细胞成分中,差异表达蛋白主要集中在细胞器包膜、膜蛋白复合物、线粒体膜、囊泡腔、呼吸链复合物和伴侣蛋白等。在分子功能中,差异表达蛋白主要富集在核苷酸结合、氧化还原酶活性等。REV感染SPF雏鸡后第21天,在生物进程中,差异表达蛋白主要富集在核苷酸代谢、离子转运和B细胞介导的免疫等。在细胞成分中,差异表达蛋白主要富集在线粒体包膜、分泌囊泡、膜蛋白复合物、呼吸链复合物和蛋白酶体调节颗粒等。在分子功能中,差异表达蛋白主要富集在核苷酸结合、脂质结合、氧化还原酶活性和伴侣蛋白等。REV感染SPF雏鸡后第28天,在生物进程中,差异表达蛋白主要富集在核苷酸代谢、离子转运、中性粒细胞活化、肌动蛋白骨架调节和免疫球蛋白介导的免疫反应等。在细胞成分中,差异表达蛋白主要富集在分泌囊泡、细胞连接、膜蛋白复合物、超分子聚合物以及呼吸链复合物等。在分子功能中,差异表达蛋白主要富集在蛋白复合物结合、磷脂结合、氧化还原酶活性、G蛋白复合物结合和质子跨膜转运蛋白活性等。(3)REV感染SPF雏鸡法氏囊差异蛋白表达模式聚类分析模式表达聚类分析结果显示,在第1聚类中,亚细胞成分迁移、肌动蛋白细胞骨架组织、超分子复合物、细胞骨架、结构分子活性在内的生物过程和分子功能以及免疫球蛋白I结构域聚类的差异表达蛋白,在REV感染SPF雏鸡后第7天呈现出明显的表达量降低,并在7-28天呈现一个平稳的变化趋势。在第2聚类中,产生Ig A的肠道免疫网络、钙信号通路、NF-κB等免疫相关信号通路以及淋巴细胞介导的免疫等生物进程中的差异表达蛋白,在REV感染SPF雏鸡后呈现出表达量增加的变化。在第3聚类中,细胞内蛋白质转运、线粒体膜等生物进程以及G蛋白偶联受体结合、GTP酶活性等分子功能中的差异表达蛋白,在REV感染SPF雏鸡后7天内出现明显的表达量下降,但在7-21天呈现平稳上升。在第4聚类中,相关的生物进程和蛋白结构域表现在蛋白质消化和吸收、内质网、球蛋白等,差异表达蛋白的表达量,在REV感染SPF雏鸡后21天内表现为先剧烈降低再缓慢升高的变化。在第5聚类中,抗原处理和呈递、适应

关键词：禽网状内皮组织增生症病毒法氏囊蛋白质组学内质网应激未折叠蛋白反应

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禽网状内皮组织增生症病毒p30蛋白的表达及检测

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中国动物传染病学报 2011年第6期19卷 15-19页

作者：张石磊于圣青陈鸿军丁铲中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

根据禽网状内皮组织增生症病毒SNV株的前病毒基因组cDNA序列设计并合成1对引物,以pPB101质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒p30基因片段。将PCR产物克隆入表达载体pCold-HF中,构建的原核表达质粒pCold-p30转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导,p3... 详细信息

根据禽网状内皮组织增生症病毒SNV株的前病毒基因组cDNA序列设计并合成1对引物,以pPB101质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒p30基因片段。将PCR产物克隆入表达载体pCold-HF中,构建的原核表达质粒pCold-p30转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导,p30蛋白呈现可溶性表达。用表达产物免疫6周龄BALB/c小鼠,制备p30抗体,经Westernblot和间接免疫荧光法检测,结果发现,原核表达的SNV株p30蛋白具有良好的免疫原性。

关键词：禽网状内皮组织增生症病毒 p30 原核表达

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REV感染对HD11细胞极化和TLR3表达的影响

REV感染对HD11细胞极化和TLR3表达的影响

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作者：崔新华东北农业大学

学位级别：硕士

禽网状内皮组织增生症(reticuloendotheliosis,RE)是由禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheiosis virus,REV)引起的禽类动物的一种病毒性、免疫抑制性肿瘤病,是严重影响养禽业发展的重要疫病。TLRs激动剂是一种强有力的免疫佐剂... 详细信息

