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高效液相色谱-串联质谱法结合稳定同位素标记肽段同时测定稻米及其制品中3种过敏蛋白质

色谱 2021年第12期39卷 1314-1323页

作者：杨欢曹赵云马有宁陈铭学农业农村部稻米及制品监督检验测试中心中国水稻研究所浙江杭州310006 江西农业大学江西南昌330000

基于稳定同位素标记特征肽段和液相色谱-质谱联用仪建立稻米及制品中3种过敏蛋白质的同时定量方法。稻米及制品样品经盐溶液提取,赖氨酰基内切酶(Lys-C)和胰蛋白酶依次水解,C18-SD柱净化后,采用纳升高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道... 详细信息

基于稳定同位素标记特征肽段和液相色谱-质谱联用仪建立稻米及制品中3种过敏蛋白质的同时定量方法。稻米及制品样品经盐溶液提取,赖氨酰基内切酶(Lys-C)和胰蛋白酶依次水解,C18-SD柱净化后,采用纳升高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱(NanoLC-LTQ-Orbitrap)采集和Protein Discovery软件鉴定,NCBI和Uniprot数据库的基本局部搜索比对工具(BLAST)筛选验证,最终获得表征稻米及制品中α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂类蛋白质(seed allergenic protein RAG2,RAG2)、乙二醛酶Ⅰ活性蛋白(glyoxalaseⅠ)和α-球蛋白(19 kDa globulin)3种过敏蛋白质的特异性肽段。3个特异性肽段经液相色谱梯度洗脱,在Poroshell色谱柱上实现完全分离,由三重四极杆质谱仪分析。实验通过优化多反应监测(MRM)质谱参数,比较不同溶剂体系、水解酶种类和酶量等酶解条件,结合内标法定量,实现对稻米及制品中3种蛋白质的绝对定量。实验结果表明,当酶解溶剂中含1 g/L十二烷基硫酸钠,采用Lys-C和胰蛋白酶组合消化策略,可有效提高3种蛋白质的酶切效率至65.7%~97.3%。该方法在1~200 nmol/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.9972,3种蛋白质的检出限和定量限分别为3 mg/kg和10 mg/kg。3种蛋白质在空白稻米制品基质中3个水平下的加标回收率为80.6%~103.7%,日间和日内精密度均小于11.5%。该方法稳定性好,检测灵敏度高,操作简便,在分析各类稻米及制品中3种过敏蛋白质含量具有广泛的应用前景。

关键词：液相色谱-串联质谱特异性肽段稳定同位素标记肽段酶解条件过敏蛋白质稻米

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一种合成稳定同位素标记肽段的新方法--新方法在血浆GST家族定量分析中的应用

一种合成稳定同位素标记肽段的新方法--新方法在血浆GST家族定量...

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作者：先锋中国科学院大学

学位级别：博士

定量分析是蛋白质组学的核心技术，而绝对量测定则是定量蛋白质组分析的重要一环。基于质谱技术的绝对定量蛋白质组分析，通常采用稳定同位素标记肽段作为测量的标准物质。常用的稳定同位素标记肽段可通过化学合成或蛋白质重组表达的方... 详细信息

