检索结果-内蒙古大学图书馆

胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立

吉林大学学报（医学版） 2024年第5期50卷 1322-1329页

作者：李胜男何嘉文廖科棋李友广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524002 广东医科大学附属医院神经病学研究所广东湛江524002

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限... 详细信息

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量225000附近出现特异性条带,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。

关键词：胞质分裂作用因子4 过表达慢病毒载体 Neuro-2a细胞稳定转染过表达慢病毒

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恶性疟原虫基因稳定转染方法的研究进展

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中国热带医学 2023年第2期23卷 186-190页

作者：李晓松潘茂华黄亚铭杨照青昆明医科大学病原生物学与免疫学系云南昆明650500 广西壮族自治区上林县人民医院广西南宁530599

恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的转染有助于研究其基因的功能,例如抗药性。但转基因操作一直都非常具有挑战性,主要是由于疟原虫基因组的高A/T碱基序列结构(A+T含量约为82%)以及低转染效率。基于电穿孔的恶性疟原虫转染方法已成功... 详细信息

恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的转染有助于研究其基因的功能,例如抗药性。但转基因操作一直都非常具有挑战性,主要是由于疟原虫基因组的高A/T碱基序列结构(A+T含量约为82%)以及低转染效率。基于电穿孔的恶性疟原虫转染方法已成功应用于某些基因的研究中,而预载法的电穿孔是目前将外源DNA引入恶性疟原虫的首选方法。疟原虫基因的定点编辑多采用双质粒转染的方法,通常认为对疟原虫的成功转染需要大量高纯度质粒DNA以及精确的转染体系。本文除对目前常用的电转方法进行了评价外,还介绍了一种新的转染方法,即裂解-再密封红细胞转染(lyse-reseal erythrocytes for transfection),并对质粒DNA浓度、转染试剂的使用、转染参数的设置、新鲜红细胞的添加以及转染成功的标记等因素在提高疟原虫转染成功率和效率方面的作用等进行综述,为该领域研究提供参考。

关键词：恶性疟原虫稳定转染效率质粒DNA 裂解-再密封红细胞转染

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人乳头状瘤病毒E6和E7蛋白过表达慢病毒载体构建及稳定转染喉上皮细胞系的建立

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中国耳鼻咽喉头颈外科 2022年第12期29卷 790-794页

作者：肖洋周思含牛子捷王军首都医科大学附属北京同仁医院咽喉科耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室(首都医科大学)北京100730

目的分别构建过表达人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6型和11型的E6、E7癌基因的慢病毒载体,建立HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因过表达的SNU-1076喉上皮细胞系模型。方法分别合成表达HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因的片段,构建重... 详细信息

目的分别构建过表达人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6型和11型的E6、E7癌基因的慢病毒载体,建立HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因过表达的SNU-1076喉上皮细胞系模型。方法分别合成表达HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因的片段,构建重组慢病毒载体pHBLV-CMV-h-HPV6-E6-E7-3FLAG-ZsGreen-Puro和pHBLV-CMV-h-HPV11-E6-E7-3FLAG-ZsGreen-Puro。包装慢病毒后转染进入人喉上皮细胞系SNU-1076,经嘌呤霉素抗性筛选得到阳性克隆。采用实时定量PCR法分别检测HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因过表达的水平。结果通过测序验证质粒构建的成功。实时荧光定量PCR的结果显示,转染HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因的SNU-1076细胞系相较于转染对照空载体的细胞系出现了明显的扩增曲线。其中HPV6-E6-E7的过表达效果为41692倍,HPV11-E6-E7的过表达效果为124957倍。结论利用慢病毒法成功分别建立了过表达HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7的喉上皮SNU-1076细胞系。

关键词：人乳头状瘤病毒6 人乳头状瘤病毒11 癌基因慢病毒表达载体稳定转染喉上皮细胞系

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人EGFL7真核表达载体的构建及稳定转染***926细胞系的建立

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现代医学与健康研究电子杂志 2022年第23期6卷 1-4页