禽网状内皮组织增生症(reticuloendotheliosis,RE)是由禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheiosis virus,REV)引起的禽类动物的一种病毒性、免疫抑制性肿瘤病,是严重影响养禽业发展的重要疫病。TLRs激动剂是一种强有力的免疫佐剂。为了探索REV感染巨噬细胞后巨噬细胞极化表型的表达情况以及TLRs在此过程中所起的作用,本研究从REV与免疫细胞的相互作用入手,选取HD11鸡巨噬细胞系为研究对象,将其分为REV感染组(简称REV组)、未感染REV的对照组(简称C组)、Poly(I:C)(HMW)刺激组[简称Poly(I:C)组]和Poly(I:C)(HMW)预处理后再感染REV组[简称Poly(I:C)+REV组]四组,应用细胞培养技术和实时荧光定量聚合酶链式反应法、间接酶联免疫吸附方法、蛋白质印迹法、CCK-8法及Griess法等,检测其在RE病毒作用后6、12、24、48和72 h各被检时间点HD11细胞中病毒载量、细胞活力的变化,并在基因和蛋白水平上,分别检测巨噬细胞极化标志基因M1(i NOS)、M2(IL-10)和先天免疫Toll样受体TLR3和TLR7以及抗病毒因子IFN-β的变化。主要研究结果如下:(1)对0、30、50、100 ng/m L Poly(I:C)(HMW)刺激HD11细胞后6 h,采用CCK-8法检测HD11细胞在刺激后6、12、24、48和72 h于450 nm处吸光值,结果发现,在12-72h,与0 ng/m L比较,Poly(I:C)(HMW)浓度为100 ng/m L时,对HD11细胞450 nm处吸光值极显著(P<0.001)降低,而Poly(I:C)(HMW)浓度为50 ng/m L时对HD11细胞450 nm处吸光值无显著性(P>0.05)差异。表明,Poly(I:C)(HMW)浓度为50 ng/ml时对HD11细胞450 nm处吸光值影响较小,故以50 ng/ml浓度的Poly(I:C)(HMW)作为本研究中Poly(I:C)(HMW)最佳刺激浓度。(2)经CCK-8法分别检测了REV组、C组、Poly(I:C)组和Poly(I:C)+REV组四组HD11细胞的细胞活力,结果发现,REV组、Poly(I:C)组和Poly(I:C)+REV组三组细胞活力在6-72 h不同程度低于C组,其中,REV组细胞活力在6 h、48 h和72 h极显著(P<0.01或P<0.001)低于C组,表明,REV抑制HD11细胞活性。(3)REV感染HD11细胞后的各被检时间点均检测到了该病毒,表明REV在HD11细胞中复制增殖;并且在REV感染后24-48 h,病毒载量显著(P<0.05)升高,并于病毒感染后48 h达到峰值;TLR3激动剂Poly(I:C)(HMW)预刺激后再感染REV,结果发现,HD11细胞中病毒载量明显降低,并维持在相对较低水平;C组和Poly(I:C)组中均未检测到REV。表明,REV在HD11细胞中复制,而TLR3激动剂Poly(I:C)(HMW)对REV复制具有一定的抑制作用。(4)通过对REV组、C组、Poly(I:C)组和Poly(I:C)+REV组四组HD11细胞极化标志因子i NOS、IL-10定量检测,结果发现:1)REV组的HD11细胞,其IL-10 m RNA表达量在所有被检时间点均高于C组,并且于24 h达到峰值,表明REV感染HD11细胞后,巨噬细胞趋向于M2型极化现象;Poly(I:C)+REV组的HD11细胞,其IL-10 m RNA表达量与C组相比,呈现先下降后上升趋势,在12 h IL-10 m RNA表达量显著(P<0.05)低于C组;与REV组相比较,Poly(I:C)+REV组的HD11细胞,在12、24和48 h时IL-10 m RNA表达量均呈现显著(P<0.05)或极显著(P<0.0001)降低,且Poly(I:C)+REV组的HD11细胞培养上清液中IL-10蛋白含量分别在24和48 h极显著(P<0.01)低于和显著(P<0.05)高于C组;以上结果显示,REV感染Poly(I:C)预刺激HD11细胞后明显降低了巨噬细胞趋向于M2型极化水平。2)REV组HD11细胞i NOS m RNA表达量在24和48 h差异极显著(P<0.01)高于C组;Poly(I:C)组i NOS m RNA表达量在所有被检时间点均高于C组,在48 h达到峰值,并差异极显著(P<0.01或P<0.001),其余被检时间点差异不显著(P>0.05);Poly(I:C)+REV组i NOS m RNA表达量与REV组相比,6-24h呈现上升趋势,并在24 h达到峰值,且差异极显著(P<0.0001);以上结果表明,P