定量分析是蛋白质组学的核心技术，而绝对量测定则是定量蛋白质组分析的重要一环。基于质谱技术的绝对定量蛋白质组分析，通常采用稳定同位素标记肽段作为测量的标准物质。常用的稳定同位素标记肽段可通过化学合成或蛋白质重组表达的方法获得。然而，这些传统方法在精确定量、多肽段合成、生产费用方面都存在一些局限性。生产适合于绝对定量蛋白质组研究需求的稳定同位素标记肽段仍然是一个技术挑战。　　本研究首次提出并开发了一种通过体外蛋白表达系统进行稳定同位素标记肽段合成的方法。这个方法的创新点有二，其一，提出了Strep-tag标签与目标肽段的融合合成，一方面Strep-tag标签服务于融合肽段的富集，另一方面它用于目标肽段的标准定量评估;其二，采用体外蛋白表达系统(PURE)，实现从寡核苷酸引物到含有稳定同位素的氨基酸再到融合肽段的一步合成，这样既避免了多步操作带来的合成肽段损失，又可以同时进行多个肽段的生物合成。我们通过一系列的实验优化，确定了PURE系统应用于Strep-tag融合肽段合成的最适工作条件;我们考察了新方法对于合成不同长度或不同疏水性特征的肽段的偏好性，发现肽段合成效率在不同的长度或疏水性条件下确有不同，但是合成的成功率和肽段产量完全能够满足绝对定量蛋白质组测定的要求;我们系统评估了新方法合成的稳定同位素肽段在绝对定量蛋白质分析中的应用，获得了高质量的定量数据。所有的实验证据表明，通过体外合成的稳定同位素标记肽段与任何传统合成方法一样，都可以应用于蛋白质的绝对定量研究，而且新方法在肽段定量标准化、平行合成多个标记肽段、实验成本等方面具有较大的优势。　　谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)是一个蛋白质超家族，一般认为，人血浆中GSTs的种类和丰度变化可作为病理指标。虽然酶联免疫反应和酶活检测等传统方法可以检测一些GST家族成员，但它们在定量准确性和GST家族成员的全方位分析上都颇为受限。本研究中，我们提出了利用GSH磁珠材料富集血浆中的GSTs，并运用平行反应监测质谱技术(PRM)靶标性地跟踪所富集的GST肽段，然后采用我们本研究发明的稳定同位素标记肽段的合成技术，实现对人血浆中多个GST家族成员进行绝对定量。　　我们测试了不同的GSH亲和材料和不同量的材料对于GSTs的结合效率，发现了30μL的MagneGSTTM Glutathione磁珠能够最大程度地富集血浆中的GSTs（至少77条GSTs肽段）。我们评估了多个胰蛋白酶消化富集GSTs的方法，建立了压力循环技术(PCT)辅助胰蛋白酶酶切的方法，它能够显著提升GSTs被酶解的效率。我们比较了GSTs定量所需的最低血样要求，证明了100μL血浆样品就能采集足够稳定的GSTs肽段PRM信号。我们还应用合成的稳定同位素标记GSTs肽段，测定了人血浆中多个GSTs成员的绝对浓度。定量结果揭示，在41例正常人血浆中LC-MS-PRM能够检测到人血浆中16种的GSTs家族成员，其定量浓度范围分别为:GST Alpha-1(0.0024～0.2131ng/mL)，GST Alpha-2(0.0015～0.1737ng/mL),GST Alpha-3(0.0334～6.1054ng/mL),GST Alpha-4(0.0023～0.3079ng/mL),GST Alpha-5(0.0013～0.2528ng/mL),GST Kappa-1(0.0048～0.0575ng/mL),GST Mu-1(0.0026～0.5049ng/mL),GST Mu-2(0.0041～0.8179ng/mL),GST Mu-3(0.0089～0.5989ng/mL),GST Omega-2(0.0286～0.3413ng/mL),GST Pi-1(0.1851～107.2134ng/mL),GST Theta-1(0.0102～25.9956ng/mL),GST Zeta-1(0.0221～2.1949ng/mL),Microsomal GST-1(0.002～0.0333ng/mL),Microsomal GST-2(0.0934～3.9542ng/mL),Microsomal GST-3(0.0126～0.2760ng/mL)。我们也定量比较了24例正常人与24例肝癌病人血浆样本中GSTs蛋白的浓度，发现了8个GSTs蛋白在肝癌样本中显著不同于正常样本，其中GST Mu-5、GST Mu-3、GST Pi-1、GST Alpha-5和Microsomal GST-3在肝癌病患中显著高于正常人，而Microsomal GST-2、GST Omega-2和GST Alpha-4则在肝癌病患中呈现较低丰度。综合以上结果，我们建立了一个广谱性绝对定量血浆GSTs蛋白的分析方法。这个方法在GSTs蛋白的检测灵敏度和精确度方面都远

关键词：谷胱甘肽硫转移酶体外蛋白表达系统稳定同位素标记肽段生物合成

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酶切型稳定同位素标记肽段为内标用于药物代谢酶的绝对定量分析

引用

分析化学 2015年第10期43卷 1551-1557页

作者：刘喜东丛宇婷胡良海张养军顾景凯钱小红吉林大学生命科学学院蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心军事医学科学院放射与辐射医学研究所

利用带有酶切位点的稳定同位素标记肽段作内标,采取3种方式处理样品,考察了不同的样品处理过程对实验结果准确性的影响。首先合成不同长度的带有酶切位点的肽段,考察其酶解过程,实验结果表明,胰蛋白酶的活性位点具有一定的选择性,最终... 详细信息

利用带有酶切位点的稳定同位素标记肽段作内标,采取3种方式处理样品,考察了不同的样品处理过程对实验结果准确性的影响。首先合成不同长度的带有酶切位点的肽段,考察其酶解过程,实验结果表明,胰蛋白酶的活性位点具有一定的选择性,最终确定目标肽段两端分别加入3个氨基酸所形成的肽段为内标。分别采用在酶解前加入带酶切位点的稳定同位素标记肽段、不带酶切位点的稳定同位素标记肽段以及在酶解过程后、质谱检测前加入不带酶切位点的稳定同位素标记肽段3种方式处理样品。结果表明,采取第一种方式处理样品的测定结果更接近真实值,相对偏差范围更小,可减小蛋白质绝对定量分析的误差,提高分析结果的重现性。

关键词：稳定同位素标记肽段绝对定量酶切位点药物代谢酶

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