作者：丁悦黄为民唐丽君南方医科大学南方医院新生儿科广东广州510515

目的建构对人类表皮生长因子样结构域7(EGFL7)基因真核表达载体以及稳定性转染***926细胞系的科学评价体系。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法获得EGFL7的开放阅读框(ORF),借助双酶切方式,使得EGFL7能够被克隆至真核表达载... 详细信息

目的建构对人类表皮生长因子样结构域7(EGFL7)基因真核表达载体以及稳定性转染***926细胞系的科学评价体系。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法获得EGFL7的开放阅读框(ORF),借助双酶切方式,使得EGFL7能够被克隆至真核表达载体(pEGFP-N1)中并获取到已经重组好的质粒pEGFP-N1-EGFL7。在进一步接受测序和鉴定处理后,借助电转仪对***926细胞进行转染,然后通过G418筛查进而建构起稳定性转染***926细胞系。使用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测EGFL7基因及蛋白在***926细胞系中的表达。结果转染EGFL7的***926细胞的EGFL7基因和蛋白水平均明显高于对照质粒转染组和空白对照组(P<0.05)。结论成功建构人EGFL7真核表达载体并鉴定了EGFL7在***926细胞系中的过表达,为探讨EGFL7对早产儿支气管肺发育不良的影响奠定基础。

关键词： EGFL7 真核表达载体稳定转染 EA.hy926细胞系

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稳定转染HSP72奶牛乳腺上皮细胞系建立与表达鉴定

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华北农学报 2018年第6期33卷 103-107页

作者：于文慧展西振丰艳妮曹荣峰姜忠玲李华涛田文儒青岛农业大学动物医学院山东青岛266109

为了构建HSP72慢病毒表达载体,建立稳定表达HSP72的牛乳腺上皮细胞系。以牛HSP72基因序列为模板,设计并合成引物,PCR扩增目的基因,连接到慢病毒表达质粒中,用包装获得的慢病毒感染牛乳腺上皮细胞,经一定浓度的嘌呤霉素筛选,Hochest3334... 详细信息

为了构建HSP72慢病毒表达载体,建立稳定表达HSP72的牛乳腺上皮细胞系。以牛HSP72基因序列为模板,设计并合成引物,PCR扩增目的基因,连接到慢病毒表达质粒中,用包装获得的慢病毒感染牛乳腺上皮细胞,经一定浓度的嘌呤霉素筛选,Hochest33342法对细胞核定位,倒置荧光显微镜下观察转染效率,用免疫组化和Western Blot方法验证感染细胞是否稳定表达HSP72。结果显示,携带HSP72基因的慢病毒滴度约为1. 0×109TU/m L;确定嘌呤霉素的最佳筛选浓度为2μg/m L;牛HSP72慢病毒感染细胞表达HSP72,感染的奶牛乳腺上皮细胞在倒置荧光显微镜下可看到绿色荧光,转染效率可达90%以上;免疫组化结果表明,正常细胞和空载体感染细胞,HSP72呈现低表达,转染携带HSP72目的基因载体细胞,HSP72高表达,呈现颜色较深的棕色; Western Blot方法检测证实与正常转染细胞相比,慢病毒空载体转染的奶牛乳腺上皮细胞HSP72表达稍有降低,但无统计学差异,而携带HSP72基因的慢病毒载体转染的细胞HSP72呈现高表达,且差异极显著(P <0. 01),与慢病毒空载体转染的奶牛乳腺上皮细胞相比,携带HSP72基因的慢病毒载体转染的细胞HSP72呈现高表达,且差异极显著(P <0. 01)。成功建立稳定表达HSP72的牛乳腺上皮细胞系,可为研究奶牛乳腺炎分子调控机制以及抗性分子药物筛选提供新的理论依据和工作基础。