关键词：禽网状内皮组织增生症病毒 HD11细胞 Toll样受体3 巨噬细胞极化

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J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒单克隆抗体的研制

J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒单克隆抗体的研制

引用

作者：王峰山东农业大学

学位级别：硕士

禽白血病和网状内皮组织增生症均可引起禽类肿瘤和免疫抑制性疾病。这两种禽肿瘤病都可导致不同程度的二重感染、多重感染及继发感染,减弱鸡群对各种疫苗的应答能力,加剧某些疾病的临床表现。目前,对禽白血病和禽网状内皮组织增生症尚... 详细信息

禽白血病和网状内皮组织增生症均可引起禽类肿瘤和免疫抑制性疾病。这两种禽肿瘤病都可导致不同程度的二重感染、多重感染及继发感染,减弱鸡群对各种疫苗的应答能力,加剧某些疾病的临床表现。目前,对禽白血病和禽网状内皮组织增生症尚无有效的药物治疗,也没有疫苗可以进行预防,世界各国主要通过抗原/抗体检测,淘汰阳性鸡,净化种群等防制措施来控制这两种禽肿瘤病。 ALV-J gp85基因编码的表面蛋白(SU)是病毒囊膜蛋白的重要组成成分,有许多病毒抗原位点,也是亚群区分的主要蛋白,是检测亚群特异性抗体的首选抗原。REV env基因编码SU和跨膜蛋白(TM)。本课题分别以ALV-J中国株WS0705和REV原型株SNV株为标准株,选取了1200bp相对保守的env基因序列,包涵该段基因表达REV病毒90%以上的抗原位点,既保证了基因的保守性又保留了良好的抗原性。本将含有ALV-J gp85基因重组质粒pProExHTB-gp85转化入BL21宿主菌,将含有REV env基因的重组质粒pET-28a-env转化入BL21(DE3)宿主菌,分别优化诱导表达条件,诱导表达产物经SDS-PAGE电泳,分别在在35KD处和45KD处出现目的蛋白。采用尿素法纯化大量表达的蛋白包涵体,通过透析法恢复蛋白的天然构象和蛋白活性。测定纯化蛋白浓度后进行ELISA和Western-blot检测,结果显示ELISA检测灵敏性能达到100ng/mL,表达的两种蛋白都具有良好的灵敏性和特异性。以纯化的His-gp85蛋白和His-env蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,免疫剂量为300μg/只,免疫3次采后通过ELISA和IFA试验测定了所获得的多抗效价,ELISA测得效价分别达到1:100万和1:200万,IFA测得效价分别高于1:3200和1:12800。以纯化的His-gp85蛋白和His-env蛋白为抗原免疫6周龄的Balb/c纯系小鼠,40μg/只,免疫3次,采血,建立间接ELISA方法和IFA法测定血清抗体效价。取血清效价高的Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG1500的作用下进行细胞融合。用HAT选择培养基对杂交瘤细胞进行培养,当杂交瘤细胞集落布满孔底1/4 - 1/2时,取细胞上清作抗体效价检测。采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆,重复3次以上,直到取得能稳定分泌抗体的单克隆细胞株。得到抗ALV-J病毒单克隆细胞两株分别命名为1D3和3B1,ELISA检测细胞上清抗体效价均为1:1024;得到抗REV病毒单克隆细胞株一株命名为4D5,ELISA检测细胞上清效价为1:2048,并进行腹水制备,并通过ELISA和IFA试验测定了所获得的单抗腹水的效价,ELISA效价为1:40万,IFA效价为1:6400;腹水又经SDS-PAGE、Western-blot等法的综合检测表明所得单抗具有良好的特异性。本研究的完成为制备ALV-J和REV抗体/抗原ELISA检测试剂盒的国产化奠定了基础;为快速、准确诊断两种禽肿瘤病、保障我国禽业的健康持续发展提供技术支持。

关键词：禽白血病病毒J亚群禽网状内皮组织增生症病毒原核表达蛋白纯化多克隆抗体单克隆抗体

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