关键词： HSP72 稳定转染慢病毒载体奶牛乳腺上皮细胞

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hIFN-λ基因稳定转染细胞系的建立及其体外抗HBV机制研究

hIFN-λ基因稳定转染细胞系的建立及其体外抗HBV机制研究

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第十届全国疑难及重症肝病大会

作者：李慧武汉科技大学附属天佑医院感染科

目的克隆hIFN-λ基因,建立IFN-λ基因稳定表达细胞系,并对其生物学活性进行检测,探讨hIFN-λ体外抗HBV机制。方法构建双顺反子表达载体pIRSE2-EGFP-hIFN-λ;将表达载体pIRSE2-EGFP-hIFN-λ转染BHK细胞,建立hIFN-λ稳定真核表达细胞系;... 详细信息

目的克隆hIFN-λ基因,建立IFN-λ基因稳定表达细胞系,并对其生物学活性进行检测,探讨hIFN-λ体外抗HBV机制。方法构建双顺反子表达载体pIRSE2-EGFP-hIFN-λ;将表达载体pIRSE2-EGFP-hIFN-λ转染BHK细胞,建立hIFN-λ稳定真核表达细胞系;收集稳转细胞系上清进行生物学活性检测。流式细胞术检测hIFN-λ干预HepG2215细胞1h、4h、12h、24h、48h、72h后对细胞内STAT1/STAT2磷酸化水平的影响。ELISA检测hIFN-λ干预HepG2215细胞1h、4h、12h、24h、48h、72h后其HBVDNA、HBsAg、HBeAg分泌水平的差异。RT-PCR检测hIFN-λ干预HepG2215细胞1h、4h、12h、24h、48h、72h后其PD-L1、IRF3、IRF7、IRF9、ISG15、APOBEC3G、USP18、MXA基因表达情况差异。结果成功建立具有生物学活性的hIFN-λ稳定表达细胞系;hIFN-λ干预可以有效抑制HBVDNA、HBsAg、HBeAg的表达,且其STAT1/STAT2磷酸化时间较IFN-α延长,而各效应分子的基因表达较IFN-α也存在延后。结论IFN-λ能有效抑制HBV-DNA复制和HBsAg、HBeAg分泌。IFN-λ抗HBV作用时间较IFN-α长,而PD-L1基因表达未见明显上调同时ISG15基因表达上调更为明显,这可能是hIFN-λ与IFN-α抗HBV的优势所在。

关键词： HBV 有效抑制生物学活性 HBsAg 稳定转染细胞系机制研究

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以人类HEK293细胞株苦味接受器TAS2R38及TAS2R43之稳定转染株应用于苦味化合物的分析

以人类HEK293细胞株苦味接受器TAS2R38及TAS2R43之稳定转染株应用...

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作者：马瑞珊国立屏东科技大学

学位级别：硕士

苦味接受器(TAS2R)存在于细胞的表面且可以侦测到多种不同的化合物。在人类的组织已经发现有25种不同亚型的苦味接受器，且能调节不同的生理功能，像是降血糖机制。但是苦味接受器进行异源表现时，经常无法表现于细胞膜上且表现量低，... 详细信息

苦味接受器(TAS2R)存在于细胞的表面且可以侦测到多种不同的化合物。在人类的组织已经发现有25种不同亚型的苦味接受器，且能调节不同的生理功能，像是降血糖机制。但是苦味接受器进行异源表现时，经常无法表现于细胞膜上且表现量低，所以不利于进行单一亚型的研究。本研究将Lucy-human somatostatin receptor type 3 (Lucy-hsst3) 加在苦味接受器的N端以提升苦味接受器移至细胞膜。将Lucy-hsst3-TAS2R38-GFP (绿萤光蛋白) 转染至HEK 293细胞，利用绿萤光蛋白证明重组后的TAS2R38位于细胞膜上。于是，于HEK 293细胞建立稳定表现Lucy-hsst3-TAS2R38-RFP或Lucy-hsst3-TAS2R43-RFP的转染株。利用共轭焦显微镜证实TAS2R38及TAS2R43在各自的稳定转染株是表现于细胞膜上。于是，以Gα-gustducin短暂转染这些细胞株并以TAS2R38的激活剂PTC，TAS2R43的激活剂denatonium和quinine，或益生菌Bacillus amyloliquefaciens的胞外多糖 (EPS)刺激之效果发现，TAS2R38果然不被上述试剂活化，因为所选殖者为PTC味盲者的对偶基因而TAS2R43会被它的激活剂活化但不会被EPS活化。

关键词：苦味接受器 HEK 293 稳定转染 Exopolysaccharide

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甲状旁腺素受体(PTHR)真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

甲状旁腺素受体(PTHR)真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系...

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2018年浙江省骨科学学术年会

作者：孟越庞清江刘江涛余霄陈先军杨德鸿宁波市第二医院

目的构建小鼠甲状旁腺素受体(PTHR)及其突变受体(DSEL)全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素(PTH)模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方法分别纯化目的片段... 详细信息

目的构建小鼠甲状旁腺素受体(PTHR)及其突变受体(DSEL)全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素(PTH)模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1 (+),

关键词： HEK293 真核表达载体细胞系稳定转染甲状旁腺素受体

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1、IL3-LDM靶向融合蛋白对人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的治疗作用研究 2、CD26慢病毒表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

1、IL3-LDM靶向融合蛋白对人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的治...

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作者：孔凡妮北京协和医学院

学位级别：硕士

目的:利用分离的人外周血单个核细胞建立急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型,观察小鼠的一般情况、应用流式细胞术检测外周血CD45细胞阳性率,病理学检查鉴定动物模型;利用该模型研究IL3-LDM靶向融合蛋白对白血病小鼠的治疗作用。方法:1.人... 详细信息

目的:利用分离的人外周血单个核细胞建立急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型,观察小鼠的一般情况、应用流式细胞术检测外周血CD45细胞阳性率,病理学检查鉴定动物模型;利用该模型研究IL3-LDM靶向融合蛋白对白血病小鼠的治疗作用。方法:1.人外周血单个核细胞的分离和培养,流式细胞仪检测其免疫表型,进行AML干细胞特性的鉴定;2.人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的建立:将NOD/SCID小鼠随机分为模型组和对照组,两组小鼠经全身X线照射300cGay,6-12个小时内通过尾静脉注射AML病人样本中CD123阳性率最高的人外周血单个核细胞(用台盼蓝拒染法,细胞活性95%,1X107个/只,液体总量0.2ml)到模型组小鼠,对照组小鼠通过尾静脉注射等体积PBS作为正常对照;3.急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的鉴定:观察小鼠的一般情况;流式细胞术检测小鼠外周血CD45细胞阳性率;移植60天后处死小鼠,采用组织病理检查,检测小鼠肝脏、脾脏、肺脏等的白血病特征。4.利用上述建立的模型研究IL3-LDM靶向融合蛋白对白血病小鼠的治疗作用,设置多个治疗组,并进行疗效评价。结果:1.分离并培养人外周血单个核细胞,经抗人CD34-PE、CD38-FITC、CD123-PerCPcy5.5抗体标记后,流式细胞术检测结果显示有CD34+CD38-细胞群,而且CD123+细胞占AML干细胞的比例均为90%以上。2.成功建立人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型:移植后的模型组小鼠均发生典型白血病表现,而对照组小鼠无;模型组小鼠的尾血中检测CD45+细胞,而对照组小鼠无;模型组NOD/SCID小鼠的肝、脾、肺等均有肿瘤细胞浸润,细胞呈团块状生长,包绕器官或者浸润器官内部,受浸润组织结构破坏,而对照组小鼠的相应组织未发现明显肿瘤细胞浸润。3.体内实验证明,经IL3-LDM靶向融合蛋白治疗后,白血病模型小鼠组一般情况明显好于模型组(PBS对照组),其外周血的白血病细胞含量明显下降,其肺、肾、脾等脏器的炎症及病理变化减轻。结论:采用NOD/SCID小鼠在给予全身照射的移植前预处理基础上成功建立了人急性髓系白血病的动物模型,为研究AML的可能发病机制奠定了基础。体内实验进一步证实,IL3-LDM靶向融合蛋白对白血病细胞有一定的杀伤抑制作用,IL3-LDM融合蛋白也为临床治疗AML提供了新思路。背景:CD26作为一种具有多种生物学功能的蛋白酶类,在炎性反应、组织修复、细胞移行、肿瘤侵袭、免疫调节、信号转导及细胞、凋亡等生理及病理过程中均起到重要作用。在临床中与多种肿瘤疾病存在相关性,可以作为肿瘤的预测因子或生物标志物。针对CD26的深入研究,对于揭示相关肿瘤疾病的发病机制,促进临床诊断、鉴别分析,分子靶向治疗的开展和判定疗效及预后等,均不失有潜在的重要意义,CD26也有望成为未来疾病治疗的新靶点。目的:构建人CD26慢病毒表达载体,转染NIH/3T3细胞,建立稳定转染的NIH/3T3细胞株。方法:抽提含pCDH1-MCS1-EF1-copGFP慢病毒载体的质粒和pEZ-Lv105-CD26质粒。利用XBaⅠ和BamH Ⅰ进行双酶切,用T4连接酶将胶回收的CD26目的片段克隆至载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP,构建形成pCDH-CD26质粒。转化DH5α感受态细胞,菌落PCR初步筛选出阳性克隆,并进行酶切鉴定和送测序分析。利用三质粒慢病毒系统转染293T细胞,生产慢病毒并检测获得的病毒滴度。利用所获得的慢病毒感染NIH/3T3细胞,通过FACS AriaⅢ(BD公司)流式细胞仪分选出表达CD26的阳性细胞,并进一步用FACS做分析鉴定,获得稳定转染NIH/3T3细胞株。结果:成功构建pCDH-CD26慢病毒表达载体,并包装出慢病毒,检测病毒浓缩液的滴度为3X108TU/mL。利用此病毒浓缩液成功感染NIH/3T3细胞,经过流式细胞仪的分析和分选,表达CD26的NIH/3T3细胞阳性率达到70%以上,筛选到稳定表达人CD26的NIH/3T3细胞株。结论:人CD26慢病毒表达载体成功构建和稳定转染NIH/3T3细胞株的建立,为进一步研究CD26的功能奠定了良好的实验基础。

关键词：白血病干细胞 NOD/SCID小鼠模型 AML IL3-LDM CD26 慢病毒表达载体稳定转染 NIH/3T3细胞系

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pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞系的建立及鉴定

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中国药理学通报 2016年第12期32卷 1767-1772页

作者：陈雅李静张文政罗敏傅晓钟刘亭民族药与中药开发应用教育部工程研究中心贵州贵阳550004 贵州医科大学药学院贵州贵阳550004 国家苗药工程技术研究中心贵州贵阳550004 贵州省药物制剂重点实验室贵州贵阳550004

目的高效快速地建立稳定高表达钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的HEK293细胞系。方法构建可表达EGFP-NTCP融合蛋白的p EGFP-NTCP重组质粒,并利用Fu GENE 6转染试剂将重组质粒转染至HEK... 详细信息

目的高效快速地建立稳定高表达钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的HEK293细胞系。方法构建可表达EGFP-NTCP融合蛋白的p EGFP-NTCP重组质粒,并利用Fu GENE 6转染试剂将重组质粒转染至HEK293细胞中。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,挑选转染细胞进行14 d G418筛选和单克隆培养,以获得稳定转染细胞株。用RT-PCR法、qRT-PCR法和Western blot技术检测稳定转染细胞及正常细胞中NTCP mRNA和蛋白的表达情况,并进一步用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)考察稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力。结果使用本文优化的方法,细胞转染率可达90%。RT-PCR、qRT-PCR、Western blot和牛磺酸摄取实验结果显示:相对于正常组,在荧光显微镜下呈绿色荧光的转染细胞;其NTCP表达均显阳性(P<0.01);且稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力明显升高(P<0.05)。结论高效快速地建立了稳定高表达NTCP的HEK293细胞系,为胆酸衍生物摄取机制研究奠定了基础。

关键词： NTCP EGFP 稳定转染牛磺胆酸 HEK293细胞高效快速